Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Синтез альбумина, распределение в организме, утилизация 12
1.2. Строение молекулы альбумина 13
1.3. Функции альбумина 16
1.4. Гетерогенность альбумина 25
1.5. Современное состояние методических подходов к выделению альбумина 28
1.6. Методы исследования связывающей способности ал ьбумина 31
1.7. Изучение физико-химических и сорбционных свойств альбумина при заболеваниях почек 33
Глава 2. Материалы и методы 36
2.1. Характеристика обследованных доноров и больных с заболеваниями почек 36
2.2. Методы 39
2.3. Основное оборудование 46
2.4. Методы статистической обработки материалов исследования 46
Глава 3. Результаты исследований 48
3.1. Подбор оптимальной концентрации сульфата аммония для выделении альбумина из цельной сыворотки крови с помощью метода высаливания 48
3.2. Результаты опытов по выделению альбумина из образцов сыворотки крови доноров и больных хроническим гломерулонефритом 52
3.3. Сравнение двух методов выделения альбумина из сыворотки крови - с помощью высаливания и с помощью по лиэти л енглико ля 58
3.4. Содержание сульфгидрильных групп в сыворотке крови и во фракции, полученной после частичного выделения альбумина сыворотки крови методом высаливания 61
3.5. Содержание жирных кислот в сыворотке крови и во фракции, полученной после высаливания 68
3.6. Фракции нативного и модифицированного альбумина сыворотки крови и фракции частично очищенного альбумина доноров и больных хроническим гломерул онеф р итом 73
3.7. Альбумин и модифицированный альбумин в моче больных хроническим гломерулонефритом в стадии обострения 80
3.8. Характеристика связывающей способности альбумина сыворотки крови доноров и больных с помощью флуоресцентного зонда К-35 83
Глава 4. Обсуждение результатов 89
4.1. Свойства альбумина сыворотки крови доноров 92
4.2. Свойства альбумина сыворотки крови больных, получавших консервативную терапию 95
4.3. Свойства альбумина сыворотки крови больных, получавших лечение регулярным гемодиализом 101
Выводы 105
Практические рекомендации 106
Список использованной литературы 108
- Современное состояние методических подходов к выделению альбумина
- Методы статистической обработки материалов исследования
- Результаты опытов по выделению альбумина из образцов сыворотки крови доноров и больных хроническим гломерулонефритом
- Свойства альбумина сыворотки крови больных, получавших консервативную терапию
Введение к работе
Актуальность проблемы. Альбумин является основным белком плазмы крови и выполняет разнообразные функции, такие, как поддержание онкотического давления крови, антиоксидантная, транспортная. Альбумин способен сорбировать широкий круг веществ как эндогенного, так и экзогенного происхождения [Peters Т.Jr., 1985].
Определение концентрации альбумина в сыворотке крови является важным клинико-лабораторным показателем. Однако нормальное содержание альбумина еще не означает его функциональной полноценности. Уже несколько десятилетий назад было замечено, что при некоторых заболеваниях сорбционные и другие физико-химические свойства альбумина изменяются - происходит нарушение нативной конформации молекулы, снижается отрицательный электрический заряд. Такой альбумин был назван модифицированным [Троицкий Г.В. и др., 1974].
Исследование состояния альбумина при различных патологических процессах за последние годы получило широкое распространение. Однако данных, касающихся свойств сывороточного альбумина при заболеваниях почек, в литературе описано относительно мало. Считается, что основными причинами протеинурии при заболеваниях почек являются нарушения структуры гломерулярного фильтра - увеличение порозности мембраны с одновременным снижением содержания клубочкового полианионного комплекса [Плоткин В.Я., 1992; Klahr S., 1987]. Однако в последнее время высказываются предположения, что изменения конформационных и сорбционных свойств самого альбумина могут способствовать развитию протеинурии [Кожевников А.Д., 1997]. Кроме того, недавно появились предположения о прямом повреждающем воздействии модифицированного альбумина на клетки почечных канальцев у больных с хроническим гломерулонефритом (ХГН), особенно при развитии нефротического синдрома (НС) [Ruggenenti P., Remuzzi G., 2000; Schreiner G.F., 1995].
Таким образом, изучение свойств альбумина и его функциональной полноценности при ХГН является актуальным. Цель исследования: Изучение сорбционных и других физико-химических свойств альбумина и выявление его модифицированных форм в сыворотке крови и моче больных хроническим гломерулонефритом. Задачи исследования
1. Подобрать оптимальные условия для выделения альбумина сыворотки крови доноров и больных с ХГН с помощью метода высаливания.
Сравнить результаты выделения альбумина из сыворотки крови методом высаливания с методом частичной очистки альбумина с использованием полиэтиленгликоля.
Изучить устойчивость в солевых растворах альбумина сыворотки крови доноров и больных с ХГН при различных клинических вариантах течения заболевания, а также при использовании консервативных и активных (гемодиализ) методов лечения.
Оценить содержание сульфгидрильных групп в сыворотке и во фракции после высаливания у доноров и больных с ХГН, как
7 показателя целостности нативной конформации молекулы альбумина.
5. Дать количественную оценку содержания неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) в сыворотке крови и во фракции после высаливания в расчете на молекулу альбумина, как показателя, характеризующего транспортную функцию альбумина.
6. Оценить соотношение фракций нативного и модифицированного альбумина в сыворотке крови и в моче обследованных лиц.
7. Изучить возможность использования флуориметрического метода с применением зонда К-35 для оценки суммарного содержания альбумина в сыворотке крови и его связывающей способности.
Научная новизна и теоретическая значимость исследования
Сформулировано новое представление о состоянии альбумина при ХГН. Проведенные исследования выявили значительные изменения сорбционных и других физико-химических свойств альбумина сыворотки крови больных с ХГН.
Получены новые данные о снижении растворимости альбумина в солевых растворах, которые свидетельствуют об уменьшении суммарного отрицательного электрического заряда и размеров гидратной оболочки белковой молекулы у больных при ХГН, что может играть существенную роль в развитии протеинурии.
Сформулировано представление о том, что высокое относительное содержание модифицированного альбумина в моче представляет собой один из механизмов элиминации
8 альбумина с измененными нативными свойствами и выполняет, таким образом, гоме о статическую функцию.
Свойства альбумина у больных с хронической почечной недостаточностью (ХГШ), находящихся на регулярном гемодиализе, отличаются от таковых у больных в доазотемическом периоде заболевания и состоят в снижении сорбционной ёмкости за счет перегруженности эндотоксинами.
Установлено, что в крови больных с НС физико-химические свойства альбумина претерпевают глубокие изменения, связанные со снижением растворимости и нарушением конформации вплоть до разворачивания белковой глобулы. Преобразованный таким образом альбумин легче проникает через почечный фильтр, усугубляя патологический процесс. Практическая значимость
Разработан и внедрен в нефрологическую практику способ определения модифицированного альбумина в моче больных с ХГН. Установлено, что уровень модифицированного альбумина в моче больных резко увеличивается по мере нарастания протеинурии, что свидетельствует об участии нарушений физико-химических свойств альбумина в патогенезе развития нефротического синдрома.
Доказано, что у больных с ХГШ, находящихся на гемодиализной терапии, молекулы альбумина перегружены уремическими токсинами, что снижает сорбционную ёмкость альбумина и его антитоксические свойства.
Флуоресцентный метод определения как общей, так и эффективной концентрации альбумина позволяет быстро и
9 надежно осуществлять мониторинг степени интоксикации у больных с ХГН по мере трансформации клинико-лабораторных признаков заболевания.
Полученные результаты могут быть использованы в практике научных исследований и в учебном процессе, в частности, на курсах повышения квалификации врачей-лаборантов и врачей-нефрологов. Основные положения, выносимые на защиту
1. При изучении физико-химических и сорбционных свойств альбумина сывороки крови на примере какого-либо патологического состояния необходимо индивидуально подходить к подбору условий выделения и частичной очистки данного белка с помощью процедуры высаливания. Следует учитывать, что изменение устойчивости альбумина в солевых растворах само по себе является характеристикой нативных свойств альбумина: сохранности гидратной оболочки и суммарного поверхностного электрического заряда.
2. У больных ХГН значительно изменены физико-химические свойства альбумина, что проявляется меньшей устойчивостью в растворах сульфата аммония в высоких концентрациях. Этот эффект наиболее выражен у больных на этапе обострения (НС) и ХПН, и менее всего - у пациентов в фазе ремиссии и леченых с помощью хронического гемодиализа.
3. После выделения и очистки альбумина возрастает молярное отношение содержания восстановленных сульфгидрильных групп к содержанию альбумина крови больных с ХГН, особенно при наличии НС. Это свидетельствует о том, что в ходе процедуры высаливания удается выделить альбумин с
10 частичным нарушением конформации из-за разрыва дисульфидных мостиков, а в осадок попадает альбумин, возможно, перегруженный лигандами, его окисленные и/или димерные формы.
4. У альбумина сыворотки крови больных с ХГН сохранена транспортная способность в отношении НЭЖК. У всех пациентов, кроме больных с НС, в этот процесс вовлечен основной центр сорбции с высоким сродством к НЭЖК. У больных с НС задействованы два центра связывания, следовательно, альбумин этих больных имеет повышенную по сравнению с альбумином сыворотки крови других групп пациентов загруженность жирными кислотами.
5. В моче больных с ХГН, сочетающимся с протеинурией, выявлены модифицированные формы альбумина, относительное содержание которых увеличивается по мере нарастания протеинурии, которая может быть механизмом выведения из организма структурно и функционально неполноценных молекул альбумина.
Апробация работы
Результаты диссертации доложены на заседаниях проблемной комиссии «Нефрология» и кафедры пропедевтики внутренних болезней Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова, на XXXVI и XXXVII Конференциях Европейской нефрологической ассоциации и Европейской ассоциации диализа и трансплантации (Мадрид, 1999; Ницца, 2000).
По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.
Современное состояние методических подходов к выделению альбумина
Для разделения белковых смесей используются разнообразные методы: избирательное осаждение белков за счет изменения некоторых свойств растворителя, гель-фильтрация, хроматография, препаративный электрофорез. Все эти методы, за исключением избирательного осаждения, требуют специального оборудования и дорогостоящих реактивов (например, декстраны для гель-фильтрации). Поэтому мы рассмотрим здесь только простые и общедоступные методы разделения белковых смесей, основанные на разной растворимости белков при изменении свойств растворителя. Растворимость сывороточного альбумина практически во всех растворителях выше растворимости большинства других белков плазмы, поэтому методы его выделения обычно основаны на осаждении других компонентов, тогда как альбумин остается в растворе.
Метод осаждения белков смешивающимися с водой органическими растворителями играет особенно важную роль при выделении белков в промышленных масштабах [Балаян С.С. и др., 1997]. Однако в лабораторных условиях этот метод не нашел столь широкого применения, так как к недостаткам этого метода относится заметное денатурирующее действие органического растворителя при температуре выше +10 С.
Высаливание - один из широко применяемых способов разделения белковых смесей [Скоупс Р., 1985; Rachinsky M.N., Foster Y.F., 1957]. Растворимость белков в солевых растворах зависит от их гидрофильности, от концентрации соли и от природы соли. Наиболее эффективны соли, анионы которых имеют большой электрический заряд. Катионы в этом отношении менее важны. По способности к высаливанию анионы располагаются в ряд Гофмейстера: SCN —, I-, СЮ4 N03 Вг С1 СН3СОО S042_, Р043 . Хотя, судя по положению в этом ряду, фосфат более эффективен, чем сульфат, на практике при нейтральном значении рН фосфат состоит из смеси ионов НР042— и Н2Р04—, которые менее эффективны, чем Р043—.
Одновалентные катионы по эффективности действия на осаждение белков можно расположить в следующий ряд: NH4+ К+ Na+. При выборе соли учитывают растворимость соли, плотность концентрированного раствора, так как эффективность центрифугирования при отделении осадка определяется разностью между плотностью белкового осадка и плотностью растворителя [Скоупс Р., 1985]. Сульфат аммония - единственная соль, которая обладает всеми преимуществами и не имеет недостатков при работе с типичным белком.
Растворимость сульфата аммония очень мало меняется в области температур от 0 до 30 С; концентрация насыщенного раствора в воде составляет приблизительно 3,5 М. Плотность этого насыщенного раствора равна 1,235 г-см" , а плотность белкового агрегата в таком растворе - 1,29 г-см"3.
Поскольку альбумин является самым гидратированным белком сыворотки крови, он обладает самой высокой растворимостью. В отличие от глобулинов, альбумин растворяется и в воде, и в концентрированных солевых растворах. Согласно одной из первых классификаций белков (Р. Рапшп, 1852), альбумины - это белки, которые остаются в полунасыщенном растворе сульфата аммония [Г.Нейрат, К.Бейли, 1958].
Полсон А. с соавт. [Poison A. et al., 1964] исследовали способность различных высокомолекулярных нейтральных водорастворимых полимеров осаждать белки плазмы. Растворы полиэтиленгликоля (ПЭГ) при концентрации до 20% (вес/объем) имеют не очень большую вязкость, а наиболее эффективным является ПЭГ с молекулярной массой 4000 и более. ПЭГ успешно применяется для осаждения глобулинов [Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1983].
К недостаткам использования ПЭГ относится то, что он значительно труднее удаляется из белковой фракции, чем соль или органический растворитель. Из-за его полимерной природы ПЭГ очень медленно диализуется, поэтому приходится работать с растворами, содержащими значительные количества примеси ПЭГ.
Методы статистической обработки материалов исследования
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общеупотребительных методов параметрической и непараметрической статистики [Урбах В.Ю., 1975; Поллард Дж., 1982]. Методы дескриптивной статистики включали в себя оценку среднего арифметического (X), средней ошибки среднего значения (ш). Для оценки межгрупповых различий применяли: при сравнении двух групп - t-критерий Стьюдента и F-критерий Фишера, U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Для сравнения парных (сопряженных) выборок использовали парный td-критерий Стьюдента и парный Ud-критерий Вилкоксона. Использовали также методы линейного корреляционного анализа (r-критерий Пирсона, т-критерий Кендела и -критерий Спирмена) [Дрейпер Т. и Смит Г., 1989].
Статистическая обработка материала выполнялась на ПЭВМ с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v.5.0).
Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий) принимали равным 0,05.
Метод выделения фракции АЛБ из смеси белков с помощью высаливания чрезвычайно прост и удобен. Однако, ни в одном из источников отечественной или зарубежной литературы мы не смогли найти четких, определенных и унифицированных рекомендаций в отношении оптимальной концентрации высаливающего агента в том случае, когда в качестве материала для исследований используется цельная сыворотка крови человека.
Поэтому на предварительном этапе работы была проведена серия экспериментов по подбору концентрации высаливающего агента. Учитывая достоинства и недостатки различных солей, которые обычно используют при высаливании, мы остановили свой выбор на сернокислом аммонии (СКА). Были опробованы концентрации СКА в диапазоне от 30%-ного до 60%-ного насыщения раствора изучаемого образца.
При 30%-ном насыщении высаливающим агентом раствора смеси белков или сыворотки крови человека в супернатанте оставался практически весь АЛБ, однако, в растворе можно было обнаружить также и большую часть глобулинов (в среднем - 38% от общего содержания белка в надосадке). При концентрации СКА, превышающей 50%-ное насыщение происходило практически полное осаждение глобулинов, а также значительной части АЛБ (рис. 3.1.1).
Поэтому при подборе оптимальной концентрации высаливающего агента наиболее детально был изучен эффект двух конечных концентраций СКА: 21,5% и 17,2%, что соответствует 50%-ному и 40%-ному насыщению исследуемого раствора. Высаливающему воздействию были подвергнуты как препараты очищенного АЛБ (10% человеческого плацентарного АЛБ и бычьего сывороточного АЛБ для вирусологических исследований), так и образцы сыворотки крови доноров и больных с ХГН. Результаты данных опытов представлены в таблице 3.1 и на рис. 3.1.2.
При 50%-ном насыщении высаливающим агентом исследуемых образцов происходила значительная потеря АЛБ. Так, в растворах препаратов очищенного АЛБ в надосадке оставалось в среднем 67% от исходного количества белка, а в образцах сыворотки крови доноров и больных с ХГН - 56,9±0,7% и 46,9±2,3% от общего количества АЛБ в цельной сыворотке, соответственно.
При использовании СКА в конечной концентрации 17,2% (что соответствует 40%-ному насыщению раствора) выделили практически весь АЛБ из его очищенных препаратов (в среднем 94% от исходного содержания) и значительную часть из сывороток крови доноров (в среднем - 77,6±1,6%) и больных с ХГН, получающих консервативное лечение заболевания (63,2±2,1%).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что для выделения АЛБ из образцов цельной сыворотки крови целесообразно использовать СКА в конечной концентрации 17,2%, так как в этих условиях достигается оптимальное соотношение между количеством выделяемого АЛБ и степенью его очистки. Во всех последующих экспериментах для выделения АЛБ методом высаливания использовали СКА в конечной концентрации 17,2%.
Как видно из представленных на рис.3.1.2 данных, количество АЛБ, выделяемого с помощью метода высаливания из сыворотки крови больных с ХГН значительно меньше по сравнению с образцами сыворотки крови доноров. Однако, группа обследованных пациентов была неоднородной по своему составу (см. табл.3.2). По величине исходного содержания АЛБ в сыворотке крови среди больных выделялись пациенты с ХГН в фазе обострения, проявляющимся НС: концентрация АЛБ у этих больных в среднем составляла 20,1± 1,3 0 г/л, что почти в 2 раза ниже, чем у доноров (р 0,0001).
Существенные раличия между группами обследованных пациентов выявлены по величинам процента выделенного АЛБ и, соответственно, по доле АЛБ, выпавшего в осадок в ходе процедуры высаливания (рис. 3.2.1). Так, АЛБ сыворотки крови доноров в наименьшей степени терялся в процессе высаливания (в среднем -22,4±1,6% от исходного количества в сыворотке).
Самой малой устойчивостью к высаливающему эффекту СКА обладал АЛБ сыворотки крови больных с НС или с ХПН: количество АЛБ, выпавшего в осадок в ходе процедуры выделения, составил в среднем 39,9±3,5% и 35,8±3,2% от исходного уровня, соответственно. Промежуточное положение занимал АЛБ сыворотки крови больных в состоянии ремиссии: происходила потеря 31,1±2,6% от первоначального содержания АЛБ в сыворотке. Неожиданно низкий процент АЛБ, выпавшего в осадок, отмечен у больных, получавших лечение с помощью хронического ГД - в среднем 27,3±2,2%.
Результаты опытов по выделению альбумина из образцов сыворотки крови доноров и больных хроническим гломерулонефритом
Характеристикой степени очистки АЛБ сыворотки крови является величина альбумино-глобулинового коэффициента во фракции, полученной после высаливания (рис.3.2.3). Этот коэффициент имел самое высокое значение в группе доноров - 4,2±0,7. В группе больных с ХПН величина коэффициента составляла 3,3±0,6, у пациентов, находящихся на лечении ГД, его значение составляло 2,7±0,2. Самые низкие значения коэффициента наблюдались у больных с ХГН в состоянии ремиссии - 2,01±0,2 и с НС - 1,5±0,3.
Низкое значение альбумино-глобулинового коэффициента у больных с НС объясняется, с одной стороны, высоким содержанием 0.2-глобулиновой фракции в сыворотке, а с другой стороны, тем, что доля осаждаемых высаливанием альбумина и а2-глобулинов практически одинакова.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что АЛБ сыворотки больных с НС или на фоне развития ХГШ у больных, получающих консервативное лечение, отличается наименьшей устойчивостью (растворимостью) в солевых растворах, что может быть связано с частичным нарушением нативной конформации и изменением суммарного поверхностного заряда альбуминовой глобулы.
Как известно, наиболее простыми методами выделения альбумина являются методы, связанные с осаждением других белков плазмы или сыворотки крови такими веществами, как нейтральные соли, нейтральные водорастворимые полимеры, органические растворители. Эти методы не требуют специального оборудования и дорогостоящих реактивов. Мы сравнили два метода, основанные на осаждении глобулинов сыворотки крови - метод высаливания СКА и метод фракционирования белков сыворотки крови с помощью ПЭГ.
Для сравнения двух методов обследованы 24 образца сывороток доноров. В сыворотках и во фракциях частично очищенного альбумина определяли содержание ОБ, АЛБ, T-SH, НЭЖК. Рассчитывали относительное содержание альбумина во фракциях после выделения АЛБ (в процентах от исходного уровня). Полученные данные представлены нарис. 3.3.
Количество альбумина, выделенное из сыворотки разными методами, достоверно не отличалось. С помощью высаливания выделяли 29,5±0,03 г/л альбумина, что составляло в среднем 79,5±2,1% от исходного уровня. При фракционировании сыворотки с помощью ПЭГ в надосадке обнаруживали 28,0±0,9 г/л альбумина, что составляло в среднем 75,9±2,1% от исходного уровня.
То же самое можно сказать и в отношении содержания T-SH - во фракции после высаливания их уровень составлял 0,422±0,011 ммоль/л, а во фракции после осаждения ПЭГ - 0,408±0,010 ммоль/л (р 0,05).
Уровень ОБ, полученный во фракциях частично очищенного альбумина, достоверно отличался, составляя 37,8±1,3 г/л во фракции после высаливания и 32,6±1,2 г/л во фракции после осаждения ПЭГ (р 0,0005).
Особенно большие различия между методами выделения получены при определении уровня НЭЖК. Во фракции после высаливания обнаруживали такое же содержание НЭЖК, как и в сыворотке (0,477±31 ммоль/л и 0,453±35 ммоль/л, соответственно). Во фракции, полученной с помощью ПЭГ, обнаружили 0,681±58 ммоль/л НЭЖК, что достоверно отличалось от уровня НЭЖК во фракции после высаливания (р 0,0003) и составляло 150% от их исходного уровня (р 0,0001). Такое значительное повышение содержания НЭЖК нельзя объяснить, например, активацией липопротеидлипазы во время процедуры выделения, так как выделение альбумина с помощью ПЭГ занимает не более 30-40 минут, тогда как высаливание продолжается почти сутки из-за длительности процедуры диализа. Однако, несмотря на долгое время выделения альбумина с помощью высаливания, заметного повышения уровня НЭЖК не происходило. Поэтому, можно предположить только вмешательство ПЭГ (в высокой конечной концентрации, составляющей 15%) в процесс определения НЭЖК.
Таким образом, единственным, пожалуй, преимуществом метода фракционирования сыворотки крови с помощью ПЭГ является короткое время, необходимое для его проведения. К недостаткам метода, с нашей точки зрения, относится трудность очистки супернатанта от ПЭГ и получение искусственного полуторакратного завышения уровня НЭЖК. В то же время, процент выделения альбумина из сыворотки крови практически одинаков при использовании разных методов.
Несмотря на длительность процедуры высаливания, этот метод представляется нам более подходящим для наших целей, поэтому в дальнейшей работе мы использовали только выделение альбумина с помощью СКА.
Свойства альбумина сыворотки крови больных, получавших консервативную терапию
Некоторые клинико-лабораторные показатели сыворотки крови пациентов, получавших консервативную терапию, представлены в таблице 4.2.
Больные в фазе ремиссии заболевания. Клинические данные сыворотки крови больных в фазе ремиссии находятся в пределах нормы, за исключением величины протеинурии - 2,76±0,58 г/сут.
Уровень альбумина в сыворотке крови этих больных несколько ниже, чем у доноров - 33,46±1,84 г/л (табл. 3.2). Количество альбумина, остающееся в супернатанте при высаливании, составляет, в среднем, 68,9±2,6% от исходного количества.
Уровень T-SH, также как и уровень АЛБ, несколько ниже, чем у доноров (табл. 3.4). Молярное отношение T-SH/АЛБ и в сыворотке крови, и во фракции частично очищенного альбумина, также как у доноров, близко к единице. То же самое можно сказать и в отношении содержания НЭЖК в расчете на АЛБ. Таким образом, единственным достоверным отличием альбумина сыворотки крови больных с ХГН в фазе ремиссии от альбумина сыворотки крови доноров является снижение его растворимости в солевых растворах.
Примечания: НС - нефротический синдром, ХПН - хроническая почечная недостаточность. Данные статистически достоверно отличаются от данных: а - больных в фазе ремиссии, b - больных с НС.
Группа больных с ХГН, осложненным НС, по клиническим показателям отличается высоким уровнем холестерина сыворотки крови -10,80±0,98 ммоль/л - и значительной протеинурией - 9,88±1,25 г/сут. В сыворотке крови этих больных наблюдается самый низкий уровень АЛБ -20,09±1,30 г/л, кроме того, альбумин сыворотки крови больных с НС отличается наименьшей растворимостью в солевых растворах - при высаливании в надосадке остается только 60,1 ±3,5% от исходного количества альбумина.
Молярное отношение T-SH/АЛБ и в сыворотке крови, и во фракции частично очищенного альбумина выше единицы. Учитывая имеющуюся положительную корреляцию между уровнем T-SH и содержанием МАЛБ в сыворотке крови, можно предположить, что альбумин сыворотки крови при НС подвергается модификации, связанной с возможным восстановлением дисульфидных связей, приводящим к нарушению нативной конформации.
Поскольку между содержанием T-SH в сыворотке крови и относительным количеством альбумина (в процентах от исходного уровня) во фракции после высаливания существует прямая связь -х=0,438; Z=2,70; п=20; р 0,007 - можно предполагать, что модифицированный таким образом альбумин достаточно устойчив в солевых растворах.
Молярное отношение НЭЖК/АЛБ в сыворотке крови и, особенно, во фракции после высаливания выше единицы. Во фракции частично очищенного альбумина это отношение достигает значения 2. Это означает, что в связывании НЭЖК, кроме высокоаффинного центра, задействован и вторичный центр с более низким сродством к жирной кислоте. Ранее уже упоминалось о том, что НЭЖК оказывают стабилизирующее действие на молекулу альбумина [Takabayashi К. et al., 1983]. В данном случае подтверждением этого является наличие отрицательной корреляции между уровнем НЭЖК в сыворотке крови и количеством альбумина, выпавшего в осадок при высаливании (т=-0,550; Z=-3,39; п=20; р 0,0007).
Значительная часть альбумина утрачивает способность связывать НЭЖК и, возможно, вследствие этого менее устойчива в солевых растворах.
Модификация альбумина сыворотки крови больных с НС путем восстановления дисульфидных связей приводит, видимо, к изменению конформации белковой молекулы, что способствует изменению поверхностного заряда глобулы. Снижение отрицательного заряда альбуминовой молекулы облегчает проникновение МАЛБ через почечный фильтр. Этому способствует также снижение содержания клубочкового полианионного комплекса [Клар С, 1987; Шейман Дж.А., 1997].
Несмотря на существенно измененную конформацию, альбумин сыворотки крови больных с НС сохраняет РСА на уровне альбумина сыворотки крови больных с обострением, но без НС. Возможно это объясняется удалением с мочой модифицированных форм альбумина.
Группа больных с ХГН в стадии нарушения функции почек характеризуется значительным повышением содержания мочевины и креатинина в сыворотке крови (24,04±3,30 ммоль/л и 0,665±0,120 ммоль/л, соответственно). Содержание альбумина в сыворотке крови этих больных практически не отличается от данных доноров и составляет 36,38±1,84 г/л. Однако, устойчивость альбумина в солевых растворах при ХПН сравнима с таковой при НС - в растворе остается 64,2±3,2% от исходного содержания альбумина. Молярное отношение T-SH/АЛБ в сыворотке крови несколько ниже единицы, но повышается во фракции после высаливания, что может свидетельствовать о выпадении в осадок димерных форм альбумина.
