Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Фармакогенетические основы действия варфарина (обзор литературы) 11
1.1. Механизм действия и фармакокинетика варфарина 11
1.2. Лабораторные методы контроля действия варфарина, методы клинической оценки эффективности и безопасности препарата 18
1.3. Генетическая детерминированность эффективности и безопасности терапии варфарином 1.3.1. Влияние аллельных вариантов гена CYP2C9 на чувствительность к варфарину 23
1.3.2. Распространенность аллельных вариантов гена CYP2C9 в различных популяциях 28
1.3.3. Влияние аллельных вариантов гена VKORC1 на чувствительность к варфарину 29
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Клиническая характеристика обследованных лиц 36
2.2. Лабораторные методы, использованные для оценки действия варфарина 38
2.3. Специальные методы молекулярно-генетических исследований 43
2.3.1. Выделение ДНК из периферической крови пациентов 43
2.3.2. Полимеразная цепная реакция и рестрикционный анализ 44
2.3.3. Определение аллельных вариантов гена цитохрома Р450 2С9 45
2.3.4. Определение аллельных вариантов гена витамин К-эпоксид редуктазы VKORC1 48
2.4 Статистическая обработка результатов исследования 49
Глава 3. Разработка методов детекции мутаций в гене витамин К-эпоксид редуктазы VKORC1 51
3.1. Разработка метода выявления мутаций в кодирующей и регуляторной областях гена VKORC1 51
3.2. Поиск новых мутаций в кодирующей области гена VKORC1 55
Глава 4. Популяционный анализ и клиническое значение аллельных вариантов гена цитохрома Р450 2С9 60
4.1. Результаты популяционного анализа частоты аллельных вариантов гена CYP2C9 в Северо-Западном регионе Российской Федерации 60
4.2. Значение аллельных вариантов гена CYP2C9 в профилактике тромбоэмболических осложнений варфарином 63
4.2.1. Зависимость индивидуальной чувствительности к варфарину от генотипов CYP2C9 63
4.2.2. Алгоритм дозирования варфарина у пациентов с различной чувствительностью к препарату 69
Глава 5. Популяционный анализ и клиническое значение аллельных вариантов гена витамин К-эпоксид редуктазы VKORC1 83
5.1. Результаты популяционного анализа частоты мутаций в гене VKORC1 в Северо-Западном регионе Российской Федерации 83
5.2. Значение мутаций в регуляторной области гена VKORC1 в профилактике тромбоэмболических осложнений варфарином 88
5.2.1. Мутация СІ 173Т в интроне 1 гена VKORC1 88
5.2.2. Мутация G3730A в З -нетранслируемой области гена VKORC1 97
Глава 6. Обсуждение результатов 107
Заключение 123
Выводы 125
Практические рекомендации 126
Список литературы 127
- Механизм действия и фармакокинетика варфарина
- Разработка метода выявления мутаций в кодирующей и регуляторной областях гена VKORC1
- Алгоритм дозирования варфарина у пациентов с различной чувствительностью к препарату
- Мутация G3730A в З -нетранслируемой области гена VKORC1
Механизм действия и фармакокинетика варфарина
Риск повышенного тромбообразования сопровождает многие клинические ситуации в хирургии, акушерстве и гинекологии, клинике внутренних болезней, неврологии. Это заставляет врачей различных специальностей прибегать к первичной и вторичной фармакологической профилактике тромбозов и тромбоэмболии, в том числе с помощью антикоагулянтов непрямого действия (АНД).
К АНД относятся препараты, которые, не вмешиваясь самостоятельно и непосредственно в процесс тромбообразования, влияют на него через синтез активных факторов свертывания. АНД называют также оральными антикоагулянтами. По механизму действия АНД являются антагонистами витамина К, "антивитаминами К" (Suttie J.W., 1987; Бокарев И.Н., Козлова Т.В., 2000; Вавилова Т.В., 2002).
Основное назначение витамина К состоит в переносе электронов при осуществлении окислительно-восстановительных реакций. У растений это реакции фотосинтеза, у человека — различные метаболические процессы (Филиппович Ю.Б., 1993; Sadler J.E., 2004).
Витамин К поступает в организм с пищей (зеленые части растений, печень животных), а также образуется эндогенно за счет бактериального синтеза в кишечнике. Это жирорастворимое соединение, и его содержание в организме зависит от активности липаз поджелудочной железы, количества желчи, всасывающей способности кишечника и степени утилизации витамина К гепатоцитами. Дефицит витамина К возникает при несбалансированном питании, панкреатической недостаточности, механической желтухе, нарушении всасывания (синдром мальабсорбции, ишемия кишечника), лечении антибиотиками и АНД.
Действие витамина К проявляется на заключительных стадиях синтеза факторов свертывания II, VII, IX, X, а также естественных антикоагулянтов — протеина С и его кофактора протеина S.
Эти витамин К-зависимые белки синтезируются на рибосомах в виде предшественников (проферментов). Для перехода в полноценные ферменты им необходима посттрансляционная модификация — у-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты на N-концах белковых молекул (Stenflo J. et al., 1974; Furie В. et al., 1990; Hirsh J. et al., 2003). В дальнейшем, при активации факторов свертывания, остатки у-карбоксиглутаминовой кислоты связываются с ионами кальция и с их помощью прикрепляются к фосфолипидным рецепторам мембран тромбоцитов и эндотелиальных клеток (Филиппович Ю.Б., 1993; Вавилова Т.В., 2002). Карбоксилирование производит витамин К-зависимая карбоксилаза, локализованная в мембране эндоплазматической сети (Presnell S.R., Stafford D.W., 2002).
Роль витамина К заключается в отнятии атома водорода от у-углеродного атома остатка глутаминовой кислоты. При этом витамин К окисляется в эпоксид, а затем с помощью витамин К-редуктазы восстанавливается в активную форму (Шиффман Ф.Д., 2000).
Варфарин ингибирует витамин К-редуктазу и таким образом блокирует восстановление эпоксида витамина К в активную ферментную форму (рис. 1). При этом витамин К-зависимые факторы свертывания остаются неактивными, снижается способность крови к коагуляции (Вавилова Т.В., 2002). Закономерно, что поступление в организм больших количеств витамина К с пищей (печень, зеленые части растений) или в виде лекарственного препарата снижает эффект варфарина (Hirsh J. et al., 2003; Holbrook A.M. et al., 2005).
Клинически значимые изменения в коагуляции крови определяются не сразу после приема варфарина, так как в первые часы в крови циркулируют факторы свертывания, синтезированные печенью еще до начала лечения. Для достижения максимального эффекта препарата может понадобиться 4-5 дней. Это объясняется в первую очередь длительным временем полужизни факторов свертывания, протеинов С и S (табл. 1). Восстановление активности прокоагулянтов после отмены варфарина также происходит постепенно. Терапия АНД не дает эффекта "на кончике иглы" и не является быстро управляемой. Продолжительность лечения зависит от конкретной клинической ситуации. Нередки случаи, когда пациент нуждается в пожизненном приеме варфарина.
При неправильном назначении АНД (ударная доза) возможен парадоксальный эффект: тромбоз вместо гипокоагуляции (вследствие более быстрого снижения уровня протеина С по сравнению с фактором II). Поэтому терапию следует начинать с поддерживающих доз (Вавилова Т.В., 2002).
Основная роль в процессах гипокоагуляции у молекулы АНД принадлежит 4-гидроксикумариновому кольцу, а его боковые радикалы влияют на продолжительность жизни препарата, его адсорбцию в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), кумуляцию, токсичность. В зависимости от химической структуры различают следующие основные группы АНД: производные монокумарина, производные дикумарина и индандионы (Бокарев И.Н., Козлова Т.В., 2000).
Варфарин (Coumadin) является производным монокумарина (Kohl, 2000) (рис. 2).
Варфарин выпускается в виде натриевой соли (международное непатентованное название - варфарин натрия). В настоящее время варфарин признан "золотым стандартом" терапии АНД. Варфарин используется для контролируемой гипокоагуляции с 1947 года, когда он впервые был применен у больного с инфарктом миокарда.
Варфарин — наиболее распространенный в мире оральный антикоагулянт (Takahashi Н., Echisen Н., 2001) благодаря своим достоинствам: оптимальная продолжительность действия (возможен прием 1 раз в сутки); низкая токсичность, хорошая переносимость (низкая частота побочных эффектов); хорошее всасывание в ЖКТ; длительный период полужизни в плазме крови, который обеспечивает стабильную гипокоагуляцию, не допускающую колебаний в снижении уровня VII фактора; относительно невысокая стоимость, делающая препарат доступным большинству российских пациентов; удобная форма выпуска — таблетки с насечкой для деления на 2 или 4 части.
В 2002 году варфарин был зарегистрирован в России фирмой NYCOMED (Дания). Форма выпуска: пластиковые флаконы, содержащие по 50 или 100 таблеток Варфарин Никомед 2,5 мг.
Показания к применению варфарина (Лечение оральными антикоагулянтами: Рекомендации Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудов им. А.А. Шмидта — Б.А. Кудряшова, 2002; Hirsh J. et al., 2003; Stein P.D. et al., 2001): профилактика тромбоза и тромбоэмболии легочной артерии при мерцании предсердий; острый венозный тромбоз и тромбоэмболия легочной артерии (вместе с гепарином); послеоперационный тромбоз; повторный инфаркт миокарда; в качестве дополнительного мероприятия при проведении хирургического или медикаментозного (тромболитического) лечения тромбоза, а также при электрической конверсии мерцания предсердий; рецидивирующий венозный тромбоз; повторная эмболия легочной артерии; наличие протезов сердечных клапанов или протезов кровеносных сосудов (возможна комбинация с ацетилсалициловой кислотой); тромбоз периферических, коронарных и мозговых артерий; вторичная профилактика тромбоза и тромбоэмболии после инфаркта миокарда.
Варфарин представляет собой эквимолярную рацемическую смесь двух активных (S)- и (Д)-энантиомеров. S-варфарин в 5 раз сильнее ингибирует витамин К-редуктазу, чем его R-форма (Шиффман Ф.Д., 2000; Takahashi Н., EchisenH.,2001).
Разработка метода выявления мутаций в кодирующей и регуляторной областях гена VKORC1
Нуклеотидная последовательность гена VKORC1 была получена из базы данных NCBI Sequence Viewer (NT 086679), находящейся в свободном доступе в сети Интернет по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov. В качестве примера на рис. 7 приведен фрагмент нуклеотидной последовательности экзона 3 и 3 -нетранслируемой области из указанной базы данных.
На основе информации о молекулярном строении гена по принципу комплементарности с использованием программы Vector NTI Suite, версия 6.0, была подобрана структура праймеров для ПЦР, фланкирующих в кодирующей области экзон 1 и экзон 3 и в регуляторных районах интрон 1 и 3 -нетранслируемую область. Структура праймеров, температура отжига и размер амплифицированных фрагментов ДНК указаны в табл. 7.
Полученные в результате ПЦР фрагменты гена VKORC1 были подвергнуты рестрикционному анализу. Ферменты подбирались по каталогам фирм-производителей согласно структуре сайтов рестрикции, включающих в себя анализируемые точки мутагенеза. При подборе использовали компьютерные программы Vector NTI Suite, версия 6.0, и OMIGA. Принцип рестрикционного анализа на примере идентификации мутаций в экзонах 1 и 3 представлен на рис. 8. Рестриктазы, подобранные для детекции Val29Leu, Val45Ala, Arg58Gly, Leul28Arg, C1173T и G3730A, температурный режим проведения анализа и фрагменты, позволяющие идентифицировать генотипы VKORC1, указаны в табл. 8.
Идентификация замены С1173Т: 1 - 1173СТ генотип; 2,3,5 - 1173СС генотип; 4 - 1173ТТ генотип; 6 - маркер молекулярного веса 50bpGeneRuler. 96. Идентификация замены G3730A:1 - маркер молекулярного веса 50bpGtntRuler; 2,3 - 3730GG генотип; 4 - 3730GA генотип; 5 - 3730АА генотип.
Юа.Идентификация замены Val29Leu/Val45Ala: 1 - маркер молекулярного веса pBR322/AluI; 2 - 6 - ValVal29/ValVal45 генотип. 106. Идентификация замены Arg58Gly: 1 - 5 - ArgArg58 генотип; 6 - маркер молекулярного веса pBR322/HaeIII. 10в. Идентификация замены Leul28Arg: 1 - 4 - LeuLeul28 генотип; 5 - маркер молекулярного веса рВЮ22/НаеШ.
Алгоритм дозирования варфарина у пациентов с различной чувствительностью к препарату
Выявленные различия в чувствительности к варфарину в зависимости от генотипа CYP2C9 и клинические наблюдения за больными позволили нам разработать и использовать в практике работы Центра лабораторной диагностики СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова алгоритм дозирования варфарина в период индукции и в период поддерживающей дозы. Он согласуется с российскими и международными рекомендациями по ведению данной группы больных (Лечение оральными антикоагулянтами: Рекомендации Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудов им. А.А. Шмидта - Б.А. Кудряшова, 2002; Stein P.D. et al., 2001; Hirsh J. et al., 2003) и позволяет, используя фармакогенетические характеристики варфарина, сделать проводимое лечение более эффективным и безопасным. Алгоритм запрограммирован на "опережение" событий и позволяет предупредить передозировку препарата и чрезмерную гипокоагуляцию.
После назначения препарата первое исследование MHO проводилось через 36 часов, то есть утром второго дня. По результатам исследования MHO во 2-3 день терапии варфарином и величине дозы варфарина обследованные больные (п=84) были разделены на 3 группы (табл. 15).
Правомочность такого деления на группы подтвердилась дальнейшими клиническими наблюдениями за больными не только в период индукции, но и в период поддерживающей дозы.
Первая подгруппа была представлена 12 пациентами с высокой чувствительностью к варфарину, достигавшими терапевтического значения МНО=2 в течение 36-72 часов. Средняя недельная доза варфарина у них составляла менее 26,25 мг (менее 1,5 таблеток в сутки при содержании активного вещества 2,5 мг в таблетке). Все представители данной подгруппы были носителями мутантных аллелей гена CYP2C9 (аллели CYP2C9 2 и/или CYP2C9 3). Из аллелей интрона 1 гена VKORC1 также наиболее часто встречался мутантный, 1173Т (9 человек, 75%).
Эти больные быстро достигали терапевтического значения MHO при стандартном начале терапии, часто давали чрезмерную гипокоагуляцию даже при внимательном их ведении и тщательном лабораторном контроле, имели значительные и немотивированные колебания MHO в период поддерживающей дозы, медленно восстанавливали свертывающую способность крови при отмене препарата или уменьшении дозы.
Вторая подгруппа оказалась самой многочисленной. В нее вошли 54 пациента с умеренной чувствительностью к варфарину. Они достигали терапевтического значения МНО=2 на 4-5 сутки терапии, нуждались в недельной дозе препарата 26,25-43,75 мг (1,5 - 2,5 таблетки в сутки), имели предсказуемый ответ на увеличение или уменьшение дозы, были стабильны в период поддерживающей дозы.
Среди этих больных только 6 (11,1%) имели мутантный аллель CYP2C9 2, остальные 48 человек (85,9%) были носителями "дикого" генотипа CYP2C9 1/ 1. Большинство пациентов (37 человек, 69%) имели мутантный аллель 1173Т интрона 1 гена VKORC1.
Третья подгруппа была представлена 18 пациентами со сниженной чувствительностью к варфарину. Эти больные медленно выходили на терапевтическое значение МНО=2 (6-10 суток), требовали недельной дозы препарата более 43,75 мг (более 2,5 таблеток в сутки). Максимальная недельная доза препарата в этой группе составила 87,5 мг. В данной подгруппе была характерна "ригидность" параметров гемостаза при попытке изменить дозу варфарина и быстрое восстановление после отмены препарата.
Среди проанализированных больных с низкой чувствительностью к варфарину носители мутантных аллелей гена CYP2C9 отсутствовали, и данная подгруппа была представлена исключительно носителями "дикого" генотипа CYP2C9 1/ 1. Мутантный аллель 1173Т интрона 1 гена VKORCl встретился у 7 пациентов (39%). Именно из третьей подгруппы выбирались пациенты для поиска новых мутаций в кодирующей области гена VKORCl, ассоциированных с варфарин-резистентностью (раздел 3.2 данной диссертации).
Нам не удалось выявить закономерной связи чувствительности к варфарину с полиморфизмом G3730A З -нетранслируемой области гена VKORCl. Мутантный аллель 3730А примерно с одинаковой частотой встречался в подгруппах с высокой (4 человека, 33%), умеренной (24 человека, 45%) и низкой (8 человек, 44%) чувствительностью к варфарину.
Учитывая выявленные закономерности, мы построили алгоритм подбора дозы варфарина и дальнейшего ведения больных (табл. 16) с учетом как фармакогенетической составляющей (генотип CYP2C9), так и фенотипических проявлений (требуемая доза препарата, "подъемы" MHO выше терапевтических границ, нестабильность уровня гипокоагуляции).
При использовании предложенного алгоритма действия врача строятся на основании следующих данных: генотип больного по CYP2C9, значение MHO, полученное при первом измерении, и дальнейшая динамика MHO.
Если больной уже на 2 день терапии достигает терапевтического значения MHO, он относится к первой группе.
Мутация G3730A в З -нетранслируемой области гена VKORC1
При анализе величины средней недельной дозы варфарина (п=154) не было обнаружено статистически достоверных отличий между носителями генотипов 3730GG, 3730GA и 3730АА: %2=3,49, df=2, р=0,175. Однако при попарном сравнении в тесте Манна-Уитни было выявлено, что различие в средней недельной дозе между носителями "дикого" генотипа (34,8±17,5 мг) и лицами с мутантным аллелем 3730А в гомозиготном состоянии (43,0±17,2 мг) близка к уровню статистической достоверности (р=0,053); пациенты с генотипом 3730GA по своей потребности в варфарине при этом занимали промежуточное положение (39,7±16,3 мг). Таким образом, отмечалась тенденция к увеличению средней недельной дозы варфарина от гетерозиготного к гомозиготному носительству мутантного аллеля 3730А (табл. 32).
При анализе распределения аллельных вариантов З -нетранслируемой области гена VKORC1 в подгруппах больных с различной чувствительностью к варфарину (табл. 33, рис. 19) было отмечено закономерное увеличение доли мутантных аллелей от подгруппы с высокой чувствительностью (48,5%) к подгруппам с умеренной (61,7%) и низкой (72,5%) чувствительностью.
В подгруппе больных со средней недельной дозой варфарина более 43,75 мг носители мутантного аллеля 3730А статистически достоверно встречались реже, чем в подгруппе с высокой чувствительностью (р=0,031). При попарном сравнении в точном тесте Фишера не было обнаружено статистически достоверных различий между подгруппами высокой и умеренной (р=0,138), а также умеренной и низкой (р=0,167) чувствительности.
При анализе зависимости средней недельной дозы варфарина от аллельных вариантов З -нетранслируемой области гена VKORC1 в подгруппах больных с различным генотипом CYP2C9 в подгруппе "дикого" генотипа CYP2C9 не было обнаружено статистически достоверных отличий между носителями различных аллельных вариантов З -нетранслируемой области гена VKORC1: х2=1 77, df=2, р=0,413. Однако мы отметили тенденцию к увеличению средней недельной дозы варфарина от гетерозиготного к гомозиготному носительству мутантного аллеля 3730А: 44,4±15,1 мг, 46,9±13,6 мг и 49,2±15,8 мг для носителей генотипов 3730GG, 3730GA и 3730АА, соответственно (табл. 34, рис. 20).
В подгруппе мутантных аллелей CYP2C9 статистически достоверных отличий между носителями различных аллельных вариантов У-нетранслируемой области гена VKORC1 не наблюдалось: % =4,19; df=2; р=0,123. Как и в первой подгруппе, присутствовала тенденция к увеличению средней недельной дозы варфарина от гетерозиготного к гомозиготному носительству мутантного аллеля 3730А: 20,3±7,9 мг, 23,4±8,0 мг и 28,4±10,5 мг для носителей генотипов 3730GG, 3730GA и 3730АА, соответственно. При попарном сравнении в тесте Манна-Уитни различия в средней недельной дозе варфарина между носителями "дикого" генотипа и лицами с мутантным аллелем 373 0 А в гомозиготном состоянии почти достигали уровня статистической значимости: р=0,082.
Таким образом, среди всех обследованных максимальную потребность в варфарине демонстрировали лица с неизмененной структурой гена CYP2C9 и с мутантным аллелем 3730А в гомозиготном состоянии в З -нетранслируемой области гена VKORC1 (генотип CYP2C9 1/ 1, 3730АА; средняя недельная доза 49,2±15,8 мг). Наиболее чувствительными к варфарину оказались 24 носителя мутаций в гене CYP2C9 и "дикого" генотипа З -нетранслируемой области гена VKORC1 (средняя недельная доза 20,3±7,9 мг).
Однако при попарном сравнении в тесте Манна-Уитни было выявлено, что различие в значениях максимального MHO между носителями "дикого" генотипа (3,7±1,4) и лицами с мутантным аллелем 3730А в гомозиготном состоянии (2,8±0,7) близка к уровню статистической достоверности (р—0,064); пациенты с генотипом 3730GA по значению максимального MHO при этом занимали промежуточное положение (3,2±1,2). Таким образом, отмечалась тенденция к уменьшению максимального MHO от гетерозиготного к гомозиготному носительству мутантного аллеля 3730А (табл. 32).
При анализе зависимости максимального MHO от аллельных вариантов З -нетранслируемой области гена VKORC1 в подгруппах больных с различным генотипом CYP2C9 в подгруппе "дикого" генотипа CYP2C9 не было обнаружено статистически достоверных отличий между носителями различных генотипов З -нетранслируемой области гена VKORC1: х2=0,88, df 2, р=0,643.
Однако мы отметили тенденцию к уменьшению максимального MHO от гетерозиготного к гомозиготному носительству мутантного аллеля 373 0А: 3,0±1,3, 2,9±0,9 и 2,4±0,5 для носителей генотипов 3730GG, 3730GA и 3730АА, соответственно. В подгруппе мутантных аллелей CYP2C9 также присутствовала тенденция к уменьшению максимального MHO от гетерозиготного к гомозиготному носительству мутантного аллеля 373 0А: 4,4±1,2, 4,0±1,3 и 3,6±0,5 для носителей генотипов 3730GG, 3730GA и 3730АА, соответственно. Достоверность отличий между носителями различных генотипов З -нетранслируемой области гена VKORC1 приближалась к уровню статистической значимости: %2;=5,39, df=2, р=0,068.
Таким образом, среди всех обследованных наиболее низкие показатели максимального MHO демонстрировали лица с неизмененной структурой гена CYP2C9 и с мутантным аллелем 3730А в гомозиготном состоянии в З -нетранслируемой области гена VKORC1 (генотип CYP2C9 1/ 1, 3730АА; максимальное MHO 2,4±0,5). Наиболее высокими (4,4±1,2) значения максимального MHO оказались у пациентов, имеющих мутации в гене CYP2C9 и "дикий" генотип З -нетранслируемой области гена VKORC1 3730GG (табл. 35, рис. 21).
При анализе зависимости длительности фазы индукции от структурного полиморфизма З -нетранслируемой области гена VKORC1 выяснилось, что всем обследованным пациентам понадобилось примерно одинаковое время для достижения терапевтического уровня гипокоагуляции: 4,9±3,0 дня. Не было обнаружено статистически достоверных отличий между носителями генотипов 3730GG, 3730GA и 3730АА: х2=1,35, df-2, р=0,509.
Мы отметили тенденцию к удлинению фазы индукции от гетерозиготного к гомозиготному носительству мутантного аллеля 3730А: 4,1±2,1 дня, 5,5±3,4 дня и 5,6±3,6 дня для носителей генотипов 3730GG, 3730GA и 3730АА, соответственно (табл. 36). Однако при попарном сравнении в тесте Манна-Уитни различия не достигали уровня статистической значимости: р=0,141 и р=0,421 для генотипов 3730GA и 3730АА, соответственно, при их сравнении с 3730GG.
