Содержание к диссертации
Введение
1. Влияние биологически активных лигандов и свойств среды на структуру и свойства молекулы ДНК 8
1.1. Структура и свойства молекулы ДНК 8
1.2. Комплексы ДНК с соединениями платины 13
1.3. Свойства диметилсульфоксида (ДМСО) и его биологическая роль 26
1.4. Влияние ионизирующего излучения на структуру молекулы ДНК 38
2. Методы исследования и материалы 46
2.1. Вискозиметрия 46
2.2. Динамическое двойное лучепреломление 49
2.3. Атомная силовая и флуоресцентная микроскопия 55
2.4. Спектральные методы 59
2.5. Материалы 61
3. Копформация молекулы ДНК в комплексах с координационными соединениями платины в смешанных растворителях и при гаммаоблучении растворов 64
3.1. Структура и свойства молекулы ДНК в водно-солевом растворе, содержащем ДМСО 64
3.2. Влияние модификации препаратов платины путем внедрения ДМСО в состав первой координационной сферы комплексообразующего иона на характер их взаимодействия с молекулой ДНК в растворе 105
3.3. Анализ совместного действия радиации и противоопухолевых препаратов платины на структуру и свойства молекулы ДНК в растворе 150
Заключение 171
- Комплексы ДНК с соединениями платины
- Влияние ионизирующего излучения на структуру молекулы ДНК
- Атомная силовая и флуоресцентная микроскопия
- Влияние модификации препаратов платины путем внедрения ДМСО в состав первой координационной сферы комплексообразующего иона на характер их взаимодействия с молекулой ДНК в растворе
Введение к работе
Противоопухолевое действие препаратов на основе координационных соединений платины обусловлено их связыванием с ядерной ДНК, подавляющим нерегулируемое деление опухолевых клеток. Изучение взаимодействия молекулы ДНК в растворе с координационными соединениями платины позволяет рассмотреть молекулярный механизм действия новых препаратов, может служить предварительным тестом на их возможную противоопухолевую активность. К настоящему времени накоплен достаточно большой материал о структуре и свойствах комплексов ДНК с различными соединениями платины. Наиболее эффективным препаратом до последнего времени остается первое из испытанных в 70-е гг. соединений - цис- диаминодихлорплатина (цис-ДДП), серьезные побочные действия которого существенно ограничивают его применение. Наряду с модификацией платиновых комплексов путем введения лигандов разной структуры в первую координационную сферу комплексообразователя широко используется комбинированное действие препаратов платины с веществами, способными улучшить терапевтический эффект. Применяется и последовательное лечение пациентов разными препаратами платины, особенно после развития резистентности к одному из соединений. Так как некоторые платиновые препараты плохо растворимы в воде, на практике используют различные растворители, хорошо смешиваемые с водой. В первую очередь, в качестве такого растворителя используют диметилсульфоксид (ДМСО). В связи с этим представляет интерес исследование взаимодействия препаратов платины с
5 молекулой ДНК при изменении состава растворителя. Кроме того, совместное использование на практике химиотерапии и гамма-облучения тканей требует изучения взаимного влияния этих двух факторов на молекулу ДНК - основную мишень действия ионизирующей радиации и противоопухолевых препаратов платины.
В последнее время большой интерес проявляется к платиновым комплексам с серосодержащими лигандами. Так как цис-ДДП после введения в плазму крови встречается с большим количеством серосодержащих соединений, они могут играть определенную роль при транспорте препаратов платины в организме. Существует мнение, что модификация платиновых комплексов путем введения в их первую координационную сферу лигандов, содержащих серу, может уменьшить токсический эффект. С этой точки зрения перспективным соединением также является диметилсульфоксид (ДМСО). Он относится к малотоксичным соединениям (используется в пищевой и косметической промышленности), хорошо проникает через биологические мембраны, является хорошим растворителем для лекарственных препаратов на основе платины. Изучение роли ДМСО в составе координационного соединения, а также анализ его влияния на молекулу ДНК и ее комплексообразование с соединениями платины в смеси вода-ДМСО представляет большой интерес с точки зрения его использования при создании и применении новых противоопухолевых препаратов. Кроме того, представляет интерес изучение роли свободного и введенного в состав координационного соединения платины ДМСО в процессе гамма-облучения растворов ДНК.
Сказанное выше свидетельствует об актуальности темы диссертационной работы и практической значимости выполненных исследований.
Целью диссертационной работы является изучение комплексов молекулы ДНК с координационными соединениями платины в растворе, рассмотрение влияния модификации препаратов путем внедрения серосодержащих лигандов в состав координационной сферы платины на характер их взаимодействия с ДНК, анализ влияния состава растворителя и гамма-облучения на комплексообразование.
Научная новизна работы. В работе впервые исследуется взаимодействие соединения двухвалентной платины Ріеп(ДМСО), синтезированного в Санкт-Петербургском Технологическом Университете, с молекулой ДНК, проводится сравнение его действия на молекулярном уровне с препаратами цис-, транс-ДДП и Pten. Впервые применяются методы флуоресцентной микроскопии, атомной силовой микроскопии и спектрофотометрического титрования для определения конформационных изменений ДНК, вызванных ее взаимодействием с используемыми в работе координационными соединениями платины, а также после гамма-облучения водных растворов ДНК и ее комплексов с препаратами платины. Впервые рассмотрена роль ДМСО при комплексообразовании нативной и облученной ДНК с соединениями платины.
Результаты работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях и симпозиумах: Третьей всероссийской Каргинской конференции "Полимеры - 2004" (Москва, 2004); III съезде биофизиков России, (Воронеж, 2004); Политехническом симпозиуме "Молодые ученые -
7 промышленности северо-западного региона" (Санкт-Петербург, 2004); Санкт-Петербургской конференции молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах", (Санкт-Петербург, 2005); Международном симпозиуме "Hydration and Thermodynamics of Molecular Recognition" (Цахнадзор, Армения, 2005); XII и XIII Симпозиумах по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, (Пущино, 2004).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 213 страницах, содержит 97 рисунков, 8 таблиц. Список цитируемой литературы состоит из 295 наименований.
Комплексы ДНК с соединениями платины
Цис-диаминодихлорплатина (цис-ДДП) и ее производные используются при лечении таких опухолей, как рак яичек и яичников, опухоли мочевого пузыря, головы, шеи, пищевода, молочной железы, некоторых видов рака легких саркомы мягких тканей, остеогенных сарком, меланомы [22-25]. В некоторых случаях эффективность лечения достигает 90 % [26-27].Применение цис-ДДП обычно заключается в серии внутривенных инъекций, проводящихся каждые 3-4 недели. Доза препарата составляет 50-120 мг на один квадратный метр поверхности тела. Ежедневное медленное введение низкой дозы препарата более предпочтительно, чем быстрое введение высокой дозы [28-30]. Сильные побочные эффекты (токсичность) и возникновение устойчивости к цис-ДДП ограничивают клиническое применение этого препарата [31-33]. Уменьшения токсичности достигают путем использования цис-ДДП в комбинации с другими препаратами, а также акватированием организма и принудительным диурезом. Однако кардинальное решение проблемы связано с синтезом новых препаратов на основе платины [34-36]. Цис-ДДП впервые была синтезирована в 1845 году [37], а биологическая активность этого препарата была открыта Розенбергом в 1965 г. при изучении эффекта электрического тока на рост бактерий и пролиферацию [38]. В настоящее время известно, что противоопухолевую активность проявляет только цис-изомер диамминдихлороплатины, тогда как транс-ДДП является мутагенным соединением (рис. 1.2.1) [39]. Несмотря на огромное количество публикаций, посвященных изучению молекулярного механизма цитотоксичности цис-ДДП, он до сих пор все еще недостаточно хорошо изучен. Цис-ДДП индуцирует рост клеток бактерий без их деления. Это характерно для таких процессов повреждения ДНК, как УФ-облучение, ионизирующее излучение, воздействие гидроксимочевины [40-42]. Принято считать, что противоопухолевое действие цис-ДДП обусловлено ее координационным связыванием с ДНК, так как цитотоксичность цис-ДДП коррелирует с количеством платины, связанной с ДНК [43-45]. Цис-ДДП проникает в клетки путем пассивной диффузии через трансмембранные каналы и посредством активного транспорта [46-50]. Ограничивающим фактором для накопления платины в клетках является ее концентрация.
Относительно большая (100 мМ) концентрация ионов хлора в плазме крови подавляет гидролиз и поддерживает соединение в нейтральном состоянии. Внутри клетки концентрация ионов хлора понижена (около 20 мМ), что облегчает гидролиз, в результате которого в течение 4 часов образуется заряженная акваформа [Pt(NH3)2Cl(H20)]+, способная быстрее реагировать с клеточными мишенями, например, с N 7 атомом гуанина, который замещает молекулу воды в относительно быстрой реакции (tj/2 = 0,1 ч.), образуя монофункциональный аддукт. Затем, после образования второй координационной связи платины с ДНК, формируется бифункциональный аддукт [51-53]. Принято считать, что цис-ДДП образует координационную связь с азотистыми основаниями ДНК, предпочитая связываться с GC-парами. Согласно оценке Дикерсона с соавторами, максимальная степень связывания цис-ДДП с ДНК составляет гь = 0,4 (4 атома платины на 10 пар оснований). При больших гь наблюдается дестабилизация вторичной структуры ДНК [54]. Цис-ДДП может связываться с молекулой ДНК различными способами. Комплексы могут представлять собой бифункциональные аддукты с образованием межнитевых и внутринитевых сшивок, возможно монофункциональное (терапевтически неактивное) связывание и образование сшивок ДНК-Рі-белок [55-57]. Цис- и транс-ДДП предпочитают связываться по позиции N 7 пуриновых оснований [58], предпочитая гуанин аденину. Позиция N 7 гуанина стерически доступна для лигандов (она выходит в большую бороздку ДНК) и отличается повышенной электроотрицательностыо. Связывание цис-ДДП с ДНК может вызвать изгибание дуплекса и нарушение стэкинга оснований ДНК. Взаимодействие цис-ДДП с молекулой ДНК может осуществляться путем образования хелата между О 6 и N 7 гуанина [59]. Соединение [Pt(en)Cl2] (en = 1,2-диаминоэтан), используемое в нашей работе, взаимодействует с молекулой ДНК в растворе аналогичным с цис-ДДП образом [60]. Эти соединения образуют два вида внутринитевых аддуктов с ДНК: l,2-d(GpG) и d(ApG), поперечные сшивки между разными нитями, при формировании которых два хлорид-иона цис-ДДП замещаются атомами N 7 гуанина или аденина.
Согласно оценке, образуется около 65 % цис-GG, 25 % цис-AG (внутринитевые поперечные сшивки между соседними пуринами) и 8 -10 % цис-GNG аддуктов (1,3-внутринитевые сшивки, связывающие гуанины через основание) [61]. Некоторые из возможных поперечных сшивок цис- и транс-ДДП с ДНК представлены на рис. 1.2.2. Рис. 1.2.2. Некоторые виды аддуктов, образующихся при связывании цис-ДДП с ДНК. Слева направо: 1,2-внутринитевые и межнитевые сшивки, монофункциональные аддукты и сшивки ДНК-белок. Межнитевые сшивки были первыми бифункциональными аддуктами, обнаруженными in vitro и in vivo [62]. Они составляют менее 1 % от общего числа аддуктов и легко вырезаются при репарации ДНК. Межнитевые сшивки нестабильны и способны к самопроизвольному переходу во внутринитевые [63]. Принято считать, что 1,2-внутринитевые сшивки определяют противоопухолевую активность цис-ДДП. В пользу этого свидетельствует, например, различие в биологической активности цис- и транс-ДДП. Оба соединения могут формировать бифункциональные аддукты. Однако терапевтически неактивный изомер транс-ДДП для образования 1,3-внутринитевых сшивок, l,2-(GpG) и d(ApG) аддуктов требует нарушения вторичной структуры ДНК [64]. Расстояние между соседними парами оснований в молекуле ДНК составляет 3,4 А, что соответствует расстоянию между ионами хлора у цис-ДДП, у транс-ДДП оно соответствует 5,4 А. Поэтому при образовании бидентатного комплекса (две координационные связи платины с ДНК) вторичная структура макромолекулы должна дестабилизироваться. Для образования внутринитевой сшивки с соседними основаниями они должны несколько разойтись, а связывание через основание требует их сближения. Таким образом, такие комплексы могут сопровождаться разрывом водородных связей и локальными нарушениями структуры ДНК [65]. Результаты по ферментативному расщеплению ДНК, обработанной транс-ДДП, свидетельствуют о преимущественном образовании 1,3-внутринитевых сшивок [64], хотя образуются также поперечные сшивки между комплементарными остатками гуанина и цитозина. При образовании бидентатного комплекса цис-ДДП с ДНК происходит уменьшение вязкости [66-67]. В работе [68] методом атомной силовой микроскопии было изучено действие цисплатина на ориентированные волокна ДНК. Было показано, что предварительная обработка цисплатином приводит к изломам, геометрической нерегулярности и искривлениям ориентированных нитей. Компьютерные вычисления показали, что излом может достигать 60. Кроме того, расчеты предсказывают также некоторое раскручивание ДНК под действием платины без образования кинков. В таблице 1.2.1 представлены возможные структурные искажения двойной спирали ДНК, вызванные разными типами сшивок платины с группами ДНК [69-77].
Влияние ионизирующего излучения на структуру молекулы ДНК
В результате облучения макромолекул их биологические функции могут полностью или частично утрачиваться. В этом случае говорят об инактивации макромолекул, которая может произойти вследствие прямого и косвенного действия ионизирующего излучения. Прямое действие состоит в том, что инактивированными оказываются те молекулы, которые непосредственно поглотили энергию излучения. Если молекула была поражена активными продуктами, возникшими за счёт поглощения энергии излучения растворителем, говорят о косвенном действии радиации. Механизм поражения биомакромолекул представляет собой целую цепь процессов, происходящих на атомарном и молекулярном уровнях, растянутых во времени и предшествующих появлению повреждения, приводящему к нарушению биологических функций. На первой, или физической, стадии поглощённая энергия распределяется по атомным уровням, в результате чего образуется большое число активированных молекул (первичные продукты). Они всегда нестабильны и на физико-химической стадии быстро вступают во вторичные реакции. После наступления теплового равновесия следует химическая стадия, на которой вновь образовавшиеся активные продукты (ионы и свободные радикалы) взаимодействуют друг с другом и со средой, вызывая повреждения молекул. В биологических системах далее следует биологическая стадия - реакция организма на созданные на химической стадии продукты [210-213]. При поглощении энергии молекула воды может перейти в возбужденное состояние (в случае передачи ей менее 12,6 эВ), в сверхвозбужденное состояние (переданная энергия была 12,6-30 эВ) или ионизироваться (при поглощении более 12,6 эВ). Сверхвозбуждённые молекулы Н20 могут диссоциировать на два радикала: Н20 - Н + ОН . Перенос к молекуле Н20 энергии, большей, чем 30 эВ, с высокой вероятностью приводит к автоионизации: Н20 -» Н20+ + е . Ионы Н20+ могут находиться в различных электронных состояниях: стабильных, или приводящих к диссоциации: Н20+ - Н+ + ОН.Свободные радикалы Н и ОН пространственно не разобщены, поэтому они могут с большой вероятностью рекомбинировать с образованием молекулярных продуктов:Н + ОН - Н20; Н + Н - Н2; ОН + ОН - Н202. Первичные продукты радиолиза воды - радикалы Н , ОН , е гидр -располагаются в пространстве достаточно близко друг от друга, образуя своеобразные скопления - "рои" небольшого объёма, средний радиус которых около 1,5 нм. Именно в рое происходит рекомбинация радикалов с образованием молекулярных продуктов - Н2 и Н2О2.
Атаковать макромолекулы в растворе могут лишь те радикалы, которые не рекомбинируют, а выходят из роя. Образование продуктов радиолиза воды отражает уравнение: Н20 - Н + ОН + е гидр + Н2 + Н202 + Н30+, где Н30+ - принятая форма записи иона Н+, уравновешивающего отрицательный заряд гидратированного электрона [212]. В разбавленных водных растворах непрямое действие радиации, посредством продуктов радиолиза воды, играет ведущую роль в инактивации молекул. Последовательность протекающих процессов выглядит следующим образом. В момент прохождения ионизирующей частицы через воду (в первые 10 - 10" с) вдоль её трека возникают возбуждённые, сверхвозбуждённые и ионизированные молекулы, испытывающие цепь превращений, приводящих к образованию радикалов Н, ОН и е_гидр. Затем некоторые радикалы взаимодействуют с растворёнными органическими молекулами, а часть свободных радикалов рекомбинирует с образованием молекулярных продуктов Н202, Н20 и Н2. Радикалы воды вступают в специфические реакции с растворёнными макромолекулами, в результате возникают свободные органические радикалы, которые затем взаимодействуют друг с другом и с окружающими молекулами, образуя относительно стабильные структуры. Если в растворе существуют молекулы-примеси, способные конкурировать с макромолекулами за активные продукты радиолиза воды, то это приводит к снижению радиационного поражения макромолекул (эффект защиты). Поражающее действие рентгеновских и у іуче іЗффеіЩївнее а-частиц или ускоренных ядер. Это связано с неодинаковой линейной плотностью ионизации, которая определяет пространственное распределение активных радикалов воды [213]. Возможные повреждения ДНК, обусловленные действием у-радиации, показаны на рис. 1.4.1. Двунитевые разрывы (ДР) возникают вследствие накопления однонитевых разрывов (ОР). При образовании двух ОР в разных нитях и в достаточной близости друг от друга может появиться ДР. Показано, что число ДР (F) связано с числом ОР (/), появившихся в макромолекуле ДНК, следующим соотношением: F = —, где h - максимальное число пар оснований между двумя ОР, расположенными в противоположных нитях ДНК; Рп - среднечисленная -о степень полимеризации двунитевой ДНК [211]. характеристической вязкости [г] макромолекулы. Авторы работы [215] падение вязкости связывали с предполагаемым уменьшением жесткости молекулы ДНК, обусловленным однонитевыми разрывами. По мнению автора работы [212], в основе конформационных изменений макромолекулы лежат нарушения оснований, одиночные разрывы цепей и возникающие в таких местах локальные денатурационные участки во вторичной структуре ДНК. Однако следует отметить, что эти предположения были высказаны при отсутствии данных о величине жесткости у-облученной ДНК.
В работах, выполненных в нашей лаборатории [216-218], было проведено исследование конформационных изменений молекулы ДНК при у-облучении ее растворов в области ионных сил 0,003 М И 0,1 М NaCl с помощью методов двойного лучепреломления с потоке и вискозиметрии. Совместное использование этих методов позволило корректно разделить влияние у- излучения на дальние и ближние взаимодействия в макромолекуле. Результаты этого исследования показали, что отношение динамооптической постоянной [п] к характеристической вязкости [г] ДНК, облученной дозами 10-30 Гр, оставалось постоянным и равным значению, полученному для необлученной ДНК. Это свидетельствует о неизменности вторичной структуры и равновесной жесткости макромолекулы. Полученные результаты показали, что наблюдаемое уменьшение гидродинамического объема ДНК, вызванное у-облучением, обязано изменению дальних взаимодействий в макромолекуле. Возникновение устойчивости к цис-ДДП вызывает необходимость развития не только новых препаратов, но и новых стратегий лечения опухолей [219-223], например, использования комбинированного действия лекарств и радиотерапии. Разные опухолевые клетки показывают различную радиочувствительность на протяжении митотического цикла. Например, клетки молочной железы наиболее чувствительны во время митоза, во время фазы G 2 клеточного цикла и наиболее устойчивы в поздней S фазе. Клетки с длинной фазой G 1 наиболее устойчивы в ранней G 1 фазе. Хотя цис-ДДП и более токсична, чем другие противоопухолевые препараты, ее преимущество состоит в том, что ее токсичность не перекрывается с побочными эффектами, вызванными радиацией. Препарат платины проявляет противоопухолевую активность как против самой опухоли, так и в отношении микрометастаз. Эффективность радиотерапии ограничена тем, что она обычно используется на стадии первичной опухоли для предотвращения метостатического эффекта, что приводит к радиоустойчивости опухоли [224-226]. Гибель опухолевых клеток увеличивается, когда введение цис-ДДП сопровождается применением радиотерапии. При совместной обработке чувствительных и резистентных к цис-ДДП клеток цитотоксичность в 6,9 раз больше, чем при использовании только препарата платины. Литературные данные о совместном действии радиации и химиотерапии довольно скудны и противоречивы [221-223]. Одна из главных целей комбинированного применения радиотерапии и химиотерапии - улучшить терапевтический эффект, повышая контроль за опухолью и уменьшая (или не увеличивая) токсичность препарата.
Атомная силовая и флуоресцентная микроскопия
Атомная силовая микроскопия (АСМ) - новый метод для изучения структуры полимеров (в том числе, ДНК) с высокой разрешающей способностью [248-249]. Сканирование поверхности с зафиксированными на ней макромолекулами можно проводить на воздухе или в жидкости. С помощью этого метода можно определять структурные детали с разрешением от сотых долей до нескольких нанометров. Наиболее серьезные трудности для использования метода АСМ при изучении структурных и конформационных изменений ДНК и ее комплексов с биологически активными соединениями связаны с приготовлением образцов. Молекулы должны быть закреплены на поверхности подложки таким образом, чтобы избежать их "протаскивания" при сканировании кантилевером [250-254]. Наиболее удобной подложкой при исследовании ДНК является слюда, кристаллы которой имеют слоистую структуру. Межслойное скалывание позволяет получать поверхности значительной площади с незначительной шероховатостью. Поверхность слюды в водной среде приобретает отрицательный заряд. При нанесении капли раствора ДНК на поверхность слюды фиксации макромолекул на подложке мешает электростатическое отталкивание. Поэтому при высыхании капли раствора молекулы могут неравномерно распределяться на поверхности, что существенно затрудняет их исследование. В настоящее время одним из способов фиксации одиночных молекул ДНК на поверхности слюды является модификация подложки до нанесения капли раствора с помощью катионных поверхностно-активных веществ, мономолекулярных самоорганизующихся пленок тиолов, силанов и пр., что приводит к формированию между подложкой и поверхностью положительно заряженных связующих "мостиков", которые прочно удерживают молекулу и в процессе сканирования, и при приготовлении образца (высушивании капли препарата). Другим способом фиксации ДНК на поверхности слюды является введение в раствор катионов двух- или трехвалентных металлов, например, Mg2+ [250, 252, 254-255]. В работе использовали прибор NanoScope IVa MultiMode System (Digital Instruments, Santa Barbara, USA). Работали в режиме прямого сканирования и прерывистого контакта. В АСМ прямого сканирования зонд находится в постоянном контакте с поверхностью.
Это позволяет получить информацию о топографии поверхности. В АСМ прерывистого контакта зонд совершает колебательные движения в вертикальном направлении, лишь в нижней точке своей траектории находясь в контакте с образцом. Результатом АСМ- исследования поверхности в режиме прерывистого контакта также может быть информация о топографии поверхности и вязко-упругих свойствах исследуемого образца. Перед фиксацией ДНК на поверхности слюдяной подложки исходный раствор разбавляли в 10 раз с добавлением MgCb (в результате конечная концентрация магния в растворе составляла 0,001 М). После нанесения на подложку капли раствора образец оставляли на 5 минут для фиксации на поверхности, затем промывали поверхность водой и высушивали на воздухе. Все измерения проводили при комнатной температуре. Для обработки полученных изображений использовали программное обеспечение FemtoScan Online 1.6 (Advanced Technologies Center, 103009, Россия, Москва, ул. Б. Никитская, 24-7) [256]. Еще один широко используемый метод - флуоресцентная микроскопия (ФМ). Этот метод позволяет следить за состоянием макромолекул непосредственно в капле раствора. Для визуализации используют различные красители, например, YOYO-1 (димер оксазола желтого) (рис. 2.4), для которого длина волны возбуждения составляет XBOi5i = 491 нм, а длина волны излучения А.ИЗлуч. = 509 нм. YOYO-1 формирует стабильный комплекс с двунитевой ДНК, являясь биинтеркалятором. Он может также участвовать в электростатическом взаимодействии и бороздочном связывании с макромолекулой [257]. При связывании YOYO-1 с двунитевой ДНК не наблюдается значительных изменений ее контурной длины [257], в отличие от связывания ДНК с EtBr, когда после взаимодействия с красителем происходит увеличение контурной длины ДНК примерно на 40 % . В диссертационной работе использовали микроскоп Axiolab фимы Карл Цейс (кафедра физики полимеров и кристаллов физического факультета МГУ), оборудованном 100-кратным иммерсионным объективом и высокочувствительной CCD видеокамерой LCL-902HS компании Watec (чувствительность 0,00015 люкс). Полученные данные записывали на жесткий диск компьютера с частотой 10 кадров в секунду. При приготовлении изучаемых систем в растворы ДНК с препаратами платины добавляли краситель Yo-Yol. В исследуемом растворе концентрация ДНК Т4 составляла 2,3 х 10 М (в парах оснований), а отношение концентраций красителя и ДНК (в молях пар оснований) rt(Yo-Yoi) = 0,1. Перед исследованиями раствор выдерживали сутки при t = 4 С. Каплю образца объемом 5 -г 10 х 10"9 м3 наносили на приборное стекло.
Образец облучали ртутной лампой. Использовали фильтры ZEIZZ, Filter set 09 48790-0000. Для получения распределения клубков по размерам фиксировали максимальный размер пятна как большую ось эллипсоида (исходя из модели эллипсоида вращения). Определяли наивероятнейший размер клубка, аппроксимируя полученные результаты гауссовой кривой. 2.4. Спектральные и другие методы. Метод кругового дихроизма (КД) основан на разном поглощении право-и левополяризованного света растворами оптически активных веществ: Де = BL-8R, где є - молярный коэффициент экстинкции. Величина Ає изменяется в пределах полосы поглощения хромофора в зависимости от длины волны и может быть как положительной, так и отрицательной. Она имеет наибольшие значения вблизи максимума поглощения хромофора [258]. В диссертационной работе использовали автодихрограф Mark IV (Jovin Ivon, Франция), подключенный к персональному компьютеру. Все измерения проводили в кювете длиной 1 = 5 см. Согласно закону Ламберта-Бера: D = \g-y = ecl, где 1п - интенсивность падающего света (квант с"1); / - интенсивность света, прошедшего через раствор или пленку образца; D - поглощение раствора (оптическая плотность или экстинкция - безразмерная величина), є - коэффициент молярной экстинкции, отнесённой к единице толщины поглощающего слоя / (1 см) и единице концентрации исследуемого раствора С=1 моль/л. Коэффициент экстинкции є является постоянной величиной для данного соединения при данной длине волны. При больших значениях є удобно пользоваться lg с. На измерении электронных спектров поглощения свободного и связанного с макромолекулой лиганда основан метод спектрофотометрического (СФ) титрования. Он может быть применен, если спектры поглощения лиганда и макромолекулы не перекрываются. Оптическая плотность раствора D = єсі -аддитивная величина, если в растворе одновременно присутствуют несколько невзаимодействующих компонент. Этот принцип используется для определения концентраций связанного и свободного лиганда. Предполагают, что лиганд в растворе может существовать только в двух формах - связанной и свободной. Каждой из них соответствует свой коэффициент экстинкции Є. Тогда для двух неизвестных концентраций свободного и связанного лиганда получим два уравнения: D = ЄСВЯЗСС1Ш1 + єСвобССВоб1, [Ьо]=Ссвяз +ССВОб, где [L0] -полная концентрация лиганда в растворе. Отсюда можно найти Ссвя, и Ссвоб. D находится экспериментально; еСВОб известно для всех исследуемых веществ, 8связ-1 находится как предел D/[L0] при экстраполяции к нулю концентрации свободного лиганда, т.е. при высокой С(ДНК).
Влияние модификации препаратов платины путем внедрения ДМСО в состав первой координационной сферы комплексообразующего иона на характер их взаимодействия с молекулой ДНК в растворе
Как было указано выше, определенная модификация координационных соединений платины способна увеличить растворимость, уменьшить токсичность препаратов и изменить спектр их действия. Известно, что противоопухолевый препарат цис-ДДП после введения в плазму крови может реагировать с различными соединениями. Так как в ряду замещающих лигандов для координационных соединений платины сера и серосодержащие группы имеют значительное преимущество по отношению к атомам хлора и к воде, серосодержащие аминокислоты, входящие в состав белков, являются первыми кандидатами на включение в состав координационной сферы цис-ДДП и ее производных. Следует подчеркнуть, однако, что сера не может замещать инертные NH3 группы. О последствиях введения серосодержащих лигандов в координационные соединения платины существуют противоречивые сведения. С одной стороны, комплексы цис-ДДП с серосодержащими аминокислотами могут являться промежуточными образованиями, блокирующими активные центры связывания платины с ядерной ДНК, что может улучшать транспортные свойства препарата [275-276]. С другой стороны, связывание цис-ДДП с серосодержащими аминокислотами может уменьшить терапевтический эффект препарата и способствовать возникновению дополнительных отрицательных побочных явлений [137, 277]. Изучение характера взаимодействия ДНК с соединениями платины с серосодержащими лигандами в растворе и сравнение полученных данных с результатом действия цис-ДДП может дать информацию, например, о возможности удаления серосодержащего лиганда при образовании комплекса платины с молекулой ДНК. В работе использовали соединения [Pten CI SO(CH3)2]N03, содержащее диметилсульфоксид в первой координационной сфере, которое в дальнейшем будем обозначать Ріеп(ДМСО), и [PtenCl2] (далее будем обозначать как Pten). Согласно литературным данным, характер взаимодействия препарата Pten с ДНК сходен с наблюдаемым для цис-ДДП [55, 67]. Наши эксперименты также подтверждают это (рис. 3.2.1, 3.2.2). Как видно из рисунков, наблюдаются аналогичные изменения в спектре КД ДНК при связывании с этими соединениями: смещение нулевой точки при всех используемых C(Pt) в растворе, сдвиг и изменение амплитуды положительного максимума (при малых C(Pt) - увеличение, а при больших - уменьшение). Концентрационные зависимости амплитуды положительного максимума Аєтах и соответствующих Атах, Ас на длине волны А = 280 нм и Ао (длина волны при As = 0) для цис-ДДП и Pten ведут себя сходным образом.
Специальные исследования показали, что при образовании комплексов ДНК с Pten важна именно концентрация соединения платины, а не соотношение концентраций препарата платины и ДНК (рис. 3.2.3 - 3.2.5). Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что введение ДМСО в первую координационную сферу Pten вместо одного атома хлора существенно изменяет комплексообразование этого соединения с молекулой ДНК. Например, мы фиксируем другой характер изменения спектров КД ДНК при образовании ее комплексов с Ріеп(ДМСО) по сравнению с Pten и цис-ДДП (рис. 3.2.6). Он сходен с наблюдаемым для комплексов ДНК с транс- ДДП (рис. 3.2.7) [278]: при всех используемых концентрациях Ріеп(ДМСО) наблюдается понижение положительного максимума спектра КД ДНК без его смещения (рис. 3.2.8). Различие в связывании соединений Pten и Ріеп(ДМСО), выявленное с помощью метода кругового дихроизма, демонстрирует рис. 3.2.9. Возможно, присутствие ДМСО в первой координационной сфере платины препятствует образованию бидентатного комплекса, который и отвечает за повышение и сдвиг положительного максимума спектра КД ДНК при комплексообразовании с цис-ДДП [67] и Pten. Как видно из рисунка 3.2.8, изменения в спектре КД ДНК наблюдаются уже через час после приготовления комплексов путем сливания растворов ДНК и Ріеп(ДМСО) в 0,005 М NaCl, однако они более ярко выражены при измерении через сутки после приготовления растворов и их хранения при температуре + 4 С. Ранее было показано, что реализация координационного связывания соединений платины с ДНК представляет собой длительный процесс, который полностью завершается через 4 часа при выдержке растворов при комнатной температуре (21 С), а при хранении растворов при температуре 4 С измерения обычно выполняются после их выдержки около суток [278]. Остановимся на рассмотрении гидродинамических свойств ДНК в комплексе с используемыми соединениями платины. При определении характеристической вязкости ДНК в растворах, содержащих лиганды, важным вопросом является выбор способа разбавления систем, который всегда возникает при проведении концентрационных исследований. При так называемом равновесном связывании (равновесие в растворе устанавливается между связанными с ДНК и свободными лигандами), когда энергия взаимодействия лиганда с ДНК сравнима с энергией теплового движения, при разбавлении необходимо поддерживать неизменной концентрацию свободных лигандов в растворе ССВОб- Для этого необходимо знать константу связывания исследуемого соединения с ДНК, что обеспечивает корректный расчет необходимой величины Ссвоб для выполнения условия ССВОб = const.
Напротив, при реализации неравновесного энергетически сильного связывания (энергия взаимодействия лиганда с ДНК намного превышает энергию теплового движения) вопрос о выборе растворителя не так актуален. Необходимо лишь следить за соблюдением изоионности при изменении концентрации растворов. Заметим, что при используемых нами концентрациях соединений платины и концентрациях назкомолекулярного поддерживающего электролита (C(NaCl) 0,005 М) мы можем пренебречь вкладом комплексных ионов в общую ионную силу раствора. Получить сведения о способе связывания лиганда с макромолекулой можно, измеряя характеристическую вязкость ДНК в комплексе с соединением платины, проводя разбавление двумя способами [278]. Такой эксперимент проводился нами для всех используемых соединений платины. На рис. 3.2.10 приведены данные для комплексов ДНК с Pten (рис. 3.2.10 а) и Pten(,Z]MCO) (рис. 3.2.10 б). Это свидетельствует о том, что в условиях эксперимента изменение концентрации свободных лигандов не влияет на результат связывания, хотя характеристическая вязкость ДНК уменьшается, отражая реализацию взаимодействия соединений платины с макромолекулой. Следовательно, полученные данные свидетельствуют о том, что реализуется неравновесное связывание - образуется координационная связь соединений платины с ДНК. Таким образом, оба соединения (Pten и Ріеп(ДМСО)) образуют координационную связь с молекулой ДНК. Это в какой-то мере подтверждает высказанное ранее на основании данных, полученных методом кругового дихроизма, предположение о том, что Pten связывается с ДНК как цис-ДДП, а связывание Ріеп(ДМСО) с ДНК имеет общие черты с комплексообразованием транс-ДДП с ДНК. Действительно, цис- и транс-ДДП образуют координационную связь по N 7 гуанина (N 7 G), причем цис-ДДП может связываться с двумя соседними N 7 G (бидентатная координационная связь), а транс-ДДП - с одной N 7 G. Аналогичные результаты при использовании разных способов разбавления были получены и при определении динамооптической постоянной (Таблица 3.2.1). Таким образом, при определении характеристической вязкости ДНК и величины динамооптической постоянной изменение концентрации свободной платины в растворе не влияет на конечный результат, что свидетельствует о реализации энергетически сильного связывания платины с ДНК [278]. Следует подчеркнуть, что такой комплекс образуется при выдержке растворов более 8 часов при t = 4 С, тогда как равновесное связывание выдержки не требует.
