Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Влияние ионного состава раствора на структуру и свойства молекулы ДНК 12
1.1. Структурная организация молекулы ДНК 12
1.2. Процессы протонирования и депротонирования в растворах ДНК 17
1.3. Полиэлектролитные свойства ДНК при ее взаимодействии с ионами металлов 22
Глава 2. Взаимодействие молекулы ДНК с биологически активными многозарядными и комплексными ионами 35
2.1. Конденсация ДНК, вызванная ее взаимодействием с многовалентными ионами 35
2.2. Взаимодействие молекулы ДНК с координационными соединениями платины 45
Глава 3 Методы исследования конформации макромолекул и их комплексов с биологически активными соединениями 55
3.1. Некоторые понятия конформационной статистики макромолекул 55
3.2. Элементы теории вязкости 59
3.3. Основы теории двойного лучепреломления в потоке и его измерение 62
3.4. Спектральные методы 67
3.5. Статическое и динамическое рассеяние света 69
3.6. Флуоресцентная и атомная силовая микроскопия 75
3.7. Характеристика изучаемых объектов 77
Глава 4. Сравнительный анализ конформационных изменений ДНК в растворе при ее взаимодействии с ионами различной структуры и валентности 81
4.1. Влияние ионного состава и рН раствора на конформацию ДНК 79
4.2. Сопоставление влияния двух- и трехвалентных ионов металлов на конформацию молекулы ДНК в растворе 109
4.3. Взаимодействие молекулы ДНК с синтетическими полимерами в растворе 151
Глава 5. Комплексы молекулы ДНК с соединениями платины, проявляющими биологическую активность 171
5.1. Изучение влияния состава первой координационной сферы платины на характер ее взаимодействия с молекулой ДНК 171
5.2. Влияние диметилсульфоксида на взаимодействие соединений платины с молекулой ДНК 200
5.3. Комплексообразование ДНК с моноядерными соединениями двухвалентной платины, содержащими сложные лиганды 209
5.4. Взаимодействия молекулы ДНК с биядерными соединениями двухвалентной платины 225
5.5. Сравнение взаимодействия молекулы ДНК с моно- и биядерными соединениями двух- и четырехвалентной платины, содержащими теофилин 236
Заключение 243
Список цитируемой литературы 247
- Полиэлектролитные свойства ДНК при ее взаимодействии с ионами металлов
- Взаимодействие молекулы ДНК с координационными соединениями платины
- Основы теории двойного лучепреломления в потоке и его измерение
- Сопоставление влияния двух- и трехвалентных ионов металлов на конформацию молекулы ДНК в растворе
Введение к работе
Интерес к изучению процессов, протекающих в растворах полиэлектролитов, обусловлен широким использованием заряженных макромолекул в различных областях науки и промышленных технологиях. При использовании полиэлектролитов существенную роль играют их конформационные свойства, которые определяются плотностью заряда, структурой, молекулярной массой и жесткостью полимеров, а также природой и составом растворителя. Изучение конформации заряженных макромолекул при их взаимодействии с малыми лигандами может способствовать поиску способа направленного влияния на свойства полимеров и их комплексов. Такие исследования важны и для решения проблемы направленного синтеза новых низкомолекулярных соединений, находящих применение в различных отраслях народного хозяйства, в том числе в фармакологии и медицине.
Исследование структуры и свойств биополимеров является важнейшей задачей науки о высокомолекулярных соединениях. Все биологические макромолекулы являются полиионами. Среди них особое место занимает молекула ДНК, обеспечивающая хранение и передачу генетической информации живых организмов. Являясь чрезвьиаино жестким и сильно заряженным полимером, она представляет собой уникальный объект исследования не только из-за высокой биологической ценности. В водном растворе высокомолекулярная двуспиральная ДНК приобретает конформацию статистического клубка, в то время как в ядре клетки она находится в компактном состоянии, которое обеспечивается, в частности, ее взаимодействием с катионными группами гистонов и ионами металлов, подавляющими электростатическое расталкивание заряженных групп макромолекулы. Однако в некоторых биологических процессах происходит разворачивание ДНК. Способность ДНК обратимо переходить в компактное состояние с сохранением своей вторичной структуры является важнейшим свойством, необходимым для ее функционирования. Известно, что решающая роль при этом принадлежит электростатическим взаимодействиям. В связи с этим исследование комплексообразования молекулы ДНК с заряженными биологически активными соединениями различной природы на уровне модельных систем (водных растворов малой концентрации) представляет интерес как для понимания конформационных превращений макромолекулы в различных биологических процессах, так и для создания новых биологически активных препаратов. Вместе с тем, такие исследования позволяют уйти от рассмотрения взаимодействий только с точки зрения их биологической значимости. Водно-солевые растворы высокомолекулярной природной ДНК являются типичными полиэлектролитными системами, в которых конформация макромолекул зависит от степени экранировки ионогенных групп и состава растворителя. Таким образом, изучение взаимодействия ДНК с заряженными соединениями различной природы и валентности полезно не только для понимания процессов, протекающих в биологических структурах с участием нуклеиновых кислот, но и для всестороннего исследования полиэлектролитных свойств жестких полимеров.
Практически во всех процессах, протекающих с участием нуклеиновых кислот, участвуют ионы металлов. Их роль зависит от природы, валентности и содержания в клетке. Они выполняют структурообразующие функции, являются посредниками при образовании контактов ДНК с ядерными белками и ферментами, регулируют транспорт веществ. Однако влияние ионов металлов на биологические процессы не ограничивается
только участием в нормальном функционировании клетки. Ионы некоторых двухвалентных металлов могут оказывать канцерогенное действие на живой организм. Они участвуют и в процессе апоптоза («осознанной» гибели клетки), ключевым событием которого является повреждение ДНК. Использование модельных систем может служить простым и эффективным способом изучения влияния ионов различных металлов на генетический материал клетки.
В диссертационной работе проводится сравнение конформационных изменений ДНК при ее взаимодействии с ионами металлов разной валентности. При этом новые данные получены как для области больших концентраций одновалентных противоионов, так и при использовании двух- и трехвалентных ионов металлов. Благодаря привлечению взаимодополняющих методов исследования, а также разработке оригинальных подходов к изучению взаимодействия ион-ДНК, в работе получены экспериментальные данные, позволяющие выявить характерные особенности конформационных изменений макромолекулы при ее взаимодействии с заряженными соединениями различной структуры и валентности.
В последнее время в связи с развитием новых технологий возникла необходимость направленного внедрения заданного генетического материала в клетки-мишени. В связи с этим большой интерес привлекает изучение комплексов ДНК с различными агентами, вызывающими обратимую компактизацию макромолекулы в растворе. Помимо компактного состояния, для эффективного использования таких комплексов необходимо, чтобы компактизация носила обратимый характер, а молекула ДНК была надежно защищена от действия агрессивных факторов. На практике для создания таких систем используют липосомы, инактивированные вирусные частицы, полипептиды и синтетические поликатионы. Последние имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с другими агентами. Они не являются биологическими объектами, поэтому при их использовании меньше вероятность иммунологических реакций. Созданные на их основе генные векторы существенно дешевле систем, содержащих липосомы или оболочки вирусов. Наконец, для синтетических полимеров всегда существует возможность их модификации путем направленного синтеза новых соединений. Для успешного применения таких систем необходимы исчерпывающие знания о конформационных возможностях ДНК, о характере ее взаимодействия с заряженными агентами. В работе исследуется компактизация ДНК при ее взаимодействии с ионами трехвалентных металлов и поликатионами. Проводится сопоставление влияния многозарядных «точечных» ионов и клубкообразных полиионов на конформацию ДНК в растворе.
Возможность влияния на протекающие в биологических системах процессы путем введения определенных агентов, взаимодействующих с ДНК, расширяет перспективы создания новых лекарственных форм. Заметим, что основной принцип действия используемых в настоящее время в практической медицине противоопухолевых препаратов основан на их связывании с молекулой ДНК в клетке. Для этого также необходимы широкие знания о взаимодействии лиганд - ДНК.
Среди биологически активных соединений, используемых в работе, особое место занимают противоопухолевые препараты на основе платины. Эти неорганические комплексные соединения достаточно легко синтезируются и применяются при лечении целого ряда опухолей. Они просты в использовании, хотя и являются достаточно дорогостоящими. Наиболее известным представителем таких соединений является цис-диаминодихлорплатина (цис-ДДП). Согласно литературным данным, эффективность ее
действия при лечении ряда опухолей чрезвычайно велика. К сожалению, достаточно серьезные побочные эффекты, неизбирательность действия и развитие сопротивляемости организмов к этому препарату значительно ограничивают его применение. В связи с этим поиск аналогов цис-ДДП, не уступающих ей в активности и не обладающих ее отрицательными качествами, является весьма актуальной задачей. В настоящее время установлено, что основной «мишенью» действия противоопухолевых препаратов платины в клетке является молекула ДНК. Образование комплексов платины с ДНК препятствует делению клетки и тормозит развитие опухоли. Изучение комплексообразования молекулы ДНК с координационными соединениями платины в растворе может служить способом исследования молекулярного механизма действия новых препаратов. В процессе таких исследований по конформационным изменениям молекулы ДНК можно следить за характером взаимодействия макромолекулы с малыми лигандами. Сравнение данных, полученных для известных биологически активных соединений и новых аналогов, может способствовать предварительному отбору препаратов, минуя трудоемкую и дорогую процедуру биологических тестов. Использование физико-химических методов для исследования взаимодействия соединений платины с молекулой ДНК на уровне модельных систем может дать ценную информацию о влиянии стерических и структурных особенностей платиновых комплексов на их биологическую активность. Такой подход разрабатывается в настоящей работе.
Сказанное выше свидетельствует об актуальности темы предлагаемой диссертационной работы. Практическая значимость работы определяется возможностью использования результатов и выводов при направленном синтезе новых биологически активных соединений, а также при исследовании процессов, протекающих с участием полиэлектролитов различной природы.
Природная ДНК при нейтральных рН является жесткоцепным полианионом с достаточно консервативной вторичной структурой. Вариация рН среды может привести к существенному изменению зарядовых и конформационных свойств макромолекулы. Существует область рН, границы которой зависят от ионной силы раствора, в которой ДНК приобретает полиамфолитные свойства при сохранении двуспиральной структуры. С другой стороны, в области щелочных рН наблюдается увеличение плотности и без того значительного отрицательного заряда макромолекулы. При щелочной или кислотной денатурации ДНК, которая наблюдается при более значительном изменении рН раствора, происходит катастрофическое падение ее жесткости. Этот процесс сопровождается уменьшением гидрофильности ДНК, так как обычно расположенные внутри двойной спирали гидрофобные азотистые основания при этом вступают в контакт с молекулами воды вследствие нарушения водородных связей, обеспечивающих стабильность вторичной структуры макромолекулы. Сказанное выше свидетельствует о том, что молекула ДНК представляет собой уникальный объект, зарядовые свойства, жесткость, гидрофильность которого можно достаточно легко варьировать при изменении ионной силы, кислотности и состава растворителя. Таким образом, изучая взаимодействие молекулы ДНК с выбранными соединениями при вариации ионной силы и рН раствора, состава растворителя, можно получить дополнительную информацию о структуре и свойствах образующихся комплексов. В работе при исследовании комплексообразования ДНК с различными соединениями используется протонированная форма макромолекулы. Такой подход является оригинальным. В связи с этим проводится подробное исследование влияния рН на конформацию двуспиральной ДНК в растворе.
Для решения поставленных в работе задач был разработан также способ исследования механизма действия ряда биологически активных соединений с использованием конкурирующих агентов, заключающийся в изучении сложных систем -водных растворов ДНК, содержащих исследуемое вещество и различные низкомолекулярные добавки, взаимодействие которых с молекулой ДНК известно. Изучение конкуренции за место связывания в таких системах дает информацию об участии тех или иных групп макромолекулы в образовании комплекса и характере взаимодействия компонентов.
Цель диссертационной работы состояла в анализе конформационных изменений высокомолекулярной природной ДНК ее при взаимодействии с заряженными соединениями различной структуры и состава в растворе для определения молекулярного механизма действия ряда биологически активных соединений, образующих комплексы с ДНК с участием электростатических взаимодействий, а также в поиске способа предварительного отбора новых препаратов на основании анализа конформационных изменений ДНК при комплексообразовании в модельных системах (разбавленных водно-солевых растворах).
Заметим, что наиболее серьезные конформационные изменения наблюдаются при нарушении вторичной структуры ДНК в результате кислотной, щелочной или тепловой денатурации (плавление). Такой конформационный переход типа спираль-клубок достаточно хорошо изучен и его исследование не входит в круг задач, решаемых в данной работе. Хотя многие из используемых соединений при определенных условиях могут дестабилизировать двойную спираль и вызывать нарушение вторичной структуры ДНК, нас в первую очередь интересовали конформационные изменения двуспиральной ДНК в процессе изучаемого взаимодействия. Для этого мы осуществляли контроль за состоянием вторичной структуры макромолекулы с помощью спектральных методов.
Задачи, решаемые в диссертационной работе.
Исследование конформационных изменений молекулы ДНК в процессе ее взаимодействия с ионами металлов, комплексными ионами и поликатионами при изменении концентрации и заряда противоионов.
Определение характера и позиции связывания используемых соединений с ДНК, анализ влияния ионной силы и рН раствора на процесс комплексообразования.
Рассмотрение влияния изменения плотности заряда макромолекулы в результате протонирования и депротонирования на ее полиэлектролитное набухание и термодинамическую жесткость.
Изучение обратимой компактизации ДНК точечными многовалентными ионами и синтетическими поликатионами. Исследование состояния вторичной структуры ДНК при ее конденсации в растворе.
Сравнительный анализ взаимодействия ДНК с координационными соединениями платины, проявляющими противоопухолевую активность, их неактивными аналогами и новыми соединениями, синтезированными в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии для выявления возможной корреляции между их структурой, биологической активностью и характером влияния на конформацию ДНК в растворе.
Научная новизна работы. Следует отметить, что, несмотря на обширную литературу, посвященную исследованию полиэлектролитных свойств ДНК, необходимые для данного исследования сведения о поведении макромолекулы в условиях избытка противоионов, о влиянии двухвалентных и трехвалентных противоионов на конформационные параметры ДНК либо были противоречивы, либо отсутствовали. Полученные в работе данные в ряде случаев позволили уточнить существующие представления, а также обнаружить новые особенности конформационных изменений ДНК при ее взаимодействии с малыми лигандами. Впервые изучена оптическая анизотропия макромолекулы при значительных концентрациях противоионов, Впервые проведено исследование влияния протонирования и депротонирования на объем и термодинамическую жесткость двуспиральной ДНК. Впервые получены данные, свидетельствующие о внутримолекулярном структурировании ДНК при малых концентрациях точечных многовалентных ионов. Являются оригинальными и подходы, разработанные для изучения комплексообразования (использование протонированной ДНК, исследование сложных систем, содержащих конкурирующие за место связывания агенты). Кроме того, все результаты, связанные с изучением комплексов ДНК с координационными соединениями платины, были получены впервые. В работе использовали новые препараты, синтезированные в Санкт- Петербургской химико-фармацевтической академии. Для известных противоопухолевых препаратов впервые получены данные о гидродинамических свойствах и термодинамической жесткости ДНК в процессе взаимодействия.
Достоверность полученных результатов определяется использованием взаимодополняющих методов исследования третичной и вторичной структуры макромолекул. Полученные различными методами данные хорошо согласуются между собой и не противоречат существующим представлениям. Выводы основаны на результатах, полученных неоднократно. Фиксируемые изменения параметров находятся за пределами ошибки измерений. Кроме того, направленный подбор соединений и условий проведения экспериментов позволил наиболее полно раскрыть особенности конформационных изменений ДНК в процессе изучаемых взаимодействий. Важной особенностью подобных исследований является наличие таких сложностей, как сохранение изоионности при концентрационных исследованиях разбавленных растворов, а в ряде случаев сохранение молекулярности растворов и стабильности систем. В работе выполнены методические разработки, позволяющие преодолеть эти проблемы.
Хотя высокомолекулярная природная ДНК, являющаяся основным объектом исследования в предлагаемой работе, обладает чрезвычайно большой персистентной длиной, мы не можем пренебрегать объемными эффектами вследствие существенного полиэлектролитного набухания даже при умеренных ионных силах раствора. Разделение ближних и дальних взаимодействий при исследовании конформации заряженных макромолекул является обычно довольно сложной задачей. Использование сочетания методов вискозиметрии и динамического двойного лучепреломления дает возможность контроля над ближними взаимодействиями в растворах ДНК. При конформационных исследованиях необходимо располагать сведениями и о вторичной структуре молекулы ДНК, которые можно получить с помощью используемых в работе спектральных методов (кругового дихроизма, УФ- спектрофотометрии). Для некоторых систем были
использованы также методы наблюдения за индивидуальными молекулами -флуоресцентная и атомная силовая микроскопия, а также статическое и динамическое светорассеяние. Необходимо отметить также возможность получения дополнительных сведений при проведении сравнительного анализа результатов, полученных при вариации ионного состава среды (изменение концентрации низкомолекулярного поддерживающего электролита в широких пределах, увеличение или понижение кислотности среды, вызывающее изменение плотности заряда на макромолекулах и др.)
Все экспериментальные результаты, представленные в работе, получены соискателем лично или совместно со студентами и аспирантами. Синтез и исследование структуры биологически активных соединений проводили сотрудники Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии. Получение и характеристику синтетических полимеров осуществляли сотрудники Института высокомолекулярных соединений РАН.
Таким образом, в работе проведен анализ процесса образования, структуры и устойчивости биологически значимых комплексов природной ДНК с заряженными соединениями. Проводится также исследование влияния ионного состава и рН среды, заряда связывающегося соединения на комплексообразование, выявление общих для полиионов свойств, проявляющихся при их взаимодействии с противоположно заряженными агентами.
Результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях и симпозиумах:
XII международном биофизическом конгрессе (Амстердам, 1996), II европейском
биофизическом конгрессе (Орлеан, 1997), II симпозиуме по молекулярной структуре
(Вена, 1997), международном симпозиуме по коллоидной и молекулярной
электрооптике (Санкт-Петербург, 1997), семинаре «Понимание полиэлектролитов»
(Майнц, 1997), международной конференции "Фундаментальные проблемы физики
полимеров" (Москва, 1997), 2 международной конференции «Химия
высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» (С.-Петербург, 1998), конференции «Человек-лекарство» (Москва, РАМН, 1998), международном симпозиуме «Физика биологических систем» (Киев, 1998), II международном симпозиуме «Полиэлектролиты» (Инаяма, Япония, 1998), международной конференции "Фармацея в XXI веке" (Санкт-Петербург, 1999), 2 съезде биофизиков России (Москва, 1999), XIII международном биофизическом симпозиуме (Дели, 1999) Международной конференции "Конформация, модификация и узнавание ДНК в биомедицине (Брно, 2000), III европейском биофизическом конгрессе (Мюнхен, 2000), XVII международном Черняевском совещании по химии, анализу и технологии платиновых металлов (Москва, 2001), XIV семинаре по межмолекулярному взаимодействию и конформациям макромолекул (Иваново, 2001), II, III и IV международных симпозиумах «Молекулярный порядок и подвижность в полимерных системах» (1996, 1999, 2002, Санкт-Петербург).
Основные результаты диссертации опубликованы в работах:
1. Касьяненко Н.А., Семенова О.Ю., Кленин СИ., Быкова Е.Н., Медведев Г.П., Аветисян П.К., Фрисман Э.В. Исследование молекулярных характеристик
полимерных флокулянтов в растворах разной ионной силы. Высокомолекулярные Соединения 1985, т. А27, №5, с. 1073-1078.
Касьяненко Н.А., Бартошевич С.Ф., Фрисман Э. В Исследование влияния рН среды на конформацию молекулы ДНК. Молекулярная биология, 1985, т. 19, №5, с. 13 86-1393.
Касьяненко Н.А., Фрисман Э.В., Кленин СИ., Быкова Е.Н., Кочеткова И.С. Исследование влияния ионной силы и рН среды на конформацию полимерных флокулянтов Высокомолекулярные соединения. 1987, Т.А29, №6, с.1129-1135
Касьяненко Н.А., Дьяконова Н.Е., Фрисман Э.В. Исследование молекулярного механизма взаимодействия ДНК с двухвалентными ионами металлов. Молекулярная биология. 1989, т.23, №4, с.975-982
Фрисман Э.В., Касьяненко Н.А. Гидродинамическое и оптическое поведение молекулы ДНК в области больших ионных сил. Молекулярная биология. 1990, т.24, №2,с.318-327.
Kasyanenko N. A., Frisman E.V. DNA conformation in solutions of high ionic strength. 2 World Congress of Theoretical Organic Chemists 1990, Toronto p.CA-21
Касьяненко H.A., Валуева СВ., Сморыго Н.А., Дьяченко С.А., Фрисман Э.В. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины 1. Взаимодействие цис-ДДП с молекулой ДНК. Молекулярная биология, 1995, т.29, №2, с.345-353
Касьяненко Н.А. Дарымов М.А.., Сморыго Н.А., Дьяченко СА. Фрисман Э.В. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины П. Влияние природы и расположения лигандов в первой координационной сфере платины. Молекулярная биология, 1995, т.29, №3, с.585-594.
Kasyanenko N. A., Prokhorova S.A., Frisman E.V. DNA complexes with Fe3+ and Pt (II) Compounds. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1996, v.65, p. 142
Kasyanenko N. A., Haya E.E.F., Sudakova S. S., Prokhorova S.A. A comparative study of DNA interaction with mono-, di-, and trivalent metal ions and coordination compounds of Pt(II) and Co(III). European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 1997, 26/1, p.50.
Kasyanenko N. A., Diachenko S.A., Smorygo N.A., Ivin B. A. Interaction of DNA with coordination compounds of Pt(II) and Co(III). In Proceedings of the 2 Int. Symp. On Molecular Struct. Biol., 1997, Vienna, p.128.
Kasyanenko N. A, Karymov M. A., Kokareva G.V. DNA conformation at high concentration of counterions. Understanding of Polyelectrolytes -Int. Symp., Mainz, Germany, 1997, p. 15
Касьяненко H.A., Прохорова С А., Николенко O.B., Дьяченко С.А., Сморыго Н.А. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины III. Соединения платины с двумя пиримидиновыми лигандами. Молекулярная биология 1997, т. 31, №2,299-304
Kasyanenko N. A, Nazarova O.V., Panarin E.F. Zanina A.V. DNA interaction with different counterions and complex ions in solution. II Symposium on Polyelectrolytes 1998 Abstracts. Inyama, Japan, Nagoya Univ. COOP p.44.
Kasyanenko N. A., Arikainen N., Frisman E. Investigation of DNA Complexes with Iron Ions in Solution. Biophysical Chemistry. 1998, v.70, p.93-100.
Kasyanenko N. A , Prokhorova S., Haya E.E.F., Sudakova S. Interaction of protonated DNA with trans-diclorodiammineplatinum(II) Colloids and Surfaces A - Physicochemical and Engineering Aspects 148/1-2, (1999) p. 121-128
Kasyanenko N. A., Zanina A., Plotnikova L., Simonenkov A., Defrenne S., Nazarova O. Study of the DNA Packing Caused by Charged Compounds of Different Nature in solution. Macromolecular. Symp. 1998, v.l36,p.25-31.
Kasyanenko N. A., Nazarova O., Panarin E., Zanina A. Study of the DNA Packing Caused by Multivalent Ions. In: Polyelectrolytes. Ed. Ichiro Noda, Etsuo Kokufuta,Yamada Sci. Foundation, Osaka, Japan,(1999) p. 153-155
Kasyanenko N. A., Haya E.E.F., Bogdanov A., Zanina A. DNA Conformation in Complexes with the Coordination Compounds. Journal of Biosciences (1999) v. 24, s.l,p. 90.
Kasyanenko N. A., Zanina A., Nazarova O., Panarin E. DNA Interaction with Complex Ions in Solution. Langmuir, (1999) v.15, n 23, p.7912-7917
Kasyanenko N. A., Haya E.F., Bogdanov A., Yakovlev K. Studies of cis- and trans- DDP competition for the binding position on DNA In: International Conference on DNA Conformation, Modification and Recognition in Biomedicine Brno, July 2-5,2000, p.24
Kasyanenko N. A., Kopyshev A. M., Obuhova O. N., Nazarova O. V., Panarin E. F. DNA Interaction with Synthetic Polycations in a Solution. European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 2000, 29/4-5, p.249, 254.
Касьяненко H.A., Плотникова Л.В. Изучение взаимодействия молекулы ДНК с ионами железа в присутствии двухвалентного марганца Вестник Санкт-Петербургского университета. Сер. 4. 2001, вып. 1. (N 24) Физика стр. 3-10
Касьяненко Н.А., Обухова О.Н., Назарова О.В., Панарин Е.Ф. Комплексы ДНК с* полиаллиламином в растворе. Журнал физической химии (2002), т.76, с. 2036-2042.
Касьяненко Н.А., Айа Э.Э.Ф., Богданов А.А., Космотынская Ю.В., Яковлев К.И < Сравнение комплексообразования ДНК с противоопухолевым препаратом цис-ДДП и биядерным соединением двухвалентной платины, содержащим пиразин. Молекулярная биология (2002) т.36, с. 1-8.
Касьяненко Н.А., Богданов А.А., Дефрене С. Взаимодействие молекулы ДНК с координационными соединениями платины и кобальта в растворе Биофизика (2002) т.47, вып.З, 449-452.
Касьяненко Н.А., Богданов А.А., Космотынская Ю.В., Спевак В.Н. Комплексы ДНК с соединениями двухвалентной платины в присутствии диметилсульфоксида. Журн. Физ. Химии (2002), т.76, с.2043-2048.
Касьяненко Н.А., Плотникова Л.В., Занина А.В., Андержанов А.Ш., Дефрене С. Изучение комплексов ДНК с трехвалентными ионами металлов в присутствии ионов марганца. Биофизика (2002) т.47, вып.З, 433-438.
Kasyanenko N.A., Obukhova О. N, Baibak N. A., Nazarova О. V. Panarin Е. F. Investigation of DNA interaction with synthetic polymers in solution in the presence of metal ions. In.: Book of Abstracts of 4 International Symposium Molecular Order and Mobility in Polymer Systems, St.-Petersburg, (2002), p.214.
Полиэлектролитные свойства ДНК при ее взаимодействии с ионами металлов
Согласно Маннингу, фракция конденсированных противоионов, обеспечивающих экранировку отрицательного заряда макромолекулы, остается практически неизменной в широкой области ионных сил. Из сказанного выше следует, что для корректного определения ионной силы растворов полиэлектролитов необходимо знать концентрации всех свободных малых ионов в растворе. В общем случае эта задача достаточно сложна. Тем не менее, при использовании малых концентраций ДНК (С 0,02 %) мы можем пренебречь вкладом в ионную силу фракции собственных противоионов и определять ионную силу через концентрацию введенной соли (NaCl). Это справедливо в области концентраций соли, превышающих 0,003 М NaCl. По характеру взаимодействия с ДНК различают два возможных способа связывания противоионов: специфическое, при котором катион образует с макромолекулой относительно долгоживущий комплекс, и неспецифическое, при котором ионы удерживаются вблизи ионогенных групп полииона, не теряя при этом своей подвижности и формируя ионную атмосферу. Неспецифическое связывание характерно для одновалентных ионов, т.к. время их жизни вблизи ДНК сравнимо со временем обмена гидратной воды, а их радиус с учетом гидратной оболочки практически равен бьеррумовской длине (порядка 7 А), т.о. при сближении на минимальное расстояние энергия кулоновского взаимодействия имеет величину порядка тепловой. Специфическое связывание одновалентных противоионов с ДНК может реализоваться либо при существенном уменьшении диэлектрической проницаемости среды (в спирто-водных смесях), либо при понижении влажности, либо при наличии дополнительных факторов, стабилизирующих взаимодействие. Для двухвалентных ионов также характерно формирование ионной атмосферы вокруг противоиона (неспецифическое связывание), однако, наличие большего, заряда обеспечивает возможность реализации специфического связывания с ДНК. Если связывание иона с ДНК осуществляется через молекулу воды, говорят о «внешнесферном» комплексе, если реализуется непосредственное связывание иона с ионогенной группой макромолекулы, говорят о «внутрисферном» комплексе. Доля последних для двухвалентных ионов невелика и по оценкам Гранота и Кернса [46] не превышает 5-7 % для ионов Mg2+ и Мп2+. Таким образом, в растворе двухвалентные ионы могут участвовать как в специфическом, так и в неспецифическом связывании с ДНК. В силу этого в растворе устанавливается равновесие между свободными ионами и ионами, связанными с ДНК специфически. Это обстоятельство затрудняет осуществление концентрационных исследований комплексов ДНК с двухвалентными ионами и требует дополнительных мер для сохранения постоянства числа свободных противоионов в растворе. Для одновалентных противоионов подобная проблема возникает лишь в области весьма малых ионных сил, когда количество введенных противоионов сравнимо с концентрацией собственных противоионов макромолекулы. В последнем случае для соблюдения изоионности был разработан специальный метод [47], позволяющий контролировать ионную силу раствора. Возможно также использование диализа растворов против большого объема растворителя с заданной концентрацией одно- или двухвалентных ионов. В отличие от двухвалентных противоионов, для трехвалентных энергия их электростатического связывания с ДНК достаточно велика. Заметим, что это относится к случаю, когда заряд сосредоточен на одном атоме. Из сказанного выше ясно, что рассмотренная классификация способов связывания (неспецифическое -специфическое, внутрисферное - внешнесферное) является самой общей и относится только к характеру взаимодействия ион - ДНК. Обычно ионы могут участвовать во всех типах комплексов, но для одновалентных ионов, например, равновесие сдвинуто в сторону атмосферного связывания, для двухвалентных - специфического (и внешнесферного). Следует отметить, что при специфическом связывании помимо кулоновских сил при образовании комплексов возможны дополнительные факторы, стабилизирующие комплекс. После сближения групп в результате электростатического взаимодействия на малых расстояниях существенную роль могут играть, например, водородные связи, Ван-дер Ваальсовы силы и др. Нуклеиновые кислоты содержат четыре функциональные группы, с которыми могут связываться ионы металлов: отрицательно заряженные атомы кислорода фосфатных групп, гидроксильные группы Сахаров (только у РНК), эндоцикличкские атомы азота и экзоциклические кетогруппы оснований. Одновалентные противоионы взаимодействуют с ДНК, главным образом, по фосфатным группам, которые находятся на поверхности спирали и доступны для взаимодействия с любыми заряженными лигандами. В ряде работ авторы отмечают, что ионы Ag+ и Hg+ , а также двухвалентные ионы переходных металлов (Mn2+, Zn2+, Ni2+, Cu2+) помимо фосфатных групп образуют комплексы и с основаниями нуклеиновых кислот, в то время как большинство ионов щелочных (Na+, Li+, К+) и щелочноземельных металлов (Mg2+, Са2+, Ва2+) в водно-солевых растворах взаимодействует преимущественно с кислородами фосфатных групп двуспиральной ДНК [48-50]. Однако существует мнение, что магний, например, связывается с азотистыми основаниями двуспиральной ДНК [50,68,95]. Недавние исследования, выполненные методом рентгеноструктурного анализа (с использованием додекамеров и разрешением порядка 1,5 А), показывает, что в кристаллических структурах ионы Мп2+ связываются с участками ДНК, богатыми аденином, со стороны малой бороздки [51] (в А-Т богатых участках ширина малой бороздки несколько шире среднего значения, что способствует внедрению ионов). Существуют данные о внедрении в малую бороздку ионов щелочных металлов [52], что в какой-то мере противоречит сложившимся представлениям об их поведении вблизи ДНК. Вместе с тем, существует мнение, что ионы Mg2+ и Са2+ локализуясь в большой бороздке ДНК, вызывают изгиб спирали в сторону этой бороздки [53, 54], что также не согласуется с существующими данными о неизменности вторичной структуры ДНК при подобных взаимодействиях. Тип связывания ионов металлов с молекулой ДНК достаточно хорошо определяется на основе анализа экспериментальных данных по выявлению специфичности ионов к нуклеотидной последовательности ДНК и их влиянию на термостабильность макромолекулы. Хотя принято считать, что ионы Na+, Li+, К+ взаимодействуют с макромолекулой, образуя диффузное облако противоионов, ряд авторов отмечает, что они проявляют специфичность к структуре ДНК [55]. Ионы Na+, например, лучше ионов К+ стабилизируют гуаниновый квадруплекс и индуцируют его образование [56]. Одновалентные ионы специфично влияют на В-А конформационный переход. Ионы Na+ сдвигает равновесие в сторону А- формы, a Li+, Cs+, Са2+ стабилизируют В-конформацию ДНК [57]. Это подтверждают и результаты, полученные методом ЯМР [58]. При увеличении энергии связывания ионов щелочных металлов с ДНК (например, под действием этанола) специфичность ионов проявляется в разном "закручивающем эффекте": Li+ Na+ К+ Rb+ Cs+ [59]. Температура плавления ДНК из Strept. Chicom. уменьшается в 0,1 М растворе при рН=7 согласно ряду: Li+ Na+ К+ Rb+ Cs+ [60]. Ширина перехода спираль-клубок также зависит от типа используемого иона и уменьшается в последовательности: Na+ NH4+ К+ Rb+ Li+ [61]. Двойная спираль литиевой соли ДНК более стабильна, чем натриевой [62]. Катионы по-разному влияют и на закручивание суперспиральной ДНК: NH4+ Li+ К+ Na+ [63].
Взаимодействие молекулы ДНК с координационными соединениями платины
В растворе линейная природная высокомолекулярная ДНК имеет конформацию сильно набухшего клубка. В системах in vivo вирусная ДНК представляет собой плотно упакованную структуру, в сотни раз более компактную, чем в растворе. ДНК в бактериальных клетках и ядрах эукариот также находится в компактном и достаточно упорядоченном состоянии. Подобные конформации ДНК in vivo в значительной степени поддерживаются многовалентными катионами и положительно заряженными белками. Они нейтрализуют громадный отрицательный заряд ДНК на фосфатах, уравновешивая кулоновские силы, препятствующие упаковке и обеспечивают конформационные изменения, приводящие к компактной форме. В ряде случаев высокомолекулярная ДНК в растворе может под действием многозарядных ионов перейти в так называемое конденсированное состояние с образованием компактных структур определенной морфологии. В отличие от компактизации, под которой подразумевают любое существенное уменьшение объема макромолекулы, конденсация - это процесс формирования отдельных дискретных частиц определенного размера и формы [162-165]. Следует заметить, что понятие конденсации в литературе применяется и по отношению к противоионам, «сгущающимся» вокруг полиионов в растворах полиэлектролитов. Причем если в первых работах Онзагера и Маннинга [166,167] речь шла о непосредственной посадке ионов на ионогенную группу полимера (фактически об образовании ионной связи), то в последнее время под этим термином по отношению к противоионов часто понимают их удержание в некотором фиксированном объеме вблизи полииона [45].
Экспериментальные данные показали, что мультивалентные катионы способны конденсировать ДНК из раствора с образованием тороидальных и палочкообразных структур [168- 174]. При этом наблюдается увеличение мутности раствора, однако, при определенных концентрациях компонентов не наблюдается агрегации. Строго говоря, присутствие конденсированной ДНК нарушает молекулярность раствора, что существенно затрудняет применение различных методов исследования при изучении таких структур. Согласно Блумфилду, небольшие мобильные мультивалентные катионы при связывании с В-ДНК, могут вызывать сильные, но не частые изгибы. Эти изгибы являются результатом локализации отдельных катионов при входе в большую бороздку, сопровождающейся коллапсом бороздки и закручиванием ДНК в сторону катиона. Такой специфический изгиб является результатом электростатического взаимодействия компактного заряда катиона с фосфатными группами с обеих сторон бороздки. Заметим, что двухвалентные катионы способны вызывать конденсацию ДНК только в водно-спиртовых растворах, для которых характерно уменьшение значения диэлектрической проницаемости е. Существует мнение, что АТ-богатые ДНК удерживают большее количество мультивалентных катионов вблизи маленькой бороздки, и закручивание будет сильнее для молекул ДНК, богатых GC-последовательностями [175,176]. Однако до сих пор не представлено экспериментальных подтверждений этого предположения. Существует мнение, что конденсация ДНК сопровождается появлением частиц с параллельной ориентацией полимерных цепей [177]. При высоких концентрациях ДНК в присутствии нейтрального полимера и больших концентрациях простой соли образуются упорядоченные формы. Это называется -конденсацией (polymer salt induced condensation) [162,163]. Конденсация ДНК под действием мультивалентных катионов при малых концентрациях ДНК приводит к образованию тороидальных структур. Было показано, что форма конденсатов зависит не только от свойств полимера, но и от структуры катиона, выступающего в качестве конденсирующего агента [178]. Поршке предположил [179], что конденсация больших молекул ДНК происходит в три этапа: связывание лиганда с ДНК, быстрая внутримолекулярная конденсация при достижении некоторой пороговой концентрации лиганда и медленная межмолекулярная конденсация. Авторы работы [180] полагают, что мультивалентные ионы приводят к более низким значениям персистентной длины ДНК (250-КЗОО) А, что гораздо ниже значений (400- 500) А, к которым приводят предельные концентрации моновалентной соли. Из выводов работы следует, что
х, 2+ \Ыян,)Т
присутствие в растворе ионов Mg и L v 3 U , заряд которых можно считать точечным, приводит к более низким значениям персистентной длины ДНК, чем присутствие полиаминов, у которых заряд распределен линейно [180]. Однако опыты по исследованию влияния различных двухвалентных ионов на конформационные параметры ДНК однозначно показали, что увеличение концентрации двухвалентных ионов в растворе не приводит к падению персистентной длины ДНК [48, 49, 181]. Вывод о том, что компактизация ДНК сопровождается значительным уменьшением персистентной длины молекулы на основании данных, полученных методами линейного дихроизма и вискозиметрии при малых концентрациях конденсирующего агента, не вполне обоснован. Поэтому предположение о том, что в условиях, при которых может произойти конденсация, ДНК может быть более гибкой, чем в обычном солевом растворе, требует более тщательной проверки. Полиэлектролитное отталкивание является основным препятствием к тесной упаковке ДНК. Это противодействие подавляется присоединением катионов, подавляющих электростатическое расталкивание, и дисперсионными силами Лондона. Гексамин кобальта вызывает конденсацию ДНК при меньших концентрациях агента, чем это наблюдается для полиаминов [168]. Структура воды в межсприральньгх промежутках, по-видимому, тесно связана с конденсацией, а специфические эффекты различных конденсирующих агентов определяются их влиянием на гидратную оболочку ДНК.
При конденсации ДНК образуются определенные структуры в зависимости от природы и концентрации конденсирующего агента. Согласно Блумфилду, формирование тороидов требует продолжительного изгибания сконденсированных молекул, что компенсируется перекручиванием ДНК [178] Различие в форме конденсатов зависит также от кинетики процесса. Образование палочек требует большей деформации двойной спирали, чем образование регулярно закрученных тороидов. \ 0\- "з)б\ является более активным конденсирующим агентом, чем спермидин3+ или другие полиамины, а также двухвалентные катионы, которые способны вызывать конденсацию ДНК в присутствии спирта. Было показано, что при связывании [Co{NH3)6\ c природной ДНК взаимодействие идет предпочтительно по GC-богатым участкам [182], причем кобальт связывается достаточно сильно [183]. Проникновение иона в большую бороздку приводит к ее сужению, и увеличивает вероятность локализации второго катиона между нитями молекулы ДНК, что завершает «коллапс» большой бороздки. Поэтому вероятность связывания зависит от частоты GG-участков в последовательности ДНК [175]. Как известно, правоспиральная В-ДНК и левоспиральная Z-ДНК при определенных условиях находятся в равновесии друг с другом, а ионы играют важную роль в определении этого равновесия. Было показано, что ион гексамина кобальта в пять раз эффективнее Na+ и в четыре раза эффективнее Mg2+npH стабилизации Z-ДНК [184]. В результате экспериментов по рентгеноструктурному анализу кристаллических структур d(CpGpCpGpCpG) [185] было выяснено, что аминные группы I 3М формируют пять водородных связей с Z-ДНК. Все они образованы с внешней поверхностью молекулы ДНК. Причиной, по которой ион гексамина кобальта столь эффективен в стабилизации Z-ДНК в отличие от В-формы, может являться стерическое соответствие, способствующее образованию водородных связей.
Основы теории двойного лучепреломления в потоке и его измерение
В литературе существует представление о ИПЭК как о структурах лестничного строения, в которых более или менее длинные последовательности пар звеньев, связанных друг с другом солевыми связями (гидрофобные участки), чередуются с петлями, составленными из последовательностей разобщенных звеньев (гидрофильные участки) [237]. Гидрофобные блоки нестехиометрических комплексов в водном растворе должны собираться вместе, благодаря неполярным взаимодействиям. В достаточно разбавленных растворах такой процесс носит внутримолекулярный характер. Подчеркнем еще раз, что растворимые нестехиометрические комплексы образуются в результате обратимых интерполимерных реакций. Для образования ПЭК необходимо, чтобы раствор содержал некоторое количество низкомолекулярного электролита (0,002—0,12 моль/л в зависимости от химической природы полиэлектролитов и их соотношения в системе). По-видимому, рассмотренные выше закономерности образования и существования полиэлектролитных комплексов в полной мере могут быть распространены и на ДНК -полимерные комплексы. Как уже отмечалось, одним из основных требований, предъявляемым к таким системам при их использовании в генной терапии, является их высокая проникающая способность в процессе доставки генетического материала в клетку. Огромным препятствием на пути их следования является и возможное взаимодействие с макромолекулами типа сывороточных белков, нуклеаз, что приводит к уничтожению трансгена прежде, чем он достигает конечной цели. Следовательно, для предотвращения потери ДНК векторы должны оставаться инертными. Вместе с тем, трансгены должны быть достаточно лабильны, т.к. ДНК должна высвобождаться от конденсирующих агентов при проникновении в клетку. Таким образом, невирусные векторные системы должны подражать естественным вирусам, которые сохраняют генетический материал в процессе движения в организме, а затем высвобождают его после прохождения через ядерную мембрану. Процесс трансфекции имеет несколько стадий [238,239]: проникновение в клетку, движение трансгена через цитоплазму, проникновение в ядро. Последняя стадия связана с проблемой защиты вводимого генетического материала от внутриядерных систем, предназначенных для уничтожения чужеродной ДНК. На последнем этапе должно произойти включение трансгена в ДНК клетки или непосредственно его транскрипция. Многие полагают, что процессы транспортировки нуклеиновых кислот зависят от клеточного митоза, т.к. обычные клетки, в отличие от быстро делящихся, обычно невосприимчивые к трансфекции [240].
Использование поликатионов для передачи генетической информации было впервые рассмотрено в работах [241, 242]. Носитель для передачи генов был основан на полилизине, соединенном с рецептор-специфичным белком. В этой системе комплексы были сформированы спонтанно между отрицательно заряженной плазмидной ДНК и положительно заряженными молекулами полилизина в результате электростатического связывания. Однако использование этого подхода ограничивается иммунной реакцией организма. Этого можно избежать, используя комплексы ДНК с синтетическими полимерами [243, 244]. Размер, заряд и растворимость комплексов, сформированных ДНК и трансфекционными поликатионами, сильно зависит от отношения заряда поликатиона и ДНК. Маленькие катионные частицы формируются при излишке заряженных групп поликатиона по сравнению с заряженными группами ДНК. Однако, ответ на вопрос относительно связи между размером, зарядом и эффективностью трансфекции не найден, т.к. в некоторых работах не подтверждается точка зрения, что эффективная трансфекция происходит при образовании маленьких катионных частиц. Катионные частицы, как полагают, взаимодействуют электростатически с отрицательно заряженной плазматической мембраной клетки. Дальнейшие стадии транспорта ДНК в цитоплазме и ядре плохо изучены, однако механизм высвобождения ДНК в клетке может включать некую ионнообменную реакцию. Возможно, внутриклеточные полианионы (типа РНК) заменяют плазмидную ДНК внутри полиплекса. На основании того, что экспрессия гена наблюдалась при непосредственном введении полиплексов в ядро, было высказано предположение, что диссоциация комплекса происходит именно внутри ядра, возможно, с участием ДНК-полимераз в процессе транскрипции по аналогии с освобождением ядерной ДНК от гистоновых белков. В работе [245] показано, что реакция замещения в ИПЭК с участием нуклеиновых кислот обратима, причем скорость реакции и положение равновесия зависит от ионной силы раствора.
Изучение поведения комплексов ДНК с поликатионами и катионными сурфактантами в присутствии отрицательно заряженных моноламилярных липосом показало, что связи ДНК с сурфактантами нарушаются в процессе их взаимодействия с липосомами. ДНК в комплексе замещается отрицательно заряженными группами, принадлежащими поверхности мембраны. В работах [246,247] комплексы ДНК с сурфактантами изучали в органической среде. Было показано, что в этих условиях существуют компактные структуры, причем стехиометрические комплексы сохраняют растворимость. Согласно мнению авторов [248], длина молекулы ДНК должна быть достаточной для связывания 10 поликатионных единиц. Лишние поликатионы не могут включиться в комплекс, но могут связываться с клеточной мембраной, препятствуя адсорбции комплекса и снижая, таким образом, его трансфекционную эффективность. Существует мнение, что проникновение ДНК в клетки связано с фрагментированием ДНК и ее изменением до одноцепочечной формы, однако прямых экспериментальных данных, подтверждающих эту и все рассмотренные выше модели, не существует.
Хотя в настоящее время ДНК-полимерные комплексы показывают существенно меньшую эффективность трансфекции по сравнению с вирусными системами, потенциальные возможности таких комплексов необычайно высоки из -за простоты приготовления и высокой вариабельности свойств. Факторы, которые влияют на самосборку и поведение полиплексов, до сих пор мало изучены. Не выяснены механизмы передачи гена, не изучены причины, влияющие на эффективность трансфекции при использовании полиплексов. Без ответов на эти вопросы невозможно выбрать рациональный подход к созданию комплексов, эффективность которых была бы сопоставима с вирусными системами. Чтобы преодолеть все препятствия в использовании полиплексов в генной терапии, необходимо всестороннее изучение физико-химических свойств комплексов ДНК -поликатион, объединенных с исследованиями механизмов передачи гена, использующих эти системы. При этом важнейшим вопросом является изучение полиэлектролитных свойств ДНК в процессе формирования таких структур. Заметим, что меньше всего исследован сам процесс образования комплексов, в частности, совершенно не изучалась трансформация физико-химических свойств и структуры макромолекул, предшествующая образованию компактных структур. Нет сведений о влиянии рН среды и ионов двухвалентных металлов на комплексообразование, хотя последние присутствуют в клетке в значительных количествах. Эти вопросы рассматриваются в пятом разделе четвертой главы диссертации. Нас интересовало в первую очередь сравнение действия многовалентных точечных ионов и поликатионов в процессе образования их комплексов с высокомолекулярной ДНК.
Сопоставление влияния двух- и трехвалентных ионов металлов на конформацию молекулы ДНК в растворе
При исследовании растворов макромолекул широко используется термин "конформация". В случае низкомолекулярных соединений под конформацией молекулы обычно понимают взаимное расположение и ориентацию атомов и атомных групп. Полимерные системы отличаются большой сложностью, так как большое число составных элементов цепи и тепловое движение обеспечивают многообразие состояний отдельной макромолекулы во времени. Для описания таких систем удобно использовать статистический подход. Конформация макромолекул может быть описана с помощью средних значений ряда параметров (конформационных параметров), выбор которых определяется используемой моделью полимерной цепи.
Биологические макромолекулы характеризуются разными уровнями структурной организации (выделяют первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуру биополимеров). Если молекула обладает сложной вторичной структурой, а тепловое движение приводит к заметным флуктуациям параметров, описывающих эту структуру, конформационные параметры вторичной структуры макромолекул также представляют собой усредненные по ансамблю макромолекул значения. Например, молекулы двуспиральной ДНК могут обладать А-, В- или Z-конформацией (имеется в виду А- или В- семейства правых и Z- семейство левых форм двойной спирали). В этом случае конформационные параметры вторичной структуры макромолекулы, например, средние значения углов и расстояний между основаниями (см. таблицу 1.1) позволяют достаточно полно описать геометрию двойной спирали. Заметим, что флуктуация этих параметров приводит к тому, что фиксируемые при изучении кристаллических структур конформационные переходы могут находиться в пределах тепловых флуктуации того или иного состояния в растворе. Наиболее яркий пример - фиксируемая некоторыми методами С-форма ДНК, относящаяся к В-конформации. Наряду с параметрами вторичной структуры необходимо описать размер и форму макромолекул в растворе, их изгибные свойства.
Для характеристики поведения макромолекул в растворе обычно используют набор конформационных параметров, представляющих собой усредненные по ансамблю макромолекул значения. Статистическая теория макромолекул, получившая свое начало в работах Куна, Гута и Марка [324, 325], лежит в основе физики полимеров.
Выбор молекулярных параметров, используемых для описания конформации макромолекул, определяется выбором модели полимерной цепи. Наиболее широко для описания конформации высокомолекулярной ДНК в эксперименте используются модели персистентной (червеобразной) [326, 327] и свободно-сочлененной цепи (модель Куна). Мерой термодинамической жесткости в первой модели является персистентная длина цепи а. Она определяется как длина части червеобразной цепи Л, на которой средний косинус угла ср между касательными к цепи в начальной и конечной точке отрезка меняется в е - раз:
В модели Куна равновесную жесткость полимерной цепи характеризует средняя длина статистического сегмента А (или количество мономерных остатков, составляющих статистический сегмент S). Для достаточно длинной жесткой цепи справедливо использование двух рассмотренных моделей. При этом А = 2 а. Кроме понятия равновесной (или термодинамической) гибкости существует представление о динамической (или кинетической) гибкости полимеров, которая характеризуется скоростью, с которой макромолекула может быть переведена из одной равновесной конфигурации в другую. Этот переход требует конечного времени из-за наличия потенциальных барьеров, тормозящих свободное вращение звеньев цепи. Мерой кинетической жесткости макромолекулы служит, например, внутренняя вязкость полимерной цепи В. Она равна силе, противодействующей деформации клубка при единичной скорости деформации.
Существует также понятие торсионной жесткости, характеризующей меру сопротивления скручиванию цепи. Этот термин обычно употребляют в рамках рассмотрения вторичной структуры макромолекул. Например, для малых отклонений угла закручивания А(р; изменение свободной энергии при скручивании [328]:
Здесь gt _ константа торсионной жесткости. Для двуспиральной ДНК gt = 0,036 kT. Амплитуда тепловых флуктуации угла закручивания двойной спирали ДНК при комнатной температуре приблизительно равна 5. Так называемый В-С конформационный переход во вторичной структуре ДНК сопровождается изменением угла закручивания спирали на 2,5. Это и объясняет принятое в последнее время включение С-формы ДНК в В-семейство форм (В-конформацию ДНК).
Для описания длины полимерной цепи, наряду с используемыми во всех моделях степенью полимеризации z, гидродинамической длиной (длиной вытянутой цепи) L и молекулярной массой М, в модели Куна используют количество статистических сегментов в цепи N. Размеры молекулярного клубка (для сформировавшегося клубка выполняется условие N 10) определяет среднеквадратичное расстояние между концами полимерной цепи h2 1/2 или среднеквадратичный радиус инерции Rj2 1/2.
Конформация макромолекул в растворе может быть достаточно полно описана с помощью параметров, характеризующих длину полимерной цепи, ее равновесную (изгибную) жесткость и размеры статистического клубка, который макромолекула формирует в растворе.
При описании конформации так называемой невозмущенной (идеальной) цепи, подчиняющейся гауссовой статистике, равновесная жесткость А и длина цепи L однозначно определяют ее размеры:
