Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 9
1.1. Сопряжение ДНК с твердотельной электроникой 10
1.1.1. Подготовка поверхности кремния 10
1.1.2. Взаимодействие протравленной поверхности кремния с компонентами раствора 15
1.1.3. Поверхностные электронные состояния монокристаллов кремния 23
1.1.4. Исследования электронных свойств интерфейса ДНК-кремний с помощью контактов металл-полупроводник 27
1.2. Соединения фенантролина и их свойства 32
1.2.1. Противоопухолевая активность фенантролиновых соединений 32
1.2.2. Хемосенсоры на основе фенантролина 37
1.2.3. Потенциальное применение соединений фенантролина 40
1.2.4. Взаимодействие фенантролиновых соединений с различными
поверхностями 46
1.3. Иммобилизация ДНК на различных поверхностях 54
1.3.1. Иммобилизация ДНК на подложке из кремния в присутствии ионов магния 54
1.3.2. Фиксация ДНК на поверхность слюды 57
1.3.3. Ориентация ДНК на поверхности подложки 61
1.3.4. Фиксация ДНК на поверхность золота 64
ГЛАВА 2 68
2.1. Материалы 69
2.2. Методика фиксации ДНК на подложки 70
2.3. Создание диодов Шоттки 71
2.4. Метод поверхностного плазмонного резонанса 72
2.5. Метод атомной силовой микроскопии 75
2.6. Исследование электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний 77
2.6.1. Обоснование методики эксперимента 77
2.6.2. Идеальный шоттки-контакт 78
2.6.3. Вольт-амперная характеристика барьера Шоттки 82
2.6.4. Вольт-фарадная характеристика барьера Шоттки 84
2.7. Вискозиметрия 86
2.8. Программное обеспечение 88
ГЛАВА 3 89
3.1. Светоуправляемая фиксация ДНК на поверхность кремния 90
3.2. Исследование электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний 101
3.2.1. Результаты измерений вольт-амперных характеристик (ВАХ) 102
3.2.2. Результаты измерений вольт-фарадных характеристики (ВФХ) 105
3.3. Фиксация ДНК при помощи серосодержащего производного фенантролина ...109
3.3.1. Фиксация на золотую поверхность 110
3.3.2. Фиксация на поверхность слюды 134
3.3.3. Фиксация на поверхность кремния 141
3.3.4. Взаимодействие соединения фенантролина с молекулой ДНК в растворе..148
Заключение 158
Список литературы
- Подготовка поверхности кремния
- Противоопухолевая активность фенантролиновых соединений
- Метод поверхностного плазмонного резонанса
- Фиксация ДНК при помощи серосодержащего производного фенантролина
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Благодаря уникальным свойствам молекулы ДНК, в частности, ее способности к самоорганизации, она стала активно использоваться для создания наноструктур с заранее определенной геометрией, которые можно использовать как составные части электрических наносхем. Перспектива использования ДНК в твердотельной электронике при создании электрических схем и биосенсоров требует тщательного изучения вопросов фиксации макромолекулы на поверхность кремния, который является основой современных электрических микросхем. В частности, фиксация заряженной молекулы ДНК может влиять на электрические свойства приповерхностной области полупроводниковой подложки. С другой стороны, для зондовой микроскопии биологических полимеров и их комплексов необходим способ фиксации, при котором исследуемый объект испытывает минимальные возмущения, а методика фиксации не оказывает влияния на характер комплексообразования. Разработка новых способов фиксации полимеров на подложках различных типов является важной задачей. С развитием в последние годы метода поверхностного плазмонного резонанса применительно к исследованию взаимодействия ДНК с различными соединениями в растворе возникла потребность в простом и надежном способе подготовки чипов, содержащих на золотой поверхности ДНК. Сказанное выше свидетельствует об актуальности проводимых в работе исследований. На данный момент электрофизические свойства интерфейса ДНК-кремний практически не изучены, существующие методы фиксации ДНК на различные подожки не всегда можно использовать для корректного отражения изучаемого взаимодействия, а метод плазмонного резонанса, находящий все более широкое применение для решения задач в области физики полимеров и молекулярной биофизики, требует расширения возможностей модификации чипов. Таким образом, выполненные в работе исследования представляют практический интерес для использования в биомедицинских и нанотехнологических разработках. Цели и задачи работы. Целью диссертационной работы является разработка новых способов фиксации высокомолекулярной ДНК на поверхности слюды, кремния и золота, а также изучение сформированных на подложке структур. В диссертации решаются следующие задачи: Подбор оптимального способа фиксации ДНК на поверхности кремния
для дальнейшей металлизации. Осуществление металлизации зафиксированных молекул ДНК на
слюде, стекле, кремнии. Изучение электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний. Рассмотрение взаимодействия ДНК в растворе с серосодержащим
производным фенантролина, используемым для модификации
поверхности подложки. Разработка способа фиксации молекул ДНК на модифицированные
серосодержащим производным фенантролина поверхности золота,
кремния, слюды и стекла. Подбор условий для исследования систем ДНК-лиганд методом
поверхностного плазмонного резонанса. Сравнительный анализ различных способов фиксации ДНК на
поверхности. Научная новизна. В работе впервые предложены способы фиксации ДНК на поверхность кремния с использованием облучения. Впервые показана возможность формирования протяженных упорядоченных фибрилл ДНК (несколько параллельно уложенных молекул ДНК) на поверхности кремния и проведена их металлизация. Впервые проведена оценка плотности поверхностных состояний кремния после фиксации ДНК. Предложен новый способ размещения на поверхности золота, кремния, слюды серосодержащего производного фенантролина, обеспечивающего последующую фиксацию ДНК на модифицированные поверхности.
Положения, выносимые на защиту:
Характер фиксации ДНК из раствора на поверхность кремния зависит
от облучения образца. Участие ДНК в формировании интерфейса Au-кремний существенно
изменяет его электрофизические свойства. Качество металлизации ДНК на подложке зависит от свойств
сформированных на поверхности структур. Адсорбционные свойства фенантролина на поверхности золота,
кремния, слюды могут быть значительно улучшены путем введения
серосодержащей группы. Модифицированные серосодержащим фенантролином поверхности
слюды, золота и кремния способны фиксировать ДНК из раствора.
Достоверность полученных результатов подтверждается
согласованностью данных, полученных различными методами и их воспроизводимостью. Результаты были апробированы на всероссийских и международных конференциях X International Conference on “Nanostructured Materials”, 11th Internatioal Conference on Atomically Controlled Surfaces, Interfaces and Nanostructures, 17th IUPAB International Biophysics Congress, The 8-th International Symposium “Molecular Order and Mobility in Polymer Systems, 6 Всероссийская Каргинская конференция «Полимеры — 2014» и опубликованы в 6 статьях в рецензируемых журналах.
Личный вклад автора заключается в непосредственном проведении всех экспериментов, в обработке и анализе полученных данных, участии в обсуждении результатов, подготовке публикаций по теме диссертации и написании работы. Металлизация ДНК проводилась совместно со
студенткой Пучковой А.О. Вольт-амперные и вольт-фарадные характеристики интерфейса ДНК-кремний получены совместно с инженером Базловым Н. В. Часть исследований выполнена на оборудовании ресурсных центров СПбГУ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и содержит 171 страницу, 113 рисунков, список использованных источников включает 158 наименований.
Подготовка поверхности кремния
Перед использованием кремния в качестве подложки для зондовой микроскопии или электроники его поверхность необходимо очистить, чтобы убрать как образовавшийся в процессе хранения оксид кремния, так и адсорбировавшиеся из окружающей среды соединения. Таким образом можно исключить появление артефактов. В работе [28] описан процесс травления кремния в плавиковой кислоте. Контроль поверхности проводили с помощью методов фотоэлектронной спектроскопии и дифракции электронов низкой энергии (LEED). Авторы использовали пластины кремния p- и n-типа проводимости с ориентаций (100), (111) и (211). Сопротивление образцов варьировалось от 0.005 до 35 Омсм. В работе отмечается, что после травления проводить сушку образцов не требуется, так как их поверхность становится абсолютно гидрофобной. Независимо от конкретных условий травления в HF и типа образцов, формируется H-терминированная поверхность. Как видно из рис. 1.1.1, после травления образцов с естественным слоем окисла образуется H-терминированная поверхность с примесями углерода, фтора и кислорода. Авторы отмечают, что фтор быстро замещается на OH-группу, последующие превращения которой приводят к образованию оксида. Количество кислорода можно уменьшить, если использовать смесь плавиковой кислоты с этанолом. С течением времени при выдержке на воздухе или в воде, как следует из рис. 1.1.2, поверхность окисляется до нескольких монослоев оксида кремния. При окислении в воде также образуется слой субоксида, которой впоследствии переходит непосредственно в оксид. углеродом и фтором от концентрации воздухе и в бидистиллированной воде Авторы работы [29] предлагают новый способ измерения концентрации силанольных групп (Si-OH) на поверхности кремния при помощи вещества tridecafluoro-1,1,2,2,etrahydrooctyl dimethylchlorosilane (FOCS), растворенного в хлороформе. Этим соединением обрабатывали образцы перед проведением рентгеноструктурного анализа, при помощи которого определяли концентрацию фтора на поверхности, которая, по мнению авторов, пропорциональна концентрации Si-OH (рис. 1.1.3). Рис. 1.1.3. Концентрация фтора на соответствующих подложках кремния, содержащих Н, Н/ОН и ОН группы на поверхности [29].
Для приготовления H-терминированной поверхности пластинки кремния с ориентацией (100) были протравлены в 0.5% водном растворе HF. В дальнейшем эти образцы использовали для создания H/OH-терминированной поверхности путем непродолжительной выдержки в воде и OH-терминированной поверхности при травлении в H2SO4:H2O2 (1:4), при этом обеспечивается высокая степень окисления. Надо отметить, что авторы [29] не приводят данных о температуре, при которой осуществляли подготовку поверхности. Так, например, в работе [30] показано, что при температуре выше 200o C происходит полное замещение OH групп на используемый в работе реагент (характерное время замещения порядка 20 минут).
На реактивность поверхности кремния можно влиять светом подходящей длины волны. Авторы работы [31] использовали образцы кремния n-типа проводимости с ориентацией (111) и сопротивлением порядка 30 Омсм. Подложки были предварительно очищены и протравлены в течение 15 минут в 40% NH4F для получения H-терминированной поверхности. Образцы облучали светом с длиной волны 800 нм. Измерение скорости роста оксида проводили при помощи метода генерации второй гармоники - Second harmonic generation-RA (RA-SHG). Было показано (рис. 1.1.4), что скорость окисления изменялась на порядок при облучении. Авторы отмечают, что в воде оксид растёт быстрее, чем на воздухе. В работе предполагается, что изменение скорости роста оксида связано с генерацией светом электрон-дырочных пар. Под действием поля в ОПЗ электроны попадают на поверхность полупроводника, где реагируют с кислородом или водой, катализируя рост оксида. Рис. 1.1.4. Зависимость начальной скорости окисления от освещения (в количестве фотонов на квадратный сантиметр в сек) [31].
В работе [32] использовали кремний n-типа проводимости с ориентацией (111) и (100) с сопротивлением от 1 до 10 Омсм. Изначально образцы были очищены в 30% H2O2:H2SO4 (1:2) в течение 15 минут при температуре 80 oC, потом промыты водой и помещены во взвешенный в аргоне 40% раствор NH4F на 15 минут, после чего снова промыты. Измерения при облучении образцов различными длинами волн проводили методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии. По приведенным в работе графикам (рис. 1.1.5) нельзя сделать вывод о степени окисления образцов в темноте без облучения. Результат свидетельствует только о том, что некоторое количество кислорода присутствует на поверхности. Найденный максимум степени окисления при использовании облучении с длиной волны 250 нм во влажном и сухом воздухе авторы связывают с двухэтапным процессом окисления поверхности кристалла. На первом этапе за счёт энергии фотонов связь Si-H дестабилизируется или разрушается, что приводит к реакции атомов кремния с кислородом. Второй этап соответствует росту на этой части поверхности оксида за счет поступления неравновесных носителей заряда из объема полупроводника.
Противоопухолевая активность фенантролиновых соединений
По данным Федеральной Службы Государственной Статистики в 2012 году от злокачественных новообразований в России умерло 309 226 человек [50], что делает этот вид заболеваний одним из самых опасных. На сегодняшний день во всем мире разрабатывается и проходит испытания огромное количество различных противоопухолевых препаратов. При этом лечебные свойства последних не отвечают современным требованиям, причиняя большой вред организму в целом. Так, один из наиболее активных препаратов циплатин обладает нефротоксичностью, вызывает миелодепрессию и ряд других побочных эффектов, что ограничивает его широкое использование. В связи с наличием серьезных побочных эффектов у современных препаратов в настоящее время ведутся поиски новых более эффективных и менее опасных соединений. Среди них есть препараты, содержащие производные фенантролина. Структура фенантролина показана на рис. 1.2.1.
В работе [51] было показано, что производные ванадия с координированными молекулами 4,7-диметил-1,10-фенантролина оказывают более сильное биологическое воздействие по сравнению 1,10-фенантролином, 2-2 -бипуридином и 5 -бромо-2 -гидроксиацетофеноном. При этом лучшие результаты показало соединение бис-(4,7-диметил-1,10-фенантролин)сульфатооксованадиум (IV), которое имеет следующие показатели IC50 (мкМ): для клеток лейкемии (NALM-6, MOL Т-3 и HL-60) — 0.2, 0.19, 0.98; для лимфомы Ходжкина (HS445) — 0.5; для множественной миеломы (U266BL, ARH77 и УГ-Султан) — 0.5, 0.81, 0.8; для рака яичка (833K, 64cp, TERA-2, и NT2D1) — 0.85,0.75,19.5, 10.8; для глиобластомы (U373) — 1.8; для рака молочной железы (BT-20) — 1.4; для рака предстательной железы (PC3) — 1.7. Это превосходит показатели некоторых современных лекарств.
В работе [52] был проведен сравнительный анализ препаратов, структура которых изображена на рис. 1.2.2. Они показали себя как перспективные противоопухолевые агенты (см. рис. 1.2.3). При этом препарат L1 оказался самым лучшим из известных на тот момент антибиотиков против бактерий streptomyces coelicolor. [PtL CIJ/L2). [b] Resistance factor = 1С 5O(A2780R}/IC50(A2780). Рис. 1.2.3. Таблица, приведенная в работе [52] для значений IC50 in vitro для лигандов и комплексов платины по отношению к нескольким опухолевым клеточных линиям.
В работе [53] было проведено сравнение действия препаратов на основе 1,10 34 фенантролина и используемых в медицине противораковых препаратов. Эксперимент показал высокую эффективность соединения под номером 7 (рис. 1.2.4).
Рис. 1.2.4. Таблица из работы [53]. Цитотоксическая активность производных 2,4-диарил-5,6-дигидро-1,10-фенантролина с фурилом или тиенилом в 4-позиции против различных линий раковых клеток в сравнении с другими препаратами. Приведена структура соединения под номером 7.
Оценка противоопухолевой активности 1,10-фенантролина и его комплексов с лорноксикамом (противовоспалительный препарат LOR) и различными металлами по отношению к клеткам рака молочной железы MCF7 показала интересный результат [54]. Эффект 1,10-фенантролина по показателю IC50 (мкг/мл) оказался в несколько раз выше: 4.73 против 13.7 для [Cr(LOR)(Phen).Cl2]Cl.2H2O, 12.7 для [Mn(LOR)2(Phen)]Cl22H2O, 17.2 для [Fe(LOR)2(Phen).]Cl3, 17.2 для [Fe(LOR)(Phen).2H2O] (BF4)2, 23.1 для [Ni(LOR)(Phen).Cl2].H2O и 9 для [Zn(LOR)(Phen)(H2O)2](BF4)2. Это указывает на самостоятельную роль этого соединения в механизме цитооксичности.
Таким образом, можно говорить о том, что препараты на основе 1,10-фенантролина являются перспективными и востребованными в терапевтической практике. К сожалению, биологическая активность противораковых соединений на основе фенантролина изучена недостаточно.
Условно можно выделить три основных механизма действия противоопухолевых препаратов, содержащих металлы (это типично и для препаратов, содержащих 1,10-фенантролин): генерация реактивных форм кислорода (например, H2O2, ОН, O2-), которые повреждают хромосомную ДНК, изменение метаболизма и гомеостаза ионов металлов (таких, как Fe, Cu и Zn), и, наконец, ингибирование синтеза ДНК [55]. Последнее дает возможность исследовать потенциальные противоопухолевые препараты на уровне простых систем — водно-солевых растворов ДНК с изучаемым препаратом. Действительно, практически любые соединения, связывающиеся с данным биополимером (по азотистым основаниям), могут нарушать процессы транскрипции и трансляции ДНК в раковой клетке. В качестве примера можно привести работу [56], где была показана не только цитооксичность препарата цис хлородиметилсульфоксид-S-би(1,10-фенантролин) рутения (II), но и определено наличие взаимодействия препарата с ДНК тимуса теленка in vitro методами спектрофотометрии, флуоресценции и гель-электрофореза. Множество статей посвящено данной тематике. В целом отмечается, что 1,10-фенантролин в составе комплексов металлов может частично интеркалировать в ДНК, при определенных условиях вызывая ее расщепление [57]. Последнее нашло применение в изучении взаимодействия белков с ДНК методом футпринтинга [58]. Метод основан на расщеплении ДНК в местах, где она не связана с белком. Что дает возможность определить участки ДНК, взаимодействующие с белком. За последние годы было синтезировано множество производных 1,10-фенантролина для повышения выхода реакций расщепления ДНК.
Стоит остановиться работах, посвященных синтезу нуклеаз на основе 1,10-фенантролина, проявляющих специфичность к определенным последовательностям ДНК. Так, было предложено модифицировать по 5 -позиции последовательность d(TTTCCTCCTCT) 1,10-фенантролином. В эксперименте использовалась ДНК вируса, содержащая лишь один комплементарный к модифицированной фенантролином последовательности участок. В присутствии ионов меди и восстановителя при температуре 20o С эффективность расщепления составила более 70%. При более низких температурах происходило неспецифичное расщепление, связанное с образованием частично некомплементарного дуплекса.
Другой подход к разработке специфических нуклеаз был предложен в работе [59]. Используя сложные комплексы родия, авторам работы удалось добиться расщепления ДНК по определенным последовательностям. Фоторасщепительные реакции под действием облучения с длиной волны 313 нм проводились с использованием 5 -меченых 76/77-мерных олигонуклеотидов. Результаты представлены на рис. 1.2.5.
Метод поверхностного плазмонного резонанса
За последние годы был накоплен огромный материал по способам фиксации ДНК на подложки из различных материалов. Для каждой технологии иммобилизации характерна различная сила сцепления биополимера с поверхностью, на которую происходит фиксация. Существуют способы фиксации, при которых биополимер настолько прочно связывается с подложкой, что дальнейшие его конформационные изменения под действием внешних сил (сила трения, центробежная сила или поверхностное натяжение) становятся невозможными. При других способах фиксации макромолекула остается относительно подвижной и может менять размеры и форму на поверхности после иммобилизации. Надо отметить, что в процессе фиксации биополимер претерпевает различного рода воздействия, которые могут привести к изменению конформации, диаметра, длины, проводимости полимера и т.д. Для решения различных задач используют разные способы фиксации. Так, для биофизических исследований важно, чтобы ДНК испытывала минимальные возмущения. Для наноэлектроники необходимо прочно зафиксировать бионаноструктуры или создать условия для их сборки прямо на поверхности полупроводника.
Постоянно растущий инструментарий современных супрамолекулярных нанотехнологий на основе ДНК [1, 96] и РНК [97, 98] требует многостороннего изучения явлений, связанных с предполагаемыми областями их применения. В частности, получаемые по технологии РНК и ДНК-оригами стуктуры с пространственным разрешением до 6 нм могут быть применены как части электрических наносхем [98, 99]. Таким образом, встают вопросы об электрических свойствах данных структур, а также о характере их взаимодействия с различными поверхностями, на которых эти схемы будут располагаться. Исследование электрофизических свойств ДНК проводится с высокой интенсивностью, при этом проводимость этого биополимера претерпевает значительные изменения в зависимости от условий эксперимента [100]. Таким образом, вопрос фундаментальных механизмах электропроводности остается открытым.
Взаимодействие ДНК и РНК с поверхностями можно рассматривать в разрезе методик фиксации биополимеров на подложки различных типов. Это актуально при исследовании нуклеиновых кислот и их комплексов с различными лигандами методами микроскопии [101, 102], а также при изготовлении биочипов [103]. С развитием в последние годы метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР) применительно к исследованию взаимодействия ДНК с белками [104, 105] и различными лигандами [106, 107] также возникла потребность в простом и надежном способе подготовки чипов, содержащих ДНК на золотой поверхности. Развитие методик фиксации позволили бы осознанно подойти к созданию и проектированию новых биосенсоров [108, 109] и управляемых супрамолекулярных структур на основе ДНК-оригами [110, 111] в будущем.
Существует целый ряд способов химической модификации поверхностей и фиксируемых на них олигонуклеотидов группами, которые могут образовывать прочные связи между собой [112-114]. Часто используемые схемы фиксации олигомеров на стекле изображены на рис. 1.3.1. Надо отметить, что модификация ДНК тиоловой группой является универсальным способом и подходит не только для стекла, но и для практически любой поверхности.
Рис. 1.3.1. Таблица различных способов иммобилизации ДНК на поверхность стекла [113], которые подходят и для кремния, а часть из них для золота. Отметим, что данные методики подходят для узкого круга задач, таких как создание биосенсоров или определенных наноструктур. Они являются частным решением задачи по фиксации ДНК, зачастую приводящей к дорогостоящим манипуляциям, усложняющим эксперимент. Поэтому обратимся к более универсальным подходам. 1.3.2. Фиксация ДНК на поверхность слюды
Первые изображения ДНК на поверхности слюды были получены при помощи ионов Mg2+[115, 116]. Слюду скалывали при помощи лезвия или липкой ленты, далее подложки выдерживали в течение ночи в растворе 33 mM ацетата магния. После чего подложки промывали и наносили раствор 10-100 мкг/мл ДНК на 2 минуты, затем еще раз промывали водой. Это позволяло получить хорошо воспроизводимые изображения ДНК при помощи АСМ, см. рис. 1.3.2.
После чего были проделаны эксперименты по возможности фиксации ДНК при помощи Ca2+, Ba2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Cr2+, La3+ и Zr+4, которые оказались успешными [117]. При этом разные ионы с разной силой связывают ДНК с поверхностью. Например, для измерения ДНК методом АСМ в жидкости используют Ni2+, так как Mg2+ в растворе фиксирует ДНК недостаточно статично [101]. Так, авторы работы [117] связывают силу фиксации ДНК с ионным радиусом металлов. На рис. 1.3.3 приведены АСМ-изображения раствора ДНК, высаженной из раствора 0.5 нг/мкл, содержащего 1 mM MCl2 (M — соответствующий металл). Было показано, что чем больше ионный радиус используемого металла, тем хуже он подходит для фиксации ДНК и сканирования методом АСМ в жидкости
Фиксация ДНК при помощи серосодержащего производного фенантролина
Поверхности подложек, подготовленных для фиксации ДНК, представлены на рис. 3.1.1. Шероховатость поверхности можно оценить по величине RMS (среднеквадратичного значения размера неровности Sq). Уровень поверхности фиксируется как среднее значение высоты поверхности:
Для используемых образцов величина Sq составила 0.15-0.30 и 0.10-0.20 нм для подложек из кремния и слюды соответственно. Таким образом, неровность поверхности кремния значительно ниже толщины ДНК в B-форме (2 нм) и чуть выше неровности поверхности слюды.
Фиксация молекул ДНК на подложке из кремния в присутствии ионов Mg++ (рис. 3.1.2 б) идёт более эффективно, нежели при его отсутствии (рис. 3.1.2 а). Можно видеть, что в отсутствии ионов магния молекулы ДНК вытягиваются на подложке, причем наблюдается формирование разветвленных структур. Присутствие магния обеспечивает более плотную посадку макромолекул, при этом видно формирование фрактальных структур, состоящих из разветвляющихся «жгутов». Последние представляют собой несколько параллельно уложенных молекул, собранных вместе. Рассмотренный результат свидетельствует о том, что магний не является необходимым компонентом раствора для фиксации ДНК, но он провоцирует образование фибрилл или «жгутов», по-видимому, в результате электростатического взаимодействия с соседними молекулами ДНК. Без магния промывка образца в одном направлении струе дистиллированной воды после выдержки капли раствора в течение 10 минут приводит к ориентации макромолекул. В некоторых случаях также наблюдается образование структур, содержащих несколько молекул ДНК. Вероятно, в этом случае гидрофобная поверхность кремния [123] провоцирует собирание макромолекул вместе. Эта же причина может проявляться и в присутствии магния, который дополнительно обеспечивает «скрепление» макромолекул с помощью электростатического взаимодействия с фосфатными группами разных цепей.
Рис 3.1.2. АСМ изображения ДНК на поверхности кремния при концентрации магния 0 (a) и 510-3 (б) M в растворе, из которого производилась фиксация полимера.
Если предварительно обработать протравленную поверхность кремния раствором MgCl2 (каплю 510-3 M раствора наносили на 10 минут, после чего ее сдували потоком воздуха), можно также видеть последующую фиксацию ДНК из раствора без магния с формированием «жгутов» (рис. 3.1.3 а). Отсюда можно сделать вывод, что магний в первую очередь модифицирует поверхность кремния, так как после промывания такой подложки водой перед иммобилизацией ДНК поверхность остается практически свободной от макромолекул после процедуры фиксации (рис. 3.1.3 б) и имеет такой же вид, как при фиксации ДНК из раствора без магния (рис. 3.1.2 а). По-видимому, магний не очень прочно (вероятно, электростатически) связывается с подложкой и может быть смыт с неё потоком воды. Присутствие соляной кислоты в растворе MgCl2, используемом для обработки поверхности кремния перед фиксацией ДНК, препятствует закреплению макромолекул на подложке (рис. 3.1.3 в), что может быть связано с конкуренцией между H+ и Mg2+ при связывании с поверхностью кремния.
АСМ изображения ДНК, зафиксированных на модифицированной магнием подложке кремния. Подложки (а) и (б) выдерживались 10 мин. в 5 mM MgCl2 , а подложка (в) - в смеси 5 mM MgCl2 и 10% HCl в течение 10 минут. Затем образцы (а) и (в) высушивали направленной струей воздуха, а подложка (б) промыта водой. После описанной обработки на подложки наносили раствор 2.510-3 % ДНК, не содержащий ионов магния.
Надо отметить, что после выдержки в течение 30 минут иммобилизованных на подложке кремния молекул в воде или 10% соляной кислоте и последующего промывания водой в одном направлении макромолекулы не меняли свою ориентацию, несмотря на то, что промывание было осуществлено в направлении отличном от изначальной ориентации макромолекул на подложке. Отсюда можно сделать вывод, что после фиксации ДНК достаточно прочно закреплена на подложке и не меняет свою конформацию под действием гидродинамических сил, что согласуется с данными работ [122, 126].
Описанный способ создания образцов с ориентированными на поверхности кремния фибриллами может найти применение при конструировании электронных устройств. Например, их можно использовать в качестве шаблонов для создания нанопроволок или элементов биодатчиков.
На рис. 3.1.4 (а, б) приведен пример таких нанопроволок, приготовленных совместно с Анастасией Пучковой путем восстановления ионов серебра. Металлизацию предварительно зафиксированных в виде фибрилл ДНК на поверхности кремния n-типа проводили путем нанесения раствора AgNO3 в концентрации 5 mМ. В течение 15 минут образец выдерживали в темноте и промывали водой. Затем образец экспонировали в 4 mМ растворе гидрохинона в течение 15 минут, так же в темноте. После чего образец промывали водой и высушивали. После проведения процесса металлизации по алгоритму, описанному выше, наблюдалось образование по большей части однородных кластеров серебра, равномерно расположенных на макромолекуле. Анализируя АСМ-изображения можно заключить, что диаметр кластеров составляет примерно 30 нм . Использованный в методе гидрохинон проявил себя как агент, придающий структурам большую однородности, а не как восстановитель серебра. Такой вывод можно сделать, так как фибриллы ДНК обрастали наночастицами частицами серебра и до обработки гидрохиноном. Но в этом случае их размер был гораздо больше. Исходя из этого механизм металлизации ДНК допустимо представить следующим образом. Ионы серебра связываются в растворе c отрицательно заряженными молекулами ДНК. Учитывая, что поверхность кремния n-типа, которая использовалась для иммобилизации молекул ДНК, является полупроводником с основными носителями заряда - электронами, то процесс восстановления серебра идет за счет туннелирования электронов через биополимер из кремния. Таким образом, восстановление серебра носит электрохимический характер. Рис 3.1.4. АСМ (а) и СТМ (б) изображения металлизированных восстановлением серебра фибрилл ДНК. СЭМ (в, риска 200 нм) и СИМ (г, риска 100 нм) изображение поверхности кремния, обработанной ДНК, а затем раствором, содержащим серебряные наночастицы.
Декорирование созданных на окисленной поверхности кремния n-типа ДНК-фибрилл возможно провести при помощи уже готовых наночастиц серебра. Так, образец сначала обрабатывали раствором ДНК, а затем наночастиц. Анализируя изображения, полученных с помощью сканирующих электронного (рис. 3.1.4, в) и гелиевого микроскопов (рис. 3.1.4, г), можно предположить, что наночастицы серебра кубической формы, закрепились вдоль молекул ДНК . В то же время биополимер мог быть лишь отправной точкой начала роста агрегатов наночастиц. В связи с тем, что на окисленной поверхности кремния ДНК фиксируется преимущественно в виде сеток, такой механизм также вполне вероятен.
Как правило, макромолекулы ДНК ориентированы в направлении промывания. Из анализа АСМ снимков видно также, что отдельные нити полимера изгибаются по направлению потока. Это даёт основание полагать, что именно поток воды растягивает ДНК вдоль направления промывания.
На рис. 3.1.5 приведены результаты эксперимента по растягиванию ДНК на слюде по описанной в разделе «Материалы и методы» методике: на свежесколотую поверхность слюды наносили каплю раствора ДНК объемом 5 мкл и через 3 минуты накрывали сверху второй свежесколотой подложкой слюды (поверхности были прижаты одна к другой). Затем подложки сдвигали друг относительно друга в одном направлении, промывали 3 мкл дистиллированной воды в направлении параллельном направляющей сдвига для удаления незафиксированных макромолекул, а затем сушили в вакууме в течение 10 минут. Видно (рис. 3.1.5 б), что после первой процедуры растягивания и фиксации часть макромолекул прочно связалась с подложкой и сохранила свою первоначальную ориентацию после повторного растяжения.
