Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 4
2.1. Блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида (плюроники) 4
2.1.1. Синтез и применение плюроников 4
2.1.2. Взаимодействие плюроников с ионами металлов 6
2.1.3. Взаимодействие полиалкиленоксидов с протонодонорными соединениями 8
2.1.4. Самоассоциация плюроников в водных растворах 9
2.1.5. Адсорбция плюроников на поверхностях раздела фаз 23
2.1.6. Взаимодействие плюроников с липидными бислоями 27
2.2. Липидный бислой как модель биологических мембран 30
2.2.1. Структура липидного бислоя 30
2.2.2. Модели биологических мембран 36
2.2.3. Проницаемость биологических мембран 37
2.2.2.1. Проницаемость мембран для незаряженных соединений 38
2.2.2.2. Транспорт слабых кислот и оснований 40
2.2.2.3. Ионная проницаемость мембран 42
2.3 Соотношение линейности свободных энергий 44
3. Постановка задачи 61
4. Экспериментальная часть 62
4.1. Материалы 62
4.2. Методы 64
4.2.1. Изучение солюбилизации низкомолекулярных соединений в мицеллах плюроника Р85иВгу35 64
4.2.1.1. Изменение интенсивности флуоресценции при фиксированной длине волны 66
4.2.1.2. Изменение формы спектра флуоресценции 66
4.2.1.3. Изменение анизотропии флуоресценции 67
4.2.2. Расчет коэффициентов распределения соединений между водой и мицеллами ПА..67
4.2.3. Получение рН-градиентных липосом 69
4.2.4. Кинетика проникновения антрапиклиновых антибиотиков в липосомы 69
4.2.5. Получение липосом, заполненных флуоресцентным рН-индикатором пиранином ...70
4.2.6. Исследование кинетики транспорта слабых кислот и оснований через мембрану малых моноламеллярных липосом, заполненных раствором пиранина 71
4.2.7. Расчет молекулярных дескрипторов 72
5. Результаты и их обсуждение 74
5.1. Изучение солюбилизации соединений в мицеллах ПАВ 74
5.1.1. Изучение солюбилизующей способности мицелл плюроника Р85 и Brij 35 с помощью флуоресцентной спектроскопии 74
5.1.2. Определение вкладов различных межмолекулярных сил в солюбилизацию низкомолекулярных соединений в мицеллах плюроника Р85 и Brij 35 с помощью метода ЛСЭ 81
5.2. Влияние плюроника на транспорт низкомолекулярных соединений через модельные липидные мембраны 90
5.2.1. Влияние плюроника на мембранный транспорт антрациклиновых антибиотиков .91
5.2.2. Влияние плюроника на мембранный транспорт соединений, не обладающих собственной флуоресценцией 97
6. Выводы 122
7. Список литературы
- Взаимодействие плюроников с ионами металлов
- Изучение солюбилизации низкомолекулярных соединений в мицеллах плюроника Р85иВгу35
- Получение липосом, заполненных флуоресцентным рН-индикатором пиранином
- Определение вкладов различных межмолекулярных сил в солюбилизацию низкомолекулярных соединений в мицеллах плюроника Р85 и Brij 35 с помощью метода ЛСЭ
Введение к работе
Триблок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО), известные под торговой маркой Pluronics (плюроники) или Poloxamers (полоксамеры) [1], представляют собой семейство амфифильных сополимеров, широко востребованных в технологии добычи нефти [2], эмульсионной полимеризации [3], создании моющих средств [4] и т.д. В конце 80-х годов было обнаружено, что плюроники обладают относительно низкой токсичностью. Это открыло широкие перспективы использования этих полимеров в качестве биосовместимых ПАВ [5]. Дальнейшие исследования поведения плюроников в биологическом окружении показали, что они способны усиливать иммунный ответ [6], влиять на метаболизм холестерина [7], ингибировать белковые насосы, обусловливающие множественную лекарственную устойчивость раковых клеток [8-9].
Физиологические эффекты плюроников в основном определяются их взаимодействием с липидными компонентами биологических мембран [9]. Поэтому в настоящей работе было исследовано взаимодействие сополимеров этого класса с модельными липидными структурами. Ранее было показано, что встраивание плюроников в липидные мембраны вызывает уменьшение микровязкости бислоя [10], увеличивает скорость трансбислойной миграции липидов [11] и ускоряет мембранный транспорт противоопухолевого антибиотика доксорубицина [11-13]. Оказалось, что эффект полимеров на перенос лекарств через биологические мембраны зависит как от структуры самого полимера [11, 13], так и от липидного состава мембран [14].
Однако до настоящего времени совершенно не исследованным остается вопрос о том, в какой степени химическая структура переносимого через мембрану вещества влияет на его взаимодействие с плюрониками. Для ответа на этот вопрос на первом этапе настоящей работы была исследована солюбилизация низкомолекулярных соединений в мицеллах плюроника, что позволило получить информацию о силах, участвующих в этом взаимодействии. На втором этапе работы было исследовано влияние плюроника на проникновение слабых кислот и оснований через модельные липидные мембраны, и была проанализирована связь между структурой низкомолекулярных соединений и ускорением их транспорта через липидную мембрану под действием сополимера.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Взаимодействие плюроников с ионами металлов
Взаимодействие плюроников с ионами металлов Еще в средине 60-х годов было обнаружено, что полиэтиленоксид способен координировать ионы щелочных и щелочно-земельных металлов. Было установлено, что добавление иодида калия к концентрированному раствору полизтиленоксида в метаноле (2-Ю мае. %) приводит к сдвигу полосы поглощения этиленовых протонов в спектре ЯМР почти на 0.05 ррт. Причем кажущаяся константа образования комплекса увеличивалась с ростом молекулярной массы полизтиленоксида и уменьшалась с увеличением степени заполнения полимерной матрицы ионами металла от 5 М до 0.2 М. [24]. Ионы натрия, по всей видимости, также способны взаимодействовать с полиалкиленоксидами, причем это взаимодействие проявляется даже в водном растворе. Так, введение уже 0.1 М NaCl приводит к снижению температуры гелеобразования плюроника F127 в водном растворе на 5С, а повышение концентрации хлорида натрия до 0.6 М снижает эту температуру более чем на 15С. Данный эффект едва ли может быть объяснен высаливающим действием хлорида натрия, поскольку, во-первых, ни ионы натрия, ни хлорид-анионы не проявляют космотропные свойства (и тот и другой ионы находятся в середине рядов Гофмейстера [25]. Во-вторых, указанные эффекты наблюдаются при довольно низкой концентрации соли, когда ее влияние на структуру воды пренебрежимо мало и вряд ли может объяснить изменение агрегатного состояния плюроника. Ионы Li+, характеризующиеся еще меньшим ионным радиусом, чем ионы натрия и калия, не взаимодействовали в водном растворе с полиэтиленоксидом. По всей видимости, это обусловлено формированием вблизи этих катионов очень прочной гидратной сферы, которая препятствует координированию иона кислородными атомами полиэтиленоксида [26].
Координация двухвалентных катионов полиалкиленоксидами происходит с заметно большей эффективностью и наблюдается уже в довольно разбавленных водных растворах полимера (0.001-0.00001%). Так, полиэтиленоксид способен координировать ионы Hg в водном растворе, причем эти комплексы обладают достаточно высокой стабильностью и формируют гелевую фазу [27]. Аналогично ведут себя комплексы плюроника L35 ((30)ц(ПО)і6(30)ц) с CdCl2. При введении 2 % насыщенного раствора (около 62 мае. %) к жидкому низкомолекулярному плюронику наблюдается образование геля, и формирование нанокристаллов CdCl2 на полимерной матрице [28].
Комплексообразование полиалкиленоксидов с ионами бария в водном растворе нашло свое применение для высокочувствительного способа анализа полиалкиленоксидов в водных растворах и даже в биологических жидкостях. В этом случае для повышения чувствительности анализа к разбавленному водному раствору комплекса Ва с полиалкиленксидами добавляют водный раствор К13. Гидрофобные анионы I3" взаимодействуют с положительно заряженным комплексом полиалкиленоксида и Ва2+, в результате чего комплекс выпадает в осадок и может детектироваться в растворе нефелометрически [29]. Комплексообразование ионов бария с ПЭО в водном растворе было также использовано в создании волюмометрического метода определения полиэтиленоксида, основанного на потенциометрическом титровании комплекса натриевой солью тетрафенилбора [30].
Координирование ионов металлов полиалкиленоксидами объясняет способность плюроников облегчать транспорт малых ионов через липидные мембраны. Известно, что проницаемость мембран по отношению к малым ионам чрезвычайно низка [31]. В работах [32, 33] было обнаружено, что сополимеры этиленоксида и пропиленоксида способны на несколько порядков увеличивать проницаемость липидных мембран по отношению к малым ионам. При этом плюроники обнаруживают катионную селективность: в их присутствии облегчается транспорт именно катионов щелочных и щелочно-земельных металлов, а транспорт анионов не меняется [33].
Таким образом, имеющиеся в литературе данные показывают, что полиалкиленоксиды способны проявлять свойства комплексообразователей, взаимодействуя с катионами металлов. Очевидно, что в этом взаимодействии принимают участие п-электроны атомов кислорода простых эфирных групп, образуя координационные связи с вакантными орбиталями ионов щелочных и щелочно-земельных металлов. Могут ли полиалкиленоксиды образовывать водородные связи с донорами протонов? На этот вопрос мы ответим в следующем разделе.
Взаимодействие полиалкиленоксидов с протонодонорными соединениями. Взаимодействие полиалкиленоксидов с протонодонорными соединениями ранее изучалось в основном на примере образования комплексов полиэтиленгликолей с поликислотами. В работах В.Ю. Барановского и др. было показано, что при рН 5 полиакриловая и полиметакриловая кислоты образуют нерастворимые комплексы с полиэтиленгликолями, которые растворяются при повышении рН или в избытке одного из полимеров [34]. Было показано, что водородные связи между протонированными карбоксильными группами поликислоты и простыми эфирными группами полиэтиленоксида вносят основной вклад в стабилизацию этих комплексов. Оказалось также, что такие комплексы имеют гидрофобное ядро, которое способно солюбилизовать пирен. При этом резко снижается доля эксимеров пирена, что свидетельствует о торможении диффузии зонда при его включении в интерполимерный комплекс [35]. Введение дополнительных гидрофобных заместителей, таких как ацетоксибензоат [36], 5-нитрохинолинокси-группа [37], производные фенола или октанола [38] усиливает взаимодействие полиэтиленоксида с поликислотами.. Аналогичные закономерности наблюдались и при взаимодействии слабых поликислот с этоксилированными нонилфенолами [39].
Изучение солюбилизации низкомолекулярных соединений в мицеллах плюроника Р85иВгу35
Использованные в работе способы определения коэффициентов распределения веществ между водным раствором и мицеллами ПАВ основаны на том, что спектральные характеристики и анизотропия большинства флуорофоров изменяются в зависимости от диэлектрической проницаемости их микроокружения. Для изучения солюбилизации низкомолекулярных соединений в мицеллах ПАВ была подобрана оптимальная концентрация флуорофора, и получены спектры флуоресценции этих веществ в присутствии ПАВ (15%), а также в его отсутствие. Поверхностно-активные и низкомолекулярные соединения растворяли в буферном растворе, содержащем 0.15 М NaCl, 10 мМ Na2HP04, 10 мМ Н3В03, 10 мМ лимонную кислоту и 50 мМ Tris, рН 7.0. Все образцы перед измерением инкубировали при 37С в течение 30 минут. Спектры флуоресценции записывали на спектрофлуориметре Hitachi 650-10S (Япония) с термостатируемым кюветным отделением. Концентрации и спектральные характеристики флуорофоров приведены в таблице 3. где Sm и Sw - объемная концентрация соединения, находящегося в мицеллах и растворенного в водной фазе соответственно. Для определения степени солюбилизации использовали несколько методов.
В большинстве случаев интенсивность флуоресценции низкомолекулярного соединения изменяется при увеличении концентрации ПАВ и достигает плато, которое соответствует полной солюбилизации соединения в мицеллах. Если предположить, что концентрация связанного в мицеллах вещества пропорциональна изменению интенсивности флуоресценции (1-1о), а общая концентрация соединения пропорциональна полному изменению флуоресценции от начального значения Ц до значения, соответствующего плато /wa , то а рассчитывается из экспериментальных данных как:
При солюбилизации некоторых соединений в мицеллах происходит не только увеличение квантового выхода, а также меняется форма спектра. Так, например, может наблюдаться два локальных максимума, для которых зависимость отношения интенсивностей флуоресценции от концентрации ПАВ выходит на плато. В этом случае степень солюбилизации можно рассчитать аналогично уравнению (36), в котором вместо интенсивности флуоресценции, используется соотношение интенсивностей на длинах волн, соответствующих локальным максимумам: где (І/Іг) - соотношение пиков при промежуточных концентрациях ПАВ, (h/tyo -отношение пиков в отсутствие ПАВ, (Іі/Цтю - соотношение пиков, соответствующее полной солюбилизации соединения в мицеллах.
Солюбилизация многих низкомолекулярных флуорофоров сопровождается изменением их подвижности, и таким образом приводит к изменению анизотропии флуоресценции, которая, согласно [74], рассчитывается как: где / и 1± - интенсивность флуоресценции, измеренная при параллельной и перпендикулярной ориентации поляризаторов, установленных на пути возбуждающего и испущенного образцом света. Также как и выше описанные изменения интенсивности флуоресценции и соотношения пиков, анизотропия флуоресценции увеличивается с ростом концентрации ПАВ и достигает плато при полной солюбилизации.
Получение рН-градиентных липосом Липосомы получали из цвиттер-ионного липида, яичного фосфатидилхолина методом озвучивания. Из раствора липида в этаноле тщательно удалялся растворитель на роторном вакуумном испарителе "Laborota 4000" ("Heidolph", Германия) под вакуумом при 40С. Полученную пленку липида (2 мг липида) эмульгировали в 1 мл глицинового буфера (0.3 М глицин, гидроксид тетраметиламмония, рН 10.0) и подвергали трем циклам замораживания -оттаивания. Образовавшиеся мультиламеллярные липосомы обрабатывали ультразвуком частоты 22 кГц при мощности 30 Вт в течение 600 с (3 200с) при охлаждении водой на ультразвуковом диспергаторе ("Cole-Parmer Instrument", модель 4710, США). После озвучивания из образца удаляли титановую пыль центрифугированием (5 мин, 12000 об/мин, центрифуга "Eppendorf , США). Размер липосом определяли методом квазиупругого светорассеяния на приборе Autosizer ("Malvern", Англия). Гидродинамический диаметр полученных моноламеллярных липосом составлял 70-100 нм.
Получение липосом, заполненных флуоресцентным рН-индикатором пиранином
Параметры А незначительно коррелирует с Эф (R=0.31), в то время как параметры ВипВ обнаруживают более значительную корреляцию с Бф (R=0.76 и 0.74). Можно предположить, что эта взаимная зависимость 8ф и протоноакцепторной способности объясняется тем, что в исследованном ряду соединений средняя доля гетероатомов, проявляющих способность к образованию водородных связей, почти одинакова. И при этом их количество увеличивается параллельно с ростом размера молекулы, а значит, зависит от объема молекулы (коэффициент корреляции между VIA В равен 0.86) и 8ф. При этом лишь небольшая часть этих функциональных групп проявляет значительную протонодонорную способность, которая в исследованном наборе соединений не зависит от размеров молекулы. Поэтому параметр А практически не зависит от Эф,
Многопараметрические корреляции между \РМщеллы/вода и линейной комбинацией различных дескрипторов, отвечающих гидрофобности исследуемых соединений, их полярности и объему мы искали в виде: где Со - это свободный член, z, - коэффициенты линейного уравнения, показывающие вклады данного типа взаимодействий в сложный процесс, a Z, -молекулярные дескрипторы веществ. Надежность корреляции определяется соотношением между количеством исследованных соединений и количеством дескрипторов, использованных при построении корреляции. Обычно считается, что это соотношение должно превышать, по крайней мере, 5-6. В настоящей работе мы исследовали 2 и 3-параметрические корреляции, используя для их построения данные по 32 соединениям, т.е соотношение количества веществ и дескрипторов составляло 8:1.
Оказалось, что двухпараметрическая корреляция с использованием lgP0K»t/e и TPSA/4Q описывает солюбилизацию в мицеллах плюроника с коэффициентом корреляции около 0.8 при достаточно высоком (24) значении критерия Фишера (уравнение (38)). При этом оказалось, что как гидрофобность соединения, так и площадь его полярной поверхности вносят положительные вклады в наблюдаемый в эксперименте коэффициент распределения. №85/вода=(1.53+0.27)+(0.27+0.04)-І8Рокг/в+(0.18±0.07)ТР8А/40 (38) N=32, R=0.795, F=24
В то же время не очень высокое значение коэффициента корреляции указывают на то, что использованный набор дескрипторов не позволяет описать весь ансамбль межмолекулярных взаимодействий, принимающих участие в солюбилизации соединений в мицеллах плюроников. Относительно высокое значение свободного члена в этом уравнении свидетельствует о большом вкладе факторов, вообще не учитываемых использованным набором дескрипторов.
Включение объема в данное уравнение существенно увеличило коэффициент корреляции до 0.87 (уравнение (39)). При этом оказалось, что объем соединения способствует его солюбилизации в мицеллах, его гидрофобнодть (lgP0Km/e) вносит вдвое меньший вклад, а вклад площади гидрофильной поверхности даже изменил знак, т.е. стал отрицательным. Однако величина свободного члена при этом почти не изменилась. lg m/eodaKl-41±0.22)+(0.12±0.05)-lg?OK e+(0.68±0.18)-r-(0.38+0.16)-rP&4/40 (39) N=32, R=0.872, F=29
Все три дескриптора, использованные в этом уравнении являются комплексными, т.е. зависят от многих типов межмолекулярных взаимодействий. Действительно, \$Р0Кт/в зависит не только от способности соединения к образованию гидрофобных взаимодействий с мицеллами, но также зависит от количества гидрофильных групп в соединении, которые вносят отрицательный вклад в значение этого параметра [194]. Параметр TPSA/40 определяется суммарной площадью, занимаемой протонодонорными и протоноакцепторными группами на поверхности молекулы, а также связан со способностью вещества к диполь-дипольным взаимодействиям. Наконец, суммарный объем солюбилизуемого вещества в использованном ряду соединений связан с гидрофобностыо соединения, поскольку именно варьирование размеров неполярных фрагментов молекулы определяет в основном изменение ее объема. Все эти соображения указывают на то, что данное корреляционное уравнение не может быть использовано для исследования природы сил, существенных для солюбилизации соединений в мицеллах плюроников.
Аналогичной критике может быть подвергнута и корреляция с участием lgP0Km/e в которой параметр TPSA/40 заменяется на комбинацию протонодонорной (А) и протоноакцепторной (В) способностей соединения (уравнение (40)), а также корреляция, в которой протонодонорная и протоноакцепторная способность используютя совместно с объемом (уравнение (41)):
Несмотря на вполне удовлетворительные коэффициенты корреляции, данные зависимости не могут использоваться для физико-химической интерпретации сил, принимающих участие в процессе солюбилизции, вследствие комплексности использованных в этих уравнениях дескрипторов. Помимо этого, обращает на себя внимание и высокое значение свободного члена, в этих уравнениях, свидетельствующее о наличии факторов, неучтенных при построении модели.
Использование площади гидрофобной поверхности S в качестве меры способности вещества к образованию гидрофобных взаимодействий дала наилучшие результаты. Оказалось, что при этом коэффициент корреляции увеличивается, а значение свободного члена уменьшается почти в 10 раз по сравнению с четырьмя приведенными выше корреляционными уравнениями (уравнения (38)-(41)). При этом значение критерия Фишера в этом уравнении возрастает почти вдвое, что указывает на большую надежность данной модели.
Можно полагать, что, в отличие от других дескрипторов, описывающих способность вещества к образованию гидрофобных взаимодействий, параметр Sz не зависит от наличия в молекуле полярных групп и ее дипольного момента. Поэтому этот дескриптор хорошо сочетается в одном корреляционном уравнении с параметрами, учитывающими протоноакцепторную и протонодонорную способность соединений. В пользу его использования говорит также и его ясный физический смысл: согласно известной статистико-термодинамической теории Nemethy и Scheraga, способность вещества к образованию гидрофобных взаимодействий определяется площадью контакта его гидрофобных радикалов с водой [188], а следовательно, площадь гидрофобной поверхности соединения
Определение вкладов различных межмолекулярных сил в солюбилизацию низкомолекулярных соединений в мицеллах плюроника Р85 и Brij 35 с помощью метода ЛСЭ
Зависимость величины кР1к0 от концентрации плюроника показана на рис. 15 для DOX (кривая 1) и DNM (кривая 2). Видно, что наклоны этих кривых, показывающие степень влияния полимера на скорость транспорта антибиотиков, заметно отличаются, причем плюроник ускоряет проникновение DOX в большей степени, чем DNM.
Увеличение скорости транспорта антибиотиков через мембрану в присутствии плюроников может вызываться как воздействием на скорость трансмембранного переноса антибиотиков по механизму распределения-диффузии, так и образованием в мембране каналов, проницаемых для лекарств. Чтобы проверить это предположение мы исследовали влияние плюроника на транспорт протонов через мембрану рН-градиентных липосом. Для этого были получены рН-градиентные липосомы, заполненные гидрофильным рН-индикатором пиранином, флуоресценция которого зависит от кислотности его окружения. Оказалось, что добавление плюроника к таким липосомам практически не изменяло флуоресценцию пиранина (рис. 16). При этом разрушение везикул под действием классического ПАВ Triton Х-100 приводило к моментальному повышению флуоресценции пиранина, что вызывалось повышением рН его микроокружения при переносе в более щелочную внешнюю среду.
Таким образом, плюроник не образует в мембране каналы, проницаемые для протонов и компнентов буфера. Поэтому можно предполагать, что и ускорение транспорта антибиотиков в его присутствии обусловлено не образованием каналов, а проникновением по механизму растворения-диффузии в соответствии со схемой, показанной на рис. 5, причем полимер преимущественно воздействует на коэффициент проницаемости лекарства.
Известно, что коэффициент проницаемости большинства соединений растет с увеличением температуры, что, как правило, описывается прямой в координатах Аррениуса. Варьирование температуры показало, что константы скорости транспорта DOX (рис. 17(a), кривая 7) и DNM (рис. 17(6), кривая 7) увеличивались с температурой, и наблюдаемая энергия активации транспорта составила 18.5Ю.5 ккал/моль для DOX и 13.6±0.5 ккал/моль - для DNM. Энергия активации транспорта DOX несколько меньше данных, приведенных в работе Harrigan [128] (28 ккал/моль), что, по всей видимости, объясняется повышенной степенью ненасыщенности липида, использованного в настоящей работе. Более высокая , энергия активации транспорта DOX, по всей видимости, объясняется наличием дополнительной по сравнению с DNM гидроксильной группы в антрациклиновой части молекулы. Можно предполагать, что именно эта группа ответственна за увеличение энергии активации транспорта соединения через липидный бислой.
Добавление плюроника практически не влияло на энергию активации транспорта DOX (рис. 17(a), кривые 2 и 3) и лишь незначительно увеличивало энергию активации транспорта DNM (рис. 17(6), кривые 2 и 3). Поскольку константа скорости, измеряемая в эксперименте, не является элементарной константой и зависит от многих параметров системы, мы полагаем, что анализ ее температурной зависимости не может дать информацию о механизме эффекта плюроника. В то же время само по себе отсутствие влияния температуры на наблюдаемый в эксперименте эффект полимера дает удобный экспериментальный инструмент, поскольку позволяет манипулировать температурой для того, чтобы добиться удобной с практической точки зрения скорости транспорта соединения.
Таким образом, сравнение действия плюроника на транспорт двух структурно сходных антрациклиновых антибиотиков показывает, что вызываемое полимером ускорение транспорта зависит от структуры переносимого через мембрану соединения, причем введение гидроксильной группы в молекулу вещества приводит к увеличению вызываемого плюроником эффекта. Введение даже одной гидроксильной группы изменяет не только способность соединения образовывать водородные связи, но влияет на объем соединения, его дипольный момент, поляризуемость, гидрофобность и множество других параметров. Поэтому в дальнейшем мы исследовали роль структуры переносимого через мембрану вещества на более широком наборе слабых кислот и оснований и использовали метод многопараметрических корреляций для выявления роли различных типов межмолекулярных взаимодействий в вызываемом плюроником эффекте ускорения мембранного транспорта. Для этих целей мы использовали различные кислоты и основания, не обладающие характерной флуоресценцией в видимой части спектра.
