Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 6
1.1. Свойства и перспективы использования хитозанов 6
1.2. Аналоги хитозана 21
1.3. Сополимеры, комплексы 35
2. Экспериментальные часть 42
2.1. Деацетилирование хитина 42
2.1.1. Деацетилирование хитина различного гранулометрического состава 42
2.1.2. Получение хитозана при использовании вторичного Щелочного реагента 42
2.2. Деполимеризация хитозана при действии пероксида водорода
2.2.1. Деполимеризация хитозана в гомогенной среде 43
2.2.2. Пероксидный метод деполимеризации хитозана в гетерогенной среде 44
2.2.3. Деполимеризация хитина и деацетилирование его гомологов 45
2.2.4. Определение молекулярной массы гомологов хитозана 47
2.3. Аналоговые превращения гомологов хитозана
2.3.1 .Взаимодействие хитозана с эпихлоргидрином 49
2.3.2.Хлоргидроксипропилирование салицилатов и 2-амино-Б-глюкопиранозы 50
2.3.3.Иммобилизация лекарственных субстанций в структуру хитозана
2.3.3.1. Изониазид 51
2.3.3.2. Стрептомицин 52
2.3.3.3. п-Аминосалициловая кислота 53
2.3.3.4. Салициловая кислота 54
2.3.3.5. Ацетилсалициловая кислота 56
2.3.3.6. Рутин 59
2.3.3.7. Лизин 60
2.3.3.8. Глицин 62
2.3.3.9. Глутаминовая кислота 62
2.3.3.10. Получение иодидов хитозана и его аналогов 63
2.3.4. Макромалекулярные реакции хитозана
2.3.4.1 .Синтез конъюгата поли - N - винилпирролидона с хитозаном 65
2.3.4.2. Синтез конъюгата хитозана с альгиновой кислотой 66
2.3.4.3. Синтез конъюгатов поливинилового спирта с хитозаном 67
2.3.5. Синтез металлокомплексов хитозана 69
3. Обсуждение результатов экспериментальных работ 72
3.1. Деацетилирование хитина 72
3.2. Деструция высокомолекулярных хитозанов 77
3.3. Полимераналогичные превращения низкомолекулярных полимергомологов хитозана 87
3.4. Полимерные формы йода на основе хитозана 106
3.5. Полимерные конъюгаты хитозана 107
3.6. Металлокомплексы хитозана с платиной 115
Выводы 128
- Аналоги хитозана
- Синтез металлокомплексов хитозана
- Полимераналогичные превращения низкомолекулярных полимергомологов хитозана
- Металлокомплексы хитозана с платиной
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время значительное внимание многих исследователей приковано к проблеме выделения и химической модификации природных полимеров. Среди большого многообразия биополимеров особое место занимает хито-зан. Уникальность хитозана обусловлена широким спектром проявляемых им свойств, среди которых следует особо выделить такие как биологическая активность, биосовместимость и нетоксичность. Это позволяет его использовать в химии, фармации, медицине. Поэтому исследования, связанные с химией такого биополимера, как хитозан, является важной задачей полимерной химии.
В настоящее время основным способом получения хитозана является ферментативный гидролиз, приводящий к получению большого количества побочных продуктов. Химический способ, заключающийся в окислительной деструкции хитозана недостаточно изучен, что не позволяет синтезировать хитозан с заданной молекулярной массой. В связи с этим актуальной проблемой является изучение механизма и закономерностей процесса деструкции хитозана, позволяющее определить условия синтеза полимера с требуемой молекулярной массой. Это является актуальным как с теоретической, так и практической точек зрения.
Помимо этого, наличие в макромолекулах хитозана реакционноспособных групп обуславливает его способность к полимераналогичным превращениям, с помощью которых можно осуществить синтез новых гидрофильных лекарственных форм на основе известных препаратов с пролонгированным действием, что также указывает на актуальность проведенных исследований.
Цель работы - синтез полимергомологов хитозана с различной молекулярной массой для получения на их основе новых полимерных форм известных лекарственных препаратов.
Научная новизна. Создан новый способ получения хитозана с содержанием незамещенных аминогрупп более 90%, отличающийся от известного использованием хитина с определенной степенью диспергирования частиц. Установлено, что оптимальным размером частиц хитина, обеспечивающим высокую степень деацетилирования и минимальную композиционную неоднородность хитозана, является 0,05-0,2 мм.
Определены условия синтеза полимергомологов хитозана в интервале
молекулярных масс от 1 до 150 кДа окислительной деструкцией пероксидом
водорода его высокомолекулярного гомолога.
Предложен новый метод расчета молекулярных масс низкомолекулярных хитозанов по концентрации концевых гликозидных групп.
Созданы методики активации хитозана взаимодействием его с эпихлоргидрином, формальдегидом и высокомолекулярными биосовместимыми соединениями, такими как поли-Ы-винилпирролидон и поливиниловый спирт.
Показано, что взаимодействие хитозана с известными лекарственными субстанциями (ацетилсалициловая, салициловая, п-аминосалициловая кислоты, изониазид, стрептомицин, рутин) не уменьшает фармакологического действия лекарственного средства и позволяет получить их водорастворимую форму.
Предложен аналитический способ оценки хлорида платины (IV) в комплексе хитозан-платина (IV).
Практическая значимость работы.
Разработан проект лабораторного регламента на получение хитозана, который защищен патентом «Способ получения хитозана из хитина». Автор защищает:
Получения полимергомологов хитозана с различной молекулярной массой. Кинетические закономерности окислительной деструкции хитозана пероксидом водорода.
Оригинальные химические методы определения молекулярных масс олигохитозанов. Методы активации хитозана взаимодействием его с эпихлоргидрином, формальдегидом и высокомолекулярными биосовместимыми соединениями, такими как поли-1Ч-винилпирролидон и поливиниловый спирт.
Способы синтеза лекарственных форм направленного действия на основе низкомолекулярного хитозана и известных лекарственных субстанций.
Аналитический способ оценки хлорида платины (IV) в комплексе хитозан-платина (IV).
Проект лабораторного регламента на получение хитозана, который защищен патентом «Способ получения хитозана из хитина».
Апробация работы. VII съезде фармацевтов республики Беларусь «Фармация XXI века» (Минск, 2004); III всероссийской конференции Физико-химические процессы в конденсированном состоянии на межфазных границах ФАГРАН-2006 (Воронеж, 2006); всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ (Воронеж, 2005, 2007); XIV российском национальном конгрессе «человек и лекарство» (Москва, 2007); Международной научно-практическая юбилейной конференции «Проблемы здоровьесбережения школьников и студентов. Новые научные тенденции в медицине и фармации» (Воронеж, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ: 1 патент, 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 8 тезисов докладов конференций различных уровней. Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы (189 наименований). Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 5 рисунков.
Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована ее цель.
Аналоги хитозана
Не меньший интерес с точки зрения расширения практически значимых свойств хитозана представляют его химически модифицированные аналоги. Так получен N-триметилхитозанхлорид (ТХХ) — поликатион, который усиливает транспорт лекарственных веществ через эпителий [65] . Степень кватер-низации ТХХ определяет количество положительных зарядов на молекуле для взаимодействия с отрицательно заряженными участками на мембране клеток эпителия. Изучено влияние степени кватернизации (от 12 до 59%) на трансэпителиальное электрическое сопротивление монослоев клетки Сасо-2 и на транспорт гидрофильных и макромолекулярных модельных соединений через клетки Сасо-2. Установлено, что все тестированные ТХХ способны значительно снизить сопротивление при рН 6.2. Максимальное значение этого показателя достигается при степени кватернизации ТХХ 48% [65]. Пептидные лекарственные вещества характеризуются низкой биодоступностью. Высокая ММ и полярность исключают их доставку в твердых оральных формах. Для усиления проникновения макромолекул во внутриклеточное пространство предложено использование ТХХ. Хитозан малорастворим при рН 6.5, что препятствует его использованию в качестве эффективного усилителя проницаемости в кишечнике [66]. Триметилированные олигомеры хитозана (ТОХ), исследованы как системы доставки генов. Установлено повышение эффективности трансфек-ции. ТОХ не доступны для конъюгирования с пептидными лигандами и другими соединениями (аминогруппа триметилирована на 40%). Установлено, что структура б-О-карбоксиметил-К-триметилхитозана расширяет возможности конъюгирования и применения в терапии. В частности, этот аналог цожно использовать для доставки противораковых средств, пептидов и белков [67].
Для получения поперечно сшитых микрочастиц - конъюгатов с митоми-цином (0.2 мкм) предложен N-сукцинилхитозан. Метод получения - эмульгирование с применением карбодиимида. Отмечена высокая загрузка конъюгата лекарственным веществом; лекарственная форма обеспечивает доставку субстанции в печень [68]. Аскорбат хитозана получен путем суспендирования аминоглюкана в дистиллированной воде и последующего добавления эквивалентного количества аскорбиновой кислоты. Предложен также метод растворения сухого полимера в эквивалентном количестве 0,6% раствора аскорбиновой кислоты. На основе указанной композиции подготовлены образцы пленок и губок, стерилизованных радиационным способом. Проведено исследование их пролиферативной активности. Водорастворимые аскорбаты хитозана эффективны при дистрофически-дегенеративных заболеваниях суставов и позвоночника. Витамин С и олигосахарид взаимопотенцируют биологическое действие [69, 70]. Разработаны способы детоксикации при деструктивных формах панкреотита с использованием гелевых форм аскорбата и глутамината хитозана с ММ 10 - 200 кДа. Пероральное введение сорбентов является эффективным при экспериментальном жировом панкреонекрозе. В качестве осмотически активного гидрогеля 10% раствор аскорбата хитозана активно ускоряет заживление гнойных ран на фоне мембранного диализа [71, 72].
Наличие в структуре гликана 2-0- или З-О-сульфатных групп сообщает полимеру выраженную антикоагулянтную активность, а также свойство инги-бировать вирус иммунодефицита человека. Степень сульфирования NH2-rpynn не влияет на биоактивность. Макрочастицы, полученые адсорбцией хитозана и его сульфата, использованы в процессах включения белка (инсулин) для лечения диабета. Микроагрегаты инсулина получены при рН 3.0 путем образования комплекса в растворе с сульфатом аминоглюкана; частицы стабильны при рН 1.7 [73, 74].
Мембраны с селективной проницаемостью лекарственных веществ получены из алкилированного хитозана (бутилбромид, октилбромид), поперечно сшитого оксидированной глюкозой. Модельное биологически активное соединение, использованное в исследовании мембран - витамин В2 [75].
Для получения лекарственных агентов с пролонгированным действием синтезированы конъюгаты антибиотиков с хитозаном. Окислением хитозана НЮ4 (рН 4.0), взаимодействием с H2NCONH2 и активизацией формальдегидом получают иммобилизованный хитозан, содержащий группы NCONHCH2OH, который немедленно вводят в реакцию с тетрациклином при рН 8.0 или карминомицином (рН 8.0) [76]. Лекарственная форма пролонгированного действия рифампицина предложена в виде матричных хитозановых таблеток, получаемых непосредственным прессованием смеси хитозана и антибиотика с последующим воздействием на них паров формальдегида, применяемого в качестве сшивающего агента. Исследовано влияние степени структурирования на скорость высвобождения рифампицина и кинетику процесса его высвобождения. Кинетические характеристики процесса in vitro не соответствуют транспортной модели Фика. Увеличение времени экспозиции таблеток парами формальдегида снижает скорость высвобождения лекарства из хитозановых матриц. Варьированием степени сшивки возможно получить хи-тозановые матрицы с заданными характеристиками процесса высвобождения рифампицина [77]. Исследованы факторы, влияющие на активность иммобилизованного папаина на хитозане (СД 80%) и аминированной целлюлозе: рН реакции, концентрация глутарового альдегида и количество папаина. Изучены свойства этих иммобилизованных папаинов в сравнении с природным папаи-ном. Оптимальная температура реакции иммобилизации на хитозане и целлюлозе 80 С. После инкубации при 90 С в течение 1 часа активность папаинов сохранялась на уровне выше 95% [78].
Рассмотрено использование гранул сшитого оксиэтилхитозана в качестве иммуноадсорбентов. Исследовали активность иммобилизации ДНК и антител SLE на таких носителях [79]. Получен носитель противоракового лекарственного вещества паклитаксела. Реакцией хитозана с хлороцетаном в щелочных условиях получен цетил-хитозан, который спонтанно образует наносферы диаметром около 100 нм. Исследовали высвобождение загруженного в наносферы паклитаксела в фосфатном буфере рН 7.4. Скорость высвобождения уменьшается с увеличением степени алкилирования. Наносферы признаны пригодными носителями паклитаксела в водной среде [80]. Предложен препарат, в котором активная субстанция в форме нанозоля связана с заряженными производными хитозана и дополнительными полимерными носителями. Субстанции включены в нанозоли в коллоидной форме или в виде наночастиц. Препарат предназначен для перорального применения в виде порошка, грану-лята, таблеток или капсул с контролируемым высвобождением [81].
Исследована возможность получения хитозановых микросфер и их применение в качестве средств доставки антибиотиков в полость желудка. Проблема высокой растворимости полимера в кислой среде желудка решается ре-ацетилированием хитозана при обработке хитозановых микросфер Ас20. За одну стадию возможно провести микрокапсулирование антибиотика амоксициллина и получить лекарственную форму с различным механизмом высвобождения в зависимости от типа применяемого хитозана и степени реацетили-рования. Микросферы могут проходить эпителиальный барьер и обнаруживаются в эпителиальных клетках желудка через 1 час после введения. Хитозано-вые микросферы через 96 часов после введения проявляют способность высвобождать амоксициллин. Новая лекарственная форма рекомендована для лечения заболеваний желудка, вызываемых Helicobacter pylori [82]. Микросферы хитозана получали в дисперсии в/м с использованием в качестве сшивающего агента генипина, обладающего низкой цитотоксичностью. Методом Фурье-ИКС и 13С-ЯМР показано, что сшивка хитозана с помощью генипина ведет к образованию вторичных амидных и гетероциклических аминных связей. При взаимодействии между хитозаном и индометацином (рН 6.5) наблюдается образование комплекса со связями -CH2COO"NH3+. Выделение индометацина из микросфер хитозана зависит от их степени сшивки и взаимодействия между хитозаном и индометацином [83]. Приготовлены микросферы из хитозана, поперечно сшитого глутаральдегидом, на которые нанесено покрытие из Fe304. При использовании предложенной технологии снижение ММ хитозана обеспечивает получение мелких частиц ( 1мкм) с равномерным распределением. Из микросфер, загруженных аспирином, в течении 1 часа высвобождается 40% лекарственного вещества; при магнитно-направляемом покрытии из Fe304-15%. Сильный ответ на магнитное действие позволяет применять систему для направленной контролируемой доставки лекарственных веществ [84].
Синтез металлокомплексов хитозана
Цинк 1 г хитозана (0,006 моль) с ММ 600 кДа (СД 90 %) 1,63 г (0,012 моль) ZnCl2 в виде раствора в 100 мл 0,1н НС1 перемешивали при 50-60 С в течение 120 минут. Полученную реакционную массу выдерживали при температуре окружающей среды в течение суток после чего дегидратировали при 60С (-0.9 атм). Сухой остаток обрабатывали 50 мл этанола с целью экстракции не вступившего во взаимодействие с хитозаном хлорида цинка. Твердую фазу отделяли фильтрацией. Остаток на фильтре - твердый водорастворимый продукт - полимерный комплекс цинка на основе аминогликана. Выход конъюгата из соотношения хитозан: металлоион 1:2 1,20 г (66,7 %). Содержание металла определялось по методу мокрого сжигания. Разрушение полимера для определения металла проводилось с помощью смеси азотной и хлорной кислот в соотношении 5 : 3 в колбе Кьельдаля. 25мл полученного раствора переносили в коническую колбу, нейтрализовали аммиаком (по универсальной индикаторной бумаге), приливали 5 мл буферного раствора с рН = 9 - 10, добавляли на кончике шпателя индикаторную смесь и титровали 0,025 М раствором Na-ЭДТА до перехода окраски от фиолетовой в синюю. Содержание цинка (в %) вычисляли по формуле: где V - объем 0,025 М раствора Na-ЭДТА, пошедшего на титрование, мл; 0,0016345 -масса цинка, соответствующая 1 мл 0,025 М раствора Na-ЭДТА, г; m - навеска образца, г.
Концентрация цинка в металлокомплексе составляет 10,71%. Никель 0,5 г хитозана (0,003 моль) с ММ 10 кДа (СД 90 %) и 1,59 г (0,006 моль) Ni(N03)2"6H20 в виде раствора в 100 мл Н20 подкисленного 0,4 мл 0,1н НС1 до рН = 4-5 поместили в плоскодонную колбу, снабженную воздушным обратным холодильником. Реакционная масса перемешивалась на магнитной мешалке при 50-60 С в течение 120 минут. Наблюдали полную гомогенизацию системы. Полученную реакционную массу выдерживали при температуре окружающей среды в течение суток после чего досушивали в вакууме при 60 С. Сухой остаток обрабатывали 50 мл этанола с целью экстракции не вступившего во взаимодействие с хитозаном нитрата никеля. Твердую фазу выделяли фильтрацией. Остаток на фильтре — твердый водорастворимый продукт — полимерный комплекс никеля на основе аминогликана. Выход из соотношения хитозан: металлоион 1:1 1,20 г (59,7 %). Концентрация металла в коньюгате определялось вышеуказанным способом. Содержание никеля (в %) вычисляли по формуле где V - объем 0,025 М раствора Na-ЭДТА, пошедшего на титрование, мл; 0,00146775 - масса никеля, соответствующая 1 мл 0,025 Мраствора Na-ЭДТА, г; m - навеска образца, г.
Концентрация металла в полученном продукте составляет 7,12%.
Железо
2 г хитозана (0,012 моль) с ММ 600 кДа (СД 90 %) и 1,85 г (0,006 моль) FeCl3-9H20 в виде раствора в 150 мл воды поместили в плоскодонную колбу, снабженную воздушным обратным холодильником. Реакционная масса перемешивалась при 50-60С в течение 120 минут. Наблюдали полную гомогенизацию системы. Полученную реакционную массу выдерживали при температуре окружающей среды в течение суток после чего вакуумировали при 60С. Сухой остаток обрабатывали 50 мл этанола с целью экстракции не вступившего во взаимодействие с хитозаном хлорида железа. Твердую фазу выделяли фильтрацией. Остаток на фильтре — твердый водорастворимый продукт — полимерный комплекс железа на основе аминогликана. Выход конъюгата метал-локомплекса из соотношения хитозан: металлоион 2 : 1 составляет 2,25 г (61,8%). Концентрация металла в коньюгате определялось выше указанным способом. Содержание железа (в %) вычисляют по формуле где V - объем 0,025 М раствора Na-ЭДТА, пошедшего на титрование, мл; m - навеска образца, г.
Концентрация металла в полученном продукте составляет 9,10 %.
Платина
2 г хитозана (0,012 моль) с ММ 0,9 кДа (СД 90 %) и 0,27 г (0,0008 моль) PtCU растворили в 150 мл воды. Реакционная масса перемешивалась при 40-50С в течение 120 минут. Полученную систему выдерживали при температуре окружающей среды в течение суток после чего фильтрат реакционной массы вакуумировали при 60С. Сухой остаток обрабатывали 50 мл этанола с целью экстракции не вступившего во взаимодействие с хитозаном хлорида платины. Твердую фазу выделяли фильтрацией. Остаток на фильтре — твердый водорастворимый продукт - полимерный комплекс платины на основе аминогликана. Выход составляет 2,23 г (98,37%). Концентрация металла в коньюгате определялась путем мокрого сжигания. 0,3 г полимерного комплекса платины помещали в колбу Кьельдаля. Приливали смесь концентрированных азотной и хлорной кислот (5:3) и термостатировали при 300 С на песчаной бане в течение 20 мин. По окончании процесса в полученный прозрачный раствор добавили несколько капель 30% Н2О2. После чего наблюдалась седиментация коричневого нерастворимого в этаноле осадка (PtCl2), который отделяли фильтрацией с использованием, предварительно взвешенного на аналитических весах, фильтра из пористого стекла. Привес массы фильтра составил 0,0274 г, что соответствует содержанию платины в металлокомплексе 6,7%.
Полимераналогичные превращения низкомолекулярных полимергомологов хитозана
Различные гомологи хитозана отличающиеся различной степенью полимеризации и связанным с этим комплексом физико-химических свойств, используются как сырье для синтеза различных аналогов с низкомолекулярными боковыми цепями и продуктов полимерных реакций (полиэлектролитные комплексы, конъюгаты, привитые сополимеры и др.). Достаточно широко используются превращения геометрических форм макромолекул хитозана в сетчатые структуры (гомо- и сополимеры с различной степенью пространстаенного структурирования отличающиеся высокой способностью к влагопоглощению. Указанные производные нашли достаточно широкое применение для получения полимерных лекарственных форм, материалов медицинского назначения, препаратов лечебной косметики. Для успешного решения перечисленных задач по превращению хитозанов необходимы изменения дизайна макромолекул аминогликана путем введения в структуру элементарных звеньев дополнительных функциональных группировок, расширяющих реакционную способность этого полимера. Наличие в структуре аминоглюкозных звеньев хитозана свободных первичных аминогрупп, первичного и вторичного гидроксилов в достаточной степени обеспечивает реальность аналоговых превращений: N,0-алкилирование и ацилирование, введение заместителей, содержащих в своей структуре ненасыщенные связи, различные реакционоспособные функциональные - карбонильные, карбоксильные, сульфогидрильные, аминные, гидра-зинные и др. группы.
В рамках проводившегося исследования проведена разработка химической модификации различных полимергомологов хитозана путем введения в их структуру хлоргидроксипропиловых (глицидиловых) а также гидроксиме-тиловых группировок с образованием при этом C-N-связей.
Образующиеся при этом боковые цепи в структуре полимераналогов могут обеспечить присоединение с образованием ковалентных связей различных структурных компонентов, в том числе обладающих биологической активностью (лекарственных субстанций). Эти вторичные процессы могут развиваться путем взаимодействия с необходимыми функциональными группами в составе веществ (-NH2, -ОН, -СООН, -NH2NH и др.) при развитии реакций О- и N-алкилирования полимераналогов хитозана. В условиях иммобилизации указанным способом лекарственных субстанций в структуре полимерных лекарств присутствует связывающий фрагмент 2-гидроксипропил или СНг-структуры - спейсер. Наличие подобных элементов в составе полимерных лекарственных форм обеспечивает по современным данным их селективную адгезионную способность в очагах поражения организма. Наличие реакционно-способных структурных элементов в составе макромолекул амино-О-глюкана дает возможность перехода к пространственным геометрическим формам полимера, образованию сшитых гидрофильных структур, молекулярная пористость которых зависит в том числе от концентрации введенных в элементарные звенья полимера функциональных групп. Метод пространственного структурирования гидроксилсодержащих полимеров типа аминогликанов реализован и широко известен на примерах синтеза гельфильтрующих материалов типа сифадексов. При разработке и оптимизации способа получения N-хлоргидроксипропил (глицидил) аналогов хитозана использовались известные методики, предусматривающие применение в качестве алкилирующего агента для этой цели эпихлоргидрина (хлорметилоксирана). Высокая реакционная способность этого алкилирующего реагента отмечена при его взаимодействии со структурами, несущими первичные аминные группировки. В этом случае процесс N-алкилирования проходит без катализатора, а в ряде случаев (алки-ламины простейшей структуры) с экзотермическим эффектом. Наиболее активным фрагментом молекулы эпихлоргидрина является эпоксидная группировка, но практически имеет место взаимодействие с объектом алкилирования также С-С1-группировки. В зависимости от структуры объекта алкилирования образуются аналоги, несущие хлоргидроксипропил (ХГП) и глицидил заместители в различных соотношениях. В зависимости от связи, возникающей с алкилирующим компонентом может быть реализована возможность быстрого и простого взаимного превращения образующихся в результате алкилирования ХГП и глицидиловых группировок за счет варьирования рН среды в диапазоне рН 4 -»12, что позволяет осуществить дополнительное регулирование структуры образующихся производных. Реакционная способность при взаимодействии с эпихлоргидрином других функциональных групп (-ОН, -СООН) значительно ниже и вызывает необходимость использования катализатора. При хлоргидроксипропилировании структур, содержащих карбоксильные группы достаточно эффективно использование кислых катализаторов (например, ацетилхлорид). В соответствии с этим проведена разработка способа синтеза преимущественно N-ХГП аналогов хитозана путем его взаимодействия с эпихлор-гидрином с главной целью — получение N-алкилированных производных хитозана с линейной геометрической формой макромолекул. Последнее условие осложнялось тем, что для большинства известных методов алкилирования эпихлоргидрином при условии определенных пространственных затруднений (N-алкилирование) и наличии вторично-третичных аминогрупп необходим трех-четырехкратный избыток алкилирующего агента (моль) при оптимальной температуре процесса 75-80 С. Эти условия могут быть причиной развития реакции пространственного структурирования и образования сшитых полимеров. В результате проведенных исследований установлено, что относительно высокая степень N-алкилирования хитозана с исключением пространственного гелеобразования обеспечена путем использования реакционных систем с относительно низкой концентрацией обрабатываемого полимера. Вероятность структурирования возрастает при увеличении ММ алкилируемых гомологов. В условиях использования полимера (20-22 кДа) оптимальная концентрация полимера в реакционной системе 3-3.5%. При использовании олигохитозанов (1.5-3 кДа) возможно увеличение этого показателя до 12-15%. Вероятность структурирования образующегося полимераналога растет на стадии удаления летучих компонентов, сушки (температура не выше 50-55 С при остаточном давлении 0.8-0.9 атм). Во всех случаях использовались солевые формы амино-D-глюкана (ацетаты и гидрохлориды), растворимые в воде или растворы хитозана в 2% водной уксусной кислоте. Введение алкилирующего реагента эпи-хлоргидрина осуществлялась путем его предварительного растворения в этаноле при температуре 20-30 С. Найдено, что для предотвращения потерь низ-кокипящего алкилирующего реагента реакцию следует проводить в две стадии: при 50-55 С 50-60 минут и при 75-80 С 180-240 минут. Выделение и очистка синтезированных полимераналогов осуществлялись при вакуумиро-вании в мягких температурных условиях. В отдельных случаях при использовании хитозанов с ММ 200-250 кДа и применение в последнем случае катализатора ацетилхлорида (0.03%) имело место пространственное структурирование полимерной фазы на стадии синтеза при термостатировании раствора (20С) в течение 20 часов. Образовавшиеся при этом продукты после отделения жидкой фазы - твердые материалы, способные образовывать, в водосодер-жащих системах при рН 5-6 гелей с различной плотностью. В случае алкили-рования эпихлоргидрином полимергомолога хитозана с ММ 20-22 кДа отмечено пространственное структурирование в процессе вакуумирования.реакционной системы.
В целях моделирования процесса введения ХГП-группировки в структуру элементарных звеньев хитозана с образованием C-N-связей на низкомолекулярном уровне проведено исследование соответствующего превращения 2-амино-2-дезокси-Б-глюкозы (гидрохлорида). Проведенные ранее исследования этого производного аминомонозы свидетельствуют об относительно низкой реакционной способности полуацетального гидроксила. Показано, что переход от гидрохлорида к основной форме приводит к химической дестабилизации 2-амино-2-дезокси-Б-глюкозы. При этом происходит спонтанно идущие процессы осмолення. Это связано, по-видимому, с ближайжим расположением полуацетальной гидроксила и первичной аминогруппы.
Попытка проведения конденсации 2-амино-2-дезокси-Б-глюкозы основной формы с изониазидом практически не дали положительных результатов. Образование соответствующих гидразонов возможно при условии блокирования первичной аминогруппы с образованием соответствующего ацетамидной группы. Гидразон 1-изоникотинил-(2-ацетамидо-2-дезокси)-Б-глкжоза был успешно синтезирован ранее и выделен в кристаллической форме. Исследование реакционной способности восстанавливающейся группировки синтезированных олигохитозанов показало, что в случае образца со степенью полимеризации даже менее 10 реакционная способность полуацетального гидроксила достаточно высокая, что зафиксировано при взаимодействии с гидразинсо-держаими структурами. Этот показатель малозависим от состояния первичной аминогруппировки в составе звеньев полимера. Химическая активность полу-ацетального гидроксила практически идентична для солевых и основных форм олигомеров. В то же время деструктирующее влияние гидратированных аминогрупп на восстанвливающуюся группу олигомера значительно ослаблено в сравнении с вышеуказанным мономером. Хлоргидроксипропилирование 2-амино-2-дезокси-Б-глюкозы гидрохлорида было осуществлено взаимодействием с трехкратным (моль) избытком эпихлоргидрина в вводно-спиртовой среде 10:4 при оптимальной для этого вида синтеза температуре 70 С и длительности синтеза 180 минут с выходом 68%.
С целью исследования реакционной способности ХГП группировки, введенной в структуру мономера хитозана провели контрольный синтез присоединения салицилата на примере взаимодействия с фармакопейной салициловой кислотой при использовании в качестве катализатора ацетилхлорида. Реакционный процесс велся в среде этанола при 70С в течение 120-180 минут с выходом 77%.
При разработке иммобилизации низкомолекулярных соединений (например, биологически активных) на полимерную матрицу для оптимальной модификации реакционной способности используется метод введения активных фрагментов в структуру низкомолекулярного компонента при наличии соответствующих элементов в данной структуре. При разработке способов присоединения салициловой кислоты и ее аналога в структуру аминогликана осуществлено предварительное изменение дизайна макромолекулярной матрицы (хлоргидроксипропилирование) или синтезированы соответствующие производные на основе салицилатов. Для этого разработан способ введения салициловой кислоты и ацетилсалицилата ХГП-группировки путем образования соответствующей сложноэфирной связи.
Металлокомплексы хитозана с платиной
Ранее были проведены опыты по изучению особенностей образования комплексов хитозана с использованием в качестве источника металлоионов -тетрахлорида палладия. Синтез комплексов проводился двумя методами -способами соосаждения и адсорбции. При этом в качестве полимерной матрицы использовался гидрохлорид хитозана. В одном из упомянутых методов (соосаждение) предусматривалась обработка продуктов щелочью, что приводило к удалению хлор-ионов из системы.
В проведенных нами исследованиях для приготовления металлоком-плексов использовалось производное платиновой группы металлов куда входит и палладий - тетрахлорид платины. В качестве полимерных матриц применялись олигомерные формы хитозана, полученные селективным пероксид-ным способом деполимеризации высокомолекулярного глюкана, характеризуемые степенью полимеризации 5-6 ангидроглюкозных единиц (ММ 894 Да). Олигохитозан конверсировавшийся в процессе комплексообразования с металлоионами имел форму основания (концентрация первичных аминогрупп более 90%). PtCU использовался в виде 0,54% раствора (0,00084моль), в который вводили при перемешивании олигомер хитозана в количестве 2 г (0,012 моль), соотношение реагентов олигомера и хлорида платины (IV) 1 : 0,07; массовое соотношение 7:1. Полученную смесь в статическом состоянии выдерживали при температуре окружающей среды в течение суток. Образовавшаяся однофазная система представляла собой прозрачную жидкость, окрашенную в оранжевый цвет (рН = 6,5 - 7). После контрольной фильтрации полученную реакционную массу вакуумировали в отношении летучих компонентов; остаток - твердый аморфный продукт в виде порошка черного цвета.
Учитывая использование в качестве полимерной матрицы, для комплексообразования с ионами платины, олигохитозана в основной форме предполагается возможность образования соответствующих металлокомплексов в двух структурных вариантах, подобные которым обсуждались в отношении соответствующих аналогов полученных на основе ионов палладия (при использовании в качестве источника металлоионов - РсЮЦ) [178].
Учитывая данные ИК-спектрального анализа, указывающие на образование солевой структуры на основе первичных групп олигомера предполагается по аналогии методики получения соответствующего палладиевого комплекса соосаждением с обработкой продуктов реакции щелочью. Лигандное окружение Pt должно состоять только из лигандов полимерной матрицы. Наиболее устойчивые, вероятно, структура, где эти лиганды хелатные или би-дентатные, в качестве лиганда могут выступать соседние кольца хитозана. Связь центральных атомов таких лигандов осуществляется через атом азота аминогруппы или атомы кислорода гидроксильных групп. Наибольшая вероятность образование промежуточного варианта, где одним хитозановым кольцом предоставляется атом азота, а другим - атом кислорода (рис.4 б). Это также зависит от пространственной структуры аминоглюкана, где каждый цикл развернут относительно соседнего, таким образом, что две соседствующие аминогруппы не могут находиться в одной плоскости. Эти выводы достаточно согласуются с расчетами, которые ранее сделаны методом функциона-лоплоскости для простейших двухвалентных комплексов с хитозаном. Установлено, что структурами, обладающими обладающие минимумом энергии, являются хелатные образования представленные на рис.5 [179]. В данном варианте наиболее реальными являются хелатные комплексы, где по атому металла координированы амино- и гидроксильные группы соседних циклов хитозана. Вероятно также хелатирование металла аминогруппами циклов хитозана относящихся к разным олигомерным цепям.
Для варианта приготовления комплекса металлоионов платиновой группы с хитозаном способом адсорбции присутствие хлора в составе комплекса, подтверждаемое элементным анализом, предполагает образование структуры типа [Pd(RNH2)2Cl2] с координацией, где галогенидные лиганды, а также ли-ганды предоставляемые хитозаном являются монодентатными (рис.4 а). Достаточно вероятным является образование комплекса путем лигандного обмена с возникновением структуры подобной [Pd(RNH2)2Cl2].
Один из методов количественного определения содержания металла в комплексах металлоионов с хитозаном, включает полное предварительное расщепление органической части в полимерной системе, полное удаление летучих продуктов и последующую оценку неорганического остатка (солевая форма) объемным комплексометрическим способом. Положительные результаты при использовании данного метода получены при анализе металлоион-комплексов хитозана (РеС13-хитозана) [180 ]. В качестве аниона при образовании конечной солевой формы используется хлор-ион, титрантом является раствор трилона Б, нами была сделана попытка применения данного метода для аналитической оценки синтезированного металлокомплекса олигохитозана и тетрахлорида платины. «Мокрое» сжигание комплекса проводилось путем обработки его точной навески смесью хлорной (64%) и азотной (67%) кислот при 300С. Ожидаемая гомогенизация и уменьшение интенсивности окраски после 180 минут не наблюдалось. Имело место образование двух фазной системы слабоокрашенной жидкости и твердого мелкодисперсного осадка окрашенного в коричневый цвет. Предполагалась возможность образования одной из разновидностей гидрохлорида платины. Оценка физико-химических свойств продукта реакции показала его практически полную нерастворимость в воде и этиловом спирте, что исключало отнесение образовавшегося соединения к PtCU. Присутствие в составе окислительной смеси HCIO4 практически исключало образование на основе платины соединений оксидного типа, о чем свидетельствовала так же визуальная оценка осадка. Жесткие температурные условия процесса также исключали образование каких-либо комплексов на основе металлоиона, включающие компоненты органического типа. Вполне реальным является предположение о принадлежности структуры твердого продукта, реакции мокрого сжигания соответствующего комплекса хитозана, к дихлориду платины. Известно, что это галогенид достаточно термостоек в использовавшихся условиях обработки, нерастворим в воде и органических растворителях. Вследствие этого признано корректным проведение расчета содержания платины (IV) в составе комплекса с хитозаном путем перерасчета от количества, образовавшегося в процессе «мокрого» сжигания PtCb. При этом не исключается возможность присутствия в составе твердого осадка следов хлорида платины с более высокой валентностью иона металла. В результате соответствующего расчета было найдено содержание платины в составе комплекса с хитозаном 6,7%;м вычислено в расчете на исходное соотношение хитозан: PtCU:
а. при реализации структуры (а) содержание платины в составе ком плекса - должно быть составлять 8,0 %. Это соответствует включению одного структурного элемента Pt(Cl(H20))2 на 14 звеньев хитозана;
б. при реализации структуры (б) содержание платины в составе ком плекса - должно быть составлять 8,2 %. Это соответствует включению одного структурного элемента Pt на 14 звеньев хитозана.
Известно успешное использование лекарственных средств содержащих платину в виде разнообразных комплексов для химиотерапевтических методов лечения злокачественных опухолей. Наиболее известными препаратами в этом отношении являются цисплатин и оксалиплатин. Эти препараты чаще всего вводятся в организм парентеральным способом (внутривенно). При соответствующих экспериментальных исследованиях на животных объектах (мыши, крысы) для тех же целей используются методы введения - внутри-брюшинный и пероральный. Наиболее изученным и достаточно часто используемым при лечении онкологических заболеваний является препарат - цисплатин, его значительный недостаток заключается в высокой токсичности, что ограничивает величину доз вводимых в организм. Официально разрешенный диапазон дозировки цисплатина при введение парентеральным способом до-пускает диапазон 50-120 мг/м или с приблизительной точностью 1,5-4 мг/кг живого веса.
