Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 13
1.1. Основные структурные элементы дендримернои макромолекулы 13
1.2. Синтетические концепции 19
1.2.1. Дивергентный метод 20
1.2.2. Конвергентный метод 23
1.2.3. Альтернативные методы синтеза дендримеров 26
1.2.3.1. Полимеризация трехфункциональных мономеров... 29
1.2.4. Твердофазный метод синтеза дендримеров 30
1.3. Структура дендримерных макромолекул и методы ее исследования 35
1.3.1. Гидродинамические методы 39
1.3.2. Спектроскопия ЯМР 45
1.3.3. Масс спектрометрия 47
1.3.4. Меточные подходы 51
1.3.5. Люминесцирующие метки 52
1.3.6. Поляризованная люминесценция 55
1.4. Способы модификации дендримерных структур 58
1.4.1. Поверхностная функционализация 60
1.4.2. Слоевая и сегментальная функционализация 65
1.5. Дендримеры - носители в генной терапии 68
1.5.1. Основные критерии носителей ДНК 68
1.5.2. Невирусные системы генной доставки 69
1.5.2.1. Катионные липиды 71
1.5.2.2. Полимерные системы на основе L-лизина 71
ГЛАВА 2. Полиэтиленимины 73
Дендримеры - эффективные вектора генной доставки 73
Дендримеры на основе L-лизина 75
Методы исследования образования дендример/ДНК комплекса 77
Гель электрофорез 78
Спектроскопия кругового дихроизма 79
Обсуждение результатов 81
Синтез полилизиновых гомо- и гетеродендримеров на полимерном носителе 81
Синтез гомолизиновых дендримеров 87
Синтез гетеродендримеров на основе лизина 88
Выделение, очистка и анализ дендримеров на основе лизина 93
2.2. Исследование молекул полилизиновых дендримеров методом MALDITOF масс
СПеКТрОМетрИИ
2.3. Гидродинамические свойства дендримеров на основе лизина 107
2.4. Исследование гомолизиновых дендримеров различных генераций методом ЯМР спектроскопии 112
2.5. Синтез люминесцентно меченых гомо- и гетеродендримеров на основе лизина. Исследование структурно-динамических свойств и комплексообразующей способности 121
2.5.1. Особенности структурной организации лизиновых дендримеров различных генераций 124
Комплексообразующая способность макромолекул лизиновых дендримеров при взаимодействии с низкомолекулярным органическим анионом 127
Взаимодействие полилизиновых дендримеров с ионизованными молекулами полиметакриловой кислоты в водных растворах и стабильность образующихся комплексов 130
Исследование взаимодействия полилизиновых дендримеров с молекулами ДНК методом спектроскопии кругового дихроизма 138
Исследование дендримеров на основе лизина различных генераций в качестве носителей генныхконструкций 148
Образование комплексов дендримеров с плазмидной ДНК 148
Анализ эффективности трансфекции комплексами ДНК/дендример 150
Изучение эндосомолитических свойств комплексов ДНК/03 и ДНК/05 151
Изучение особенностей внутриклеточной локализации комплексов плазмидной ДНК с
дендримерами после трансфекции in vitro 153
Экспериментальная часть 156
Материалы 156
Оборудование 157
Методы 159
Синтез гомо- и гетеролизиновых дендримеров 159
Твердофазный синтез дендримеров 160
Синтез люминесцентно меченых дендримеров 162
3.3.4. Определение гидродинамических характеристик 164
3.3.5. Спектроскопия кругового дихроизма 164
3.3.6. Получение комплексов дендример-pCMV-nls-lacZ.. 165
3.3.7. Эффективность трансфекции клеток HeLa комплексами дендример-pCMV-nls-lacZ 3.3.8. Исследование структурно-динамических характеристик и комплексообразующей способности люминесцентно меченых дендримеров 167
Выводы 168
Список литературы
- Альтернативные методы синтеза дендримеров
- Дендримеры - носители в генной терапии
- Методы исследования образования дендример/ДНК комплекса
- Исследование гомолизиновых дендримеров различных генераций методом ЯМР спектроскопии
Введение к работе
Водорастворимые поликатионные системы привлекают все возрастающее внимание исследователей, что обусловлено перспективами их использования в качестве полимеров-носителей биологически активных веществ (БАВ), таких как противовирусных, противобактериальных и противораковых препаратов, а также при целевом транспорте генетического материала в новых биомедицинских технологиях, связанных с генной терапией. Основной задачей генной терапии является поиск оптимальных носителей для целевого транспорта ДНК в клетки определенного вида. Ограничения, связанные с применением вирусных носителей как транспортных средств для доставки ДНК, такие как сильный иммунный ответ при многократном применении или токсический эффект, вызванный продуктами их распада, явились главной причиной активного поиска новых систем доставки ДНК с использованием синтетических носителей: так называемый невирусный способ доставки. К настоящему времени выявлены наиболее перспективные в этом плане поликатионные носители, такие как катионные липосомы, разветвленные полиэтиленимины или сверхразветвленные полиамидоаминные (ПАМАМ) молекулы - дендримеры. Носители на их основе более всего отвечают требованиям, предъявляемым к носителям ДНК, они компактизуют ее, обеспечивают эффективную защиту от расщепления нуклеазами крови, способствуют эффективному выходу комплексов ДНК из эндосом. Вместе с тем был отмечен токсический эффект, проявляемый данными носителями. В связи с этим представляется перспективным синтез и исследование дендримеров на основе природной а-аминокислоты - лизина. Данные макромолекулы, имея все преимущества выше отмеченных носителей, являются действительно биосовместимыми и биодеградируемыми. Несмотря на большое количество публикаций по синтезу и применению дендримерных макромолекул для целевого транспорта БАВ, число работ по изучению закономерностей их синтеза,
физико-химических свойств и особенностей их строения весьма невелико. Актуальной остается проблема получения монодисперсных дендримерных макромолекул с высоким числом генераций и/или сложным химическим строением. Известно, что при создании каждой последующей генерации дендримера возрастают трудности достижения полной конверсии функциональных групп, что, в свою очередь, усложняет получение дендримеров без дефектов в структуре. В связи с вышесказанным разработка методов синтеза гомо- и гетеродендримеров на основе L-лизина, изучение их структурной организации и физико-химических свойств, а также исследование особенностей формирования интерполиэлектролитных комплексов (ИПЭК) с участием дендримеров является актуальной задачей.
Цель работы состояла в разработке оптимальных методов синтеза новых монодисперсных регулярных дендримерных макромолекул на основе L-лизина различных генераций с использованием твердофазного метода, в изучении влияния структуры дендримеров на ход их синтеза, исследовании структуры и свойств дендримеров, а также их комплексов с ДНК или синтетическим полианионом - полиметакриловой кислотой (ПМАК), с использованием различных методов.
Научная новизна. Впервые с использованием полимерных носителей получен ряд монодисперсных водорастворимых гомолизиновых дендримеров различных генераций; впервые осуществлен синтез регулярных гетеролизиновых дендримеров, в структуру которых между точками «ветвления» - остатками диацилированных лизинов - введены фрагменты различных аминокислот: гистидина, глутаминовой кислоты, аланина и дипептида глицил-глицина, несущие дополнительные боковые группы; определены условия синтеза данных дендримеров на твердой фазе, что позволило установить влияние структуры синтезируемого соединения на ход синтеза; показана применимость таких методов анализа как масс-спектрометрия, спектроскопия ЯМР и КД для исследования структурных и
физико-химических характеристик лизиновых дендримеров; впервые применен динамический метод поляризованной люминесценции (ПЛ) для изучения структурно-динамических характеристик синтезированных дендримеров, для этого впервые синтезированы люминесцентно меченые дендримеры, имеющие ковалентно связанную люминесцирующую метку (ЛМ) на внешнем или внутреннем слое дендримерной макромолекулы. Применение метода ПЛ позволило впервые изучить влияние номера генерации и химического строения дендримера на его способность к формированию супрамолекулярных структур в растворе - образование ассоциатов, особенности формирования интерполимерных комплексов и комплексов с низкомолекулярными соединениями в качестве моделей широкого круга БАВ. Впервые исследовано влияние химического строения дендримеров на свойства их комплексов с ДНК.
Практическая ценность. Методом твердофазного синтеза пептидов получен ряд гомо- и гетеродендримеров на основе природных си-аминокислот различных генераций. Показана перспективность их использования в качестве носителей генетического материала в клетку. Определены пути оптимизации свойств дендримеров с целью повышения трансфекционной активности комплексов дендример/ДНК. Использование техники твердофазного синтеза потенциально позволяет автоматизировать и масштабировать процесс синтеза данного класса макромолекул.
Основные положения, выносимые на защиту;
усовершенствованный метод синтеза дендримеров различных генераций и различного химического строения на основе L-лизина на твердой фазе;
результаты по исследованию влияния номера генерации гомодендримеров и химического строения развязки в гетеродендримерах на ход синтеза, особенности структурной организации дендримеров и их физико-химические свойства;
метод модификации дендримеров ЛМ по внешним и внутренним слоям;
исследование структурно-динамических характеристик дендримеров и механизмов формирования супрамолекулярных систем с участием дендримеров в растворе;
взаимодействие дендримеров с молекулами ДНК.
Достоверность результатов подтверждается строгим контролем
синтеза дендримеров, использованием разнообразных современных методов анализа структуры макромолекул и воспроизводимостью полученных данных.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на 9th Annual meeting of ESGT (Turkey, Antalya, 2001), 27th European Peptide Symposium (Sorento, Italy, 2002), 7th World Conference on Biodegradable Polymer and Plastics (Pisa, Italia, 2002), 4th International Symposium "Molecular order and Mobility in Polymer Systems" (St. Peterburg, 2002), X Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем" (Казань, Москва 2003), 10th Gemany-Russian Peptide Symposium (Gemany, Fridrichroda, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), 1 Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2004), а также неоднократно на конкурсе молодых ученых ИВС РАН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, 14 тезисов докладов на международных и всероссийских симпозиумах и конференциях.
Личный вклад автора состоял в участии в постановке задач исследования, в разработке методов синтеза, очистке дендримеров, в изучении их свойств с использованием ряда физических методов, в анализе и обсуждении результатов.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка
цитируемой литературы, списка сокращений и приложения. Работа изложена на 185 страницах, содержит 15 таблиц и 65 рисунков и библиографию из 167 источников.
Работа выполнена как часть исследований, проводимых в ИВС РАН по темам: «Гидрофильные синтетические и природные полимерные биологически активные соединения и материалы на их основе» и «Биологически активные полимерные системы. Синтез, структура, свойства».
Альтернативные методы синтеза дендримеров
Дивергентный и конвергентный методы синтеза дендримеров являются многостадийными, трудоемкими и времяемкими и основывается на повторении ряда стадий: после каждой успешной реакции присоединения необходимо выделять промежуточный продукт и проводить последующие защиту или активацию реагирующих групп. Поэтому дендримеры, на сегодняшний день являются дорогими и сложными для получения в больших количествах. В связи с этим продолжается поиск новых подходов, которые позволили бы упростить и удешевить синтез дендримерных макромолекул.
Spindler и Frechet [341 в 1993 году впервые описали синтез дендримера 3 генерации методом «ортогонального сочетания». В основе метода лежит попеременное использование двух разных разветвляющих единиц с комплементарными функциями сочетания. Разветвляющие единицы должны быть подобраны таким образом, чтобы как они, так и их продукты сочетания, оставались инертными в условиях реакции второй сочетающейся пары. Такая стратегия приводит к значительному уменьшению числа стадий при синтезе дендримера, т.к. исключаются стадии защиты и активации (рис. 7). Кроме того, таким образом можно синтезировать дендримерный скелет как конвергентным, так и дивергентным методами.
Следующее сообщение о синтезе дендримера на основе метода ортогонального сочетания было сделано в 1996 г. Zimmerman и Zeng [35]. Авторы использовали последовательность высокоэффективных реакций (этерификация Mitsunobi и реакция Sonogashira), что позволило получить дендример методом ортогонального сочетания вплоть до 6 генерации (рис. 8). Позже авторы работы [36] успешно применили метод "ортогонального сочетания" для синтеза поли (фениленвинилового) дендримера.
Сравнительно недавно, в 1999 г. Yamakawa предложил эффективный метод получения дендримеров [37], также позволяющий исключать стадии защиты и деблокирования в ходе синтеза. Этот процесс включает лишь стадию активации концевых карбоксильных групп, используя конденсирующий агент и проводится в одном реакционном сосуде (one-pot synthesis), без выделения промежуточных продуктов (рис. 9). Такой подход значительно упрощает синтез дендримернои структуры, однако не позволяет получать дендримеры с высоким числом генераций.
Как альтернативная стратегия постадийному синтезу дендримеров, были предприняты попытки синтезировать дендримеры одностадийной полимеризацией различных трехфункциональных мономеров. Первый целенаправленный синтез такого рода был осуществлен группой Бочкарева [38]. В качестве исходного соединения был использован перфторированный трифенилгерманий [38]. К настоящему времени известно большое число гиперразветвленных полиэфиров полученных одностадийной полимеризацией трехфункционального агента, результаты этих работ обобщены в обзорах [39,40]. Наиболее часто в реакциях полимеризации используются трехфункциональные агенты - производные 3,5 -дигидроксибензойной кислоты и гидроксиизофталевой кислоты [40].
Необходимо отметить, что при таком подходе невозможно контролировать молекулярно массовое распределение и степень ветвления. В результате такой полимеризации обычно образуются структуры с высокой полидисперсностью (Mw/Mn 2) и низкой степенью ветвления (-50%). Эти полимеры могут быть синтезированы в больших количествах по доступной цене, однако, получить при этом ожидаемые свойства, связанные с высокой симметрией структуры дендримера невозможно.
Г. П. Власовым и сотр. [41] был разработан новый одностадийный метод синтеза гиперразветвленных полиаминокислог, в частности, гомополи-L-лизина и гетерополи-Ь-лизина, содержащего между точками «ветвления» дополниіельньїе аминокислоты или их олигомеры. Целью данной работы было получение аналогов дендримеров, а именно, і иперразветвленных полиаминокислот, содержащих между точками ветвления диацилированных остатков лизина - неразветвленные полимерные цепочки. Исследование структуры полученных макромолекул показало, что данные полимеры являются компактными соединениями с весьма высокой плотностью и со структурой близкой к шарообразной, однако, не смотря на это, их физико-химические свойства такие, как вязкость, способность образовывать ос-спирали и [3-складки, заметно отличались от свойств, найденых для дендримеров. Таким образом, полимеризационный подход позволяет синтезировать в одностадийном процессе только статистические гиперразветвленные полимеры, но не дендримеры.
Дендримеры - носители в генной терапии
Среди различных вариантов практического использования дендримеров наиболее интересным является их применение в качестве невирусных носителей при доставке генетического материала в ядро клетки при решении проблем генной терапии.
Многие болезни человека, включая рак и наследственные заболевания, вызваны генетическими нарушениями. Успехи молекулярной биологии ведут к лучшему пониманию молекулярно генетических основ болезней человека, и открывают возможности для развития оригинальных методик лечения болезней человека посредством генной терапии [106,107]. Генная терапия -одно из быстро развивающихся направлений современной молекулярной медицины. Однако, несмотря на масштабные исследования в этой области, проблема целевой доставки гена, обладающего терапевтическим эффектом, еще не решена. Разработка подходов к лечению наследственных заболеваний, начавшаяся с попыток использования вирусов в качестве носителей генов [108], в настоящее время смещается в сторону использования синтетических невирусных векторов [109].
Главным препятствием успеха генной терапии in vivo остается отсутствие подходящих векторов для доставки ДНК. К настоящему времени уже сформулированы основные критерии для выбора молекул-носителей. Хорошо известно, что используемый носитель должен обеспечивать компактизацию ДНК, ее проникновение в клетки мишени, предотвращать деградацию ДНК нуклеазами крови и лизосомальными ферментами клетки и обеспечивать ядерную транслокацию. При этом система доставки должна быть нетоксичной и неиммуногенной, а входящие в ее состав компоненты должны быть биосовместимыми и биодеградируемыми [45].
Вирусные векторы, такие как аденовирусы, являются высокоэффективными переносчиками генного материала и используются для различных клинических тестов, например, при фиброзе мочевого пузыря [110,111]. Однако, главный недостаток, связанный с использованием аденовируса в качестве носителя генов - высокая иммуногенность, возможно, сыграл основную роль в смерти одного из пациентов, принимавших участие в клиническом испытании генной терапии [111]. В связи с потенциальными ограничениями практического использования вирусных векторов, такими как выраженный иммунный ответ организма на неоднократное введение вирусных конструкций и опасность интоксикации продуктами его распада [112,113] невирусные in vivo стратегии, которые используют плазмиды ДНК для кодирования целевого гена, могут рассматриваться как достойная альтернатива.
Невирусные системы генной доставки В настоящее время существует несколько групп методов переноса функциональных генов без участия вирусов:
1) Использование «голой» нуклеиновой кислоты, при котором плазмидная ДНК может быть непосредственно трансфецирована с помощью прямых инъекций в мышечные клетки [114], в печень [115], твердые опухоли [116] или эпидермис [117] - так называемая ДНК-иммунизация. Простота данного подхода в сочетании со всеми преимуществами невирусной доставки привели к развитию технологии ДНК-вакцин. Тем не менее, известно, что ДНК подвергается гидролизу нуклеазами плазмы крови, и, таким образом, применение нативной ДНК ограничено непосредственным введение в места патологии. Уровень эффективной генной экспрессии при этом зависит от места прямого применения и, в отдельных случаях, возникают затруднения генной экспрессии [117,118]. 2) Использование поликатионных систем, таких как: -катионные липиды [119]; -производные поли-Ь-лизина [120,121]; -полиэтиленимины [122]; -катионные олигопептиды [123-125]. Все катионные полимеры электростатически взаимодействуют с отрицательно заряженной молекулой ДНК, что приводит к «сжатию» больших анионных молекул ДНК в маленькие транспортабельные частицы. В результате такого взаимодействия формируется полиэлектролитный комплекс, который затем может быть доставлен в клетку. Данный тип носителей показал высокую эффективность при использовании их в качестве векторов генной доставки. Схематично процесс генного переноса с использованием поликатионов (компактизация ДНК, трансфекция через мембрану клетки и последующая транслокация в ядро) может быть представлен следующим образом:
Методы исследования образования дендример/ДНК комплекса
Главным преимуществом в химии дендримеров является возможность контроля структуры, размера, молекулярной массы и управляемая функциональность молекул. Разработка методов синтеза дендримерных макромолекул на твердой фазе основывается на выполнении требований, связанных с особенностью строения таких структур. Высокая эффективность реакции ацилирования и деблокирования, стерическая доступность реагирующих аминогрупп играют ключевую роль при твердофазном синтезе полилизиновых дендримеров. Этот подход позволяет проводить пошаговое формирование каждой последующей генерации дендримера на основе предыдущей, используя избыток реагента, и дает возможность изучить влияние химической структуры дендримера на ход их синтеза и свойства гомологических рядов дендримеров. Синтез дендримеров дивергентным методом на твердой фазе дает также возможность проводить послоевую модификацию дендримерной структуры. Введение между фрагментами лизина расставок из а-аминокислот с различными боковыми радикалами позволяет, в свою очередь, получать дендримеры с определенными функциональными свойствами.
В данной работе были синтезированы два гомологических ряда дендримеров на основе L-лизина:
1 ряд - гомодендримеры на основе лизина с первой по шестую генерации. На С-конец дендримеров данного ряда был введен остаток аланина (Ala) для того, чтобы можно было с помощью аминокислотного анализа синтезируемых дендримеров достаточно четко контролировать их структуру.
2 ряд - гомо- и гетеродендримеры пятой генерации. Гетеродендримеры содержали между лизиновыми фрагментами остатки а-аминокислот разного строения. На С-конец данных макромолекул, помимо остатков аланина, был введен дополнительно фрагмент Ые-хлорацетиллизина (Lys(ClAc)) для того, чтобы данные дендримеры можно было конденсировать с цистеин-содержащими пептидами, «нацеленными» на определенные типы клеточных рецепторов, что должно было бы обеспечить целевую доставку комплекса дендример-ДНК.
На рис. 28 представлено схематическое изображение синтезированных гомо- и гетеродендримеров на основе лизина. Таблица З Сокращенные обозначения и структурные формулы полилизиновых гомодендримеров 1 -го ряда
Все дендримеры были получены твердофазным методом синтеза пептидов с использованием дивергентного подхода. L-лизин был использован в качестве аминокислоты в точке «ветвления» трехфункциональной разветвляющей единицы. Формирование разветвленных фрагментов дендримера проходило по а - и є - аминогруппам лизина.
Синтез данного вида дендримеров проводился на бензгидриламинном полимерном носителе с применением BOC/TFA - стратегии и DIC/HOBt-смеси на стадии ацилирования, используя в качестве карбоксильного компонента Ы",г48-ди-(трет-бутилоксикарбонил)-лизин. Избыток реагента, вводимого в реакцию, в общем случае составлял 3-4 эквивалента на одну аминогруппу в расчете на исходную емкость полимерного носителя. Полноту реакции ацилирования контролировали по наличию свободных аминогрупп с помощью теста Кайзера [44]. Защитную ВОС-группу в ходе синтеза удаляли действием раствора TFA. Конечной стадией синтеза было отщепление целевой молекулы дендримера от полимерного носителя с одновременным полным снятием защитных групп. Принципиальная схема синтеза лизиновых дендримеров на примере синтеза дендримера первой генерации представлена на рис. 29.
Снятые с полимерного носителя, дендримеры очищались от низкомолекулярных компонентов с помощью гель-фильтрации. Затем дендример фракционировали с помощью эксклюзионной хроматографии на Сефадексе G-50 с использованием 10%-го раствора уксусной кислоты в качестве элюента. Анализ чистоты дендримеров осуществляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а доказательство HjN Х Г
Схема твердофазного синтеза лизинового дендримера 1 генерации. структуры дендримеров проводили с помощью аминокислотного анализа, MALDITOF масс-спектрометрии и метода Н ЯМР спектроскопии.
Как было отмечено выше, при синтезе всех дендримеров в качестве первой аминокислоты на полимерный носитель присоединяли молекулу аланина, которая впоследствии служила репером при характеризации и исследовании целевых дендримерных макромолекул (рис. 29). Выбор молекулы аланина был обусловлен тем, что, с одной стороны, при аминокислотном анализе содержание аминокислот в гидролизате определяется относительно содержания аланина. С другой стороны, при исследовании методом ПМР-спектроскопии, СН-р-группа аланина дает сигнал в сильных полях (8 = 1,3 м.д.), где нет сигналов протонов молекулы лизина, и также может служить репернои точкой при исследовании лизиновых дендримеров.
Исследование гомолизиновых дендримеров различных генераций методом ЯМР спектроскопии
В качестве модели дендримера нулевой генерации DO исследовали метиловый эфир лизина в солевой форме (LysOMe 2HCl).
Детальный анализ спектров, полученных для дендримеров нулевой, а также со 2-ой по 6-ую генерации позволил строго отнести все сигналы к соответствующим атомам (приложение 1). Как видно из спектра метилового эфира лизина (DO), сигнал, соответствующий атому 2, представляет собой мультиплет, один из этих сигналов находится в сильных полях (5 = 1,3 м.д.) и может частично перекрывать сигнал СНз-группы аланина в исследуемых дендримерах. Это обстоятельство затрудняет использование остатка аланина в качестве репера, поэтому для подтверждения структуры целевого дендримера было проведено сравнение значений интегралов сигналов протонов, соответствующих атомам внутренних и внешних остатков лизина. Полученные данные представлены в таблице 12.
Как следует из представленных данных, по мере увеличения числа генераций отношение значений интегралов сигналов внутренних и внешних атомов ассимптотически стремится к единице. Этот факт приводит к снижению точности метода для идентификации дендримерных структур высоких генераций.
Для дендримеров со второй по шестую генерации по химическому сдвигу удается различить внутренние и терминальные атомы 1 и 5, в то время как метиленовые группы 2, 3, 4 не разрешаются уже для второй генерации. Различие между внутренними и терминальными группами для атомов 1 и 5 связано с их химической неэквивалентностью: внешние атомы связаны с положительно заряженным атомом азота NH-?9 группы, а внутренние - с атомом азота амидной группы. Кроме того, для терминального атома 1 удается различить, с какой аминогруппой - а или є - он связан. Сигнал, который находится в более слабых полях, логично отнести к СН-группе, находящейся при а-аминогруппе вследствие дополнительного стягивания электронной плотности карбонильной группой. Интегральные величины данных сигналов равны, что подтверждает ожидаемую структуру дендримера (см. схему выше).
При сравнительном анализе спектров ПМР лизиновых дендримеров с 2 по 6 генерацию было обнаружено значительное изменение положения сигналов протонов внешних метиновых групп лизина при переходе от генерации к генерации, в то время как положение сигналов протонов внутренних групп лизина практически не изменяется. Значения сигналов протонов метиновых групп для дендримеров различных генераций представлены в табл. 13.
Графическое представление значений химических сдвигов метиновых протонов (рис. 43) в зависимости от номера генерации показывает, что для дендримеров 2-ой и 6-ой генераций сигналы лежат в более сильных полях по сравнению с сигналами 3-ей, 4-ой, и 5-ой генераций. Изменение положения сигналов протонов, соответствующих одному и тому же структурному фрагменту дендримера, при переходе от одной генерации к другой свидетельствует об изменении химического окружения соответствующего атома, которое, в свою очередь, может быть обусловлено структурными изменениями.
Направление изменения химических сдвигов, по-видимому, связано с изменением электронной плотности на атоме азота (с которым связан исследуемый атом) по мере сближения или удаления заряженных аминогрупп друг от друга. При сближении NHi+ групп равновесие смещается вправо, в сторону образования свободной аминогруппы, что приводит к уменьшению отрицательного индуктивного эффекта, оказываемого атомом азота на исследуемую метиновую группу, и смещению химического сдвига метинового протона в сильные поля.
Данные эксперимента показывают, что наибольший сдвиг в сильные поля наблюдается для D2 и D6, что свидетельствует о более сильном эффекте, вызванном сближением аминогрупп. В случае D2, который условно относится к дендримерам и является низкомолекулярным соединением, близость аминогрупп задана геометрией молекулы и аминогруппы не могут удалиться друг от друга, в то время как для D6 данный эффект обусловлен повышением плотности упаковки лизиновых звеньев во внешнем слое макромолекулы по сравнению с D3, D4 и D5.
С целью выявления закономерностей распределения локальной плотности звеньев лизина в единице поверхности дендримерной молекулы (р) в зависимости от номера генерации был произведен расчет величины р для дендримеров со второй по шестую генерации на основе экспериментально полученных гидродинамических радиусов (Rh).
Из данных, представленых на рис. 44, видно, что плотность проходит через минимум на четвертой генерации, а максимальные значения плотности наблюдаются для дендримеров 2-ой и 6-ой генераций. Сравнение зависимостей, представленных на рис. 43 и рис. 44, показывает, что изменение положения химических сдвигов терминальных метановых протонов хорошо коррелирует с изменением локальной плотности структурных звеньев на поверхности дендримера при переходе от генерации к генерации.
Таким образом, взаимное влияние терминальных аминогрупп в исследуемых дендримерах в зависимости от номера генерации является индикатором изменения локальной плотности структурных звеньев данных макромолекул.
Дендримеры на основе лизина являются по своей природе полиэлектролитами. Известно, что взаимное влияние соседних дискретных зарядов увеличивается с уменьшением расстояния между ними. С целью выяснения взаимного влияния заряженных аминогрупп в дендримерной макромолекуле было проведено потенциометрическое титрование дендримеров третьей и пятой генераций.
