Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 12
1.1 Формирование сильно сшитых полимерных сеток с постоянными поровыми характеристиками 12
1.2 Фазовое разделение в синтезе сшитых систем 13
1.2.1 Модели фазового разделения (макро- и микросинерезис) 14
1.3 Влияние процесса сшивки на формирование поровой структуры 17
1.3.1 Механизм формирования пор в полимерных частицах 18
1.3.2 Влияние времени реакции на формирование поровой структуры полимерных частиц 19
1.4 Полимерные монолиты 21
1.4.1 Особенности полимеризации в массе 22
1.5 Влияние параметров синтеза на поровую структуру полимерных монолитов 24
1.5.1 Влияние времени полимеризации 25
1.5.2 Температура 25
1.5.3 Влияние порообразующих агентов 26
1.5.4 Мономеры 28
1.5.4.1 Влияние сшивающего агента 28
1.5.4.2 Функциональные мономеры 31
1.6 Введение в структуру твердых фаз реакционноспособных групп 32
1.7 Методы синтеза монолитов 35
1.7.1 Полимеризация 35
1.7.1.1 Свободно-радикальная полимеризация 35
1.7.1.2 Полимеризация с раскрытием цикла 39
1.7.2 Поликонденсация 40
1.7.3 Получение монолитов из ранее синтезированных полимеров 41
1.8 Основные области применения полимерных монолитных материалов 42
1.9 Технология микрочипов: основные принципы 43
1.9.1 Материалы, используемые для создания платформ микрочипа 47
1.9.1.1 Двумерные носители 47
1.9.1.2 Трехмерные носители 50
ГЛАВА 2 Экспериментальная часть 54
2.1 Материалы 54
2.2 Оборудование 56
2.3 Методы 57
2.3.1 Получение пластин на основе стеклянной поддерживающей среды и метакрилатного монолита 57
2.3.2 Синтез ГМА-ЭДМА сополимера 58
2.3.3 Синтез сополимеров ГЭМА-ГДМА, ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ГДМА 59
2.3.4 Модификация монолитного ГМА-ЭДМА сополимера 60
2.3.4.1 Кислотный гидролиз эпоксидных групп ГМА-ЭДМА сополимера 60
2.3.5 Иммобилизация модельных белков на поверхности модифицированной
полимерной матрицы 61
2.3.5.1 Характеристики и подготовка стационарных фаз 61
2.3.5.2 Иммобилизация белка 61
2.3.7 Применение макропористых гидрофильных полимерных материалов в чип-анализе 62
2.3.7.1 Сравнительное исследование разработанных материалов с использованием модельной биокомплементарной пары белков 62
2.3.8. Анализ белков и ДНК на повехности стеклянных пластин 64
2.3.8.1 Анализ белков на стеклянных чипах 64
2.3.8.2 Анализ ДНК на стеклянных чипах 64
2.3.9 Создание чипов для анализа ДНК на основе монолитных полимерных матриц 65
2.3.9.1 Оптимизация процесса иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности монолитных слоев 65
2.3.9.2 Оптимизация условий анализа на чипе 66
2.3.9.3 Создание чипов для диагностики муковисцидоза 67
2.3.9.4 Аптамер-содержащие микротест-системы 67
ГЛАВА 3 Результаты и их обсуждение 70
3.1 Синтез и исследование характеристик гидрофильных сополимеров ГЭМА-ГДМА, ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ГДМА 70
3.1.1 Выбор инициатора 70
3.1.2 Время полимеризации 72
3.1.3 Влияние порообразующих веществ на морфологию ГЭМА-ГДМА монолита 73
3.1.4 Синтез ГМА-ГДМА монолитов 81
3.1.5 Макропористые монолиты на основе ЦЭМА-ГДМА сополимера 87
3.2 Модификация ГМА-ЭДМА сополимера 91
3.2.2 Введение в структуру ГМА-ЭДМА монолитов альдегидных, сукцинимидкарбонатных и имидазолкарбаматных групп 94
3.2.3 Иммобилизация модельного белка на поверхности модифицированных носителей 96
3.2.3.1 Зависимость емкости иммобилизации от концентрации белка в растворе 96
3.2.3.2 Влияние рН раствора 97
3.2.3.3 Зависимость емкости иммобилизации от времени реакции 98
3.2.3.4 Зависимость емкости иммобилизации от температуры 99
3.3 Апробация разработанных материалов в режиме биологического анализа в формате
микрочипов 100
3.3.1 Анализ белков на поверхностях гидрофильных платформ биочипа 100
3.3.2 Применение макропористых монолитов для создания ДНК-чипов 108
3.3.2.1 Оптимизация условий анализа ДНК на модельных ГМА-ЭДМА слоях 108
3.3.2.2 Сравнение результатов анализа ДНК на макропористых и стеклянных чипах 113
3.3.2.3 Создание тест-системы на основе монолитов для выявления мутаций гена CFTR 115
3.3.2.4 Аптамер-содержащие микроаналитические линейки для детектирования белков 117
Выводы 120
Список литературы 121
Приложение I: Cтруктурные формулы используемых в работе мономеров 139
Приложение II: Формулы для оценки эффективности разработанных тест-систем 140
Благодарности 141
- Влияние параметров синтеза на поровую структуру полимерных монолитов
- Получение пластин на основе стеклянной поддерживающей среды и метакрилатного монолита
- Оптимизация процесса иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности монолитных слоев
- Введение в структуру ГМА-ЭДМА монолитов альдегидных, сукцинимидкарбонатных и имидазолкарбаматных групп
Введение к работе
Актуальность работы. Методология получения макропористых полимерных
материалов, заключающаяся в одностадийном синтезе сильно сшитых сополимеров в
виде монолитных блоков в форме выбранного размера и дизайна (монолитные
сорбенты), была разработана и предложена в начале 90-х годов прошлого века. В
настоящий момент подобные системы широко используются в качестве твердых сред
(неподвижной фазы) при проведении ряда процессов, основанных на массообмене в
условиях сквозного потока жидкости или газа (подвижной фазы). В качестве примеров
можно привести жидкостную и газовую хроматографию, высокопроточные ферментные
реакторы и т.д. Повышенный интерес к монолитным носителям обусловлен их
эффективностью и производительностью, связанной с высокой скоростью
межфазового переноса вещества, основанного на механизме конвекции, и, в связи с этим, возможностью скоростного разделения биологических объектов различного строения и размера (белки, ДНК, РНК, вирусы), а также их механической и химической устойчивостью. Вышеперечисленные характеристики позволили данным материалам занять привилегированное место в ряду традиционно используемых сорбентов, получаемых в виде частиц, однако для решения более широкого круга задач необходимость продолжения исследований в области синтеза и практического применения полимерных монолитов не теряет своей актуальности. При этом одним из наиболее важных вопросов является получение материалов с прогнозируемой поровой структурой, и решение проблемы управления процессом порообразования.
Сравнительно недавно макропористые метакрилатные материалы монолитного типа были впервые предложены для использования в качестве основы при создании микрочипов, предназначенных для высокочувствительного анализа белков (protein microarrays). При сравнении с широко используемыми в данном методе биологического анализа стеклянными носителями (двумерные, или 2D-чипы) было установлено, что используемые в качестве операционного слоя макропористые монолитные матрицы (трехмерные, 3D-чипы), имеют ряд преимуществ, позволяющих существенно повысить чувствительность анализа. Несмотря на высокую практическую значимость данной характеристики, существует ряд свойств обсуждаемых материалов, которые могут быть улучшены, например, введением в структуру полимерной матрицы групп, повышающих ее гидрофильность. Дополнительная гидрофилизация поверхности операционного слоя микрочипа apriori приведет к улучшению условий для принятия белком необходимой для последующего биоаффинного связывания конформации, уменьшению влияния неспецифических гидрофобных взаимодействий, а также, поскольку при работе с микрочипом используются водные растворы, к улучшению смачиваемости слоя. Также известно, что некоторые белки особенно чувствительны к микроокружению. Для этой категории анализируемых объектов создание условий, максимально приближенных к физиологическим, необходимо для предотвращения денатурации белка или инактивации активного центра в процессе иммобилизации на поверхности твердой фазы.
Таким образом, поиск новых макропористых полимерных материалов,
позволяющих осуществлять биофункционализацию матрицы в мягких условиях и в короткие промежутки времени, является, несомненно, актуальной задачей.
Цель настоящей работы состояла в разработке методов синтеза новых
макропористых полимерных материалов (монолитов) на основе сополимеров 2,3-
эпоксипропилметакрилата (глицидилметакрилата), 2-цианоэтилметакрилата и 2-
гидроксиэтилметакрила с гидрофильным сшивающим агентом глицерин-1,3-
диметакрилатом (ГМА-ГДМА, ЦЭМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА, соответственно) с
контролируемой поровой структурой и заданной химической функциональностью
поверхности, а также в выявлении факторов, определяющих перспективность
использования монолитов для построения микроаналитических тест-систем (микрочипов).
Достижение поставленной цели определило следующие задачи:
синтез новых гидрофильных метакрилатных сильно сшитых сополимеров и оптимизация условий сополимеризации, а именно, выбор эффективного инициатора, подбор его концентрации, времени реакции и системы порообразующих веществ;
изучение влияния природы низкомолекулярных и полимерных порообразующих веществ на морфологию и другие характеристики монолитных сорбентов;
разработка способов химической модификации сополимера на основе глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА); подтверждение введения в структуру матрицы альдегидных, сукцинимидилкарбонатных и имидазолкарбаматных групп;
исследование факторов, оказывающих влияние на эффективность введения в структуру макропористого сополимера биоаффинных лигандов;
изучение закономерностей анализа белков на поверхности гидрофильных макропористых монолитов.
Объектами представленного исследования являлись синтетические макропористые гидрофильные материалы на основе метакрилатных сополимеров, содержащие на поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппами молекул белков и ДНК-фрагментов.
В качестве методов исследования использовались: свободно-радикальная фотоинициируемая полимеризация в массе (синтез сильно сшитых гидрофильных метакрилатных сополимеров); методы твердофазного ядерного магнитного резонанса (SSNMR), ИК-спектроскопии и элементного анализа (подтверждение химического строения полученных продуктов); интрузионная ртутная порометрия (определение среднего размера пор и распределения их по размерам); растровая (сканирующая) электронная микроскопия (качественная оценка поровой структуры полученных материалов); флуоресцентный анализ (оценка эффективности высокоспецифичных биологических взаимодействий на поверхности разработанных полимерных слоев).
Научная новизна работы состоит в следующем:
разработаны методы синтеза новых макропористых гидрофильных полимерных материалов (монолитов) на основе сополимеров глицидилметакрилата, 2-цианоэтилметакрилата или 2-гидроксиэтилметакрила с глицерин-1,3-диметакрилатом (ГМА-ГДМА, ЦЭМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА) с контролируемой поровой структурой;
впервые исследована роль полистиролов с различной молекулярной массой как макромолекулярных порообразующих веществ в формировании морфологии монолитных продуктов (структур) и показано соответствие экспериментальных данных теории взаиморастворимости Гильдебранда;
разработан и оптимизирован алгоритм высокочувствительного анализа ДНК на поверхности макропористых монолитных платформ микрочипа;
показана возможность создания высокочувствительной аптамер-содержащей тест-системы на основе разработанного микрочипа.
Практическая значимость работы определяется тем, что:
на основе данных по исследованию влияния низкомолекулярных и полимерных
порогенов на поровые характеристики синтезированных монолитных сорбентов
предложены научно-практические рекомендации, позволяющие направленно
контролировать морфологию монолита и получать материалы с поровой
структурой, необходимой для решения конкретных аналитических задач;
макропористые монолитные слои, закрепленные на поверхности стеклянной подложки, могут быть использованы в качестве основы как для высокочувствительного анализа белков, так и для анализа ДНК;
по результатам разработанного анализа на определение тяжелого генетического заболевания муковисцидоза установлено, что гидрофильные макропористые материалы являются перспективными для анализа генных мутаций.
Положения, выносимые на защиту:
повышение гидрофильности одного мономера или сомономеров приводит к изменению термодинамической совместимости компонентов реакционной системы, и, как следствие, оказывает существенное влияние на поровую структуру;
введение в полимеризационную смесь макропорогена полистирола не приводит к изменению классической микроглобулярной структуры синтезированных образцов;
гидрофилизация поверхности макропористых монолитных матриц позволяет существенно повысить чувствительность биологического анализа на чипе, а также расширить сферы его применения;
макропористые монолитные слои на основе синтезированных полимеров являются перспективными для высокочувствительного анализа ДНК. Обоснованность и достоверность данных и выводов настоящей работы
подтверждается хорошей воспроизводимостью всех полученных результатов, их согласованностью при использовании независимых методов исследования полученных полимеров.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих международных симпозиумах и конференциях: Cанкт-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2007, 2008, 2010); International Congress on Analytical Sciences (Москва, Россия, 2006); Baltic Polymer Symposia 2007 (Друскининкай, Литва) и 2008 (Отепя, Эстония); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); International Symposium «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2008); Monolith Summer Schools (Порторож, Словения, 2008 и 2010); 30th International Symposium on the Separation of Proteins, Peptides and Polynucleotides (Болонья, Италия, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых международных и отечественных изданиях, а также 14 тезисов докладов, представленных на вышеуказанных конференциях.
Личный вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, а также в подготовке докладов и публикаций.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов, списка использованной литературы (189 наименований) и приложений. Работа изложена на 141 странице, включает 11 таблиц и 47 рисунков.
Влияние параметров синтеза на поровую структуру полимерных монолитов
Анализ результатов многочисленных исследований, проведенных при разработке и оптимизации методов синтеза макропористых полимерных монолитов, позволил выявить зависимость общей пористости продукта и распределения пор по размерам от факторов процесса. Таким образом, было установлено, что на морфологию конечного материала существенное влияние оказывают природа и количество порообразующих веществ, концентрация и вид сшивающего агента и функционального мономера, способ инициирования, температура и время полимеризации. Как правило, сложно выделить влияние того или иного параметра на поровые характеристики сорбента, поэтому необходимо рассматривать зависимость от одного условия в комбинации с другими составляющими системы.
Важным фактором, определяющим поровую структуру синтезированного продукта, является время реакции. Влияние времени полимеризации на степень конверсии мономеров и поровые свойства монолитов было исследовано в работе Svec и Frechet [32]. На примере ГМА-ЭДМА монолита в условиях вариации времени синтеза изучали изменения поровых характеристик конечного сополимера. В частности, было установлено, что проведение реакции в течение 1 ч при температуре 55 С позволяет получить продукт с очень большой удельной площадью поверхности, равной 500 м2/г. При этом степень конверсии мономера составляла всего 18%. Сравнение распределения пор по размерам в образцах, синтезированных в течение 1 и 14 ч, представлено на Рисунке 8.
Более детальное исследование было осуществлено группой Bonn [36, 37]. Для
монолитных колонок на основе сополимера п-метилстирола и 1,2-бис(п винилфенил)этана установлено влияние времени полимеризации (время синтеза варьировали от 45 мин до 24 ч) на степень конверсии мономера, общую пористость и удельную площадь поверхности. Показано, что конверсия исследованного мономера через 45 мин реакции составляет 39%, а после 12 и 24 ч - 98 и 99%, соответственно. При этом наблюдалось изменение поровых свойств, а именно, удельная площадь поверхности монолитов уменьшилась от 75 до 23 м2/г [36].
Большое количество опубликованных работ посвящено исследованию влияния температуры на поровые характеристики обсуждаемых материалов [32, 38, 39].
Установлено, что температура оказывает существенное влияние на кинетику процесса. При повышении температуры скорость распада инициатора возрастает, что способствует росту количества свободных радикалов, приводящему как к увеличению числа полимерных зародышей (ядер), так и уменьшению их размера. При низкой температуре количество ядер в полимеризационной смеси уменьшается, однако их размер оказывается бльшим, чем в предыдущем случае, за счет проникновения в них бльшего количества мономеров [38]. Было установлено, что проведение синтеза в изотермических условиях способствует получению образцов с более узким распределением пор по размерам.
В момент времени, когда концентрация образующегося полимера достигает критического значения, начинается процесс формирования поровой структуры продукта. В процессе полимеризации сольватирующая способность среды (непрореагировавшие мономеры + порогены) изменяется вследствие конверсии мономера и, соответственно, уменьшения его концентрации в жидкой фазе. Очевидно, что важным свойством порообразующего вещества является его сольватирующая способность. Существует несколько теорий, позволяющие оценить данный параметр [40, 41]. Широко используемыми являются теории Hildebrand и Hansen [41]. Согласно теории Hansen, можно произвести количественную оценку взаимодействия между полимером и растворителем. При этом необходимо учитывать вклады атомных 3D, полярных Р и водородных ён взаимодействий. Для оценки сольватьирующей способности растворителя существенной является величина квадрата разности между e1 и ё2, где параметр, относящийся к полимеру, имеет индекс 1, а к растворителю - 2. Таким образом, растворители могут быть классифицированы как хорошие (термодинамически совместимые, т.е. активно взаимодействующие с полимером), для которых (e1- ё2)2 0, и плохие, когда (д1- ё2)2 0. Специально для систем полимер-растворитель Hansen учел влияние параметра Флори-Хаггинса / и показал, что движущей силой образования раствора, компонентами которого являются полимер и растворитель, является энтропийный фактор. Для сшитых полимеров в качестве дополнительного критерия оценки взаимодействия может использоваться скорость седиментации частиц полимера в выбранном растворителе [42].
Для получения макропористых полимерных монолитов в качестве порогенов используются низкомолекулярные соединения (алифатические спирты, толуол и др.) [32, 43], линейные олигомеры и полимеры (полиэтиленгликоли, полистиролы) [44, 45], суперкритические жидкости (сжатый углекислый газ и 1,1,1,2-тетрафторэтан) [46, 47, 48]. Также известны единичные примеры использования гранул (сульфата натрия) и монодисперсных полистирольных частиц в качестве порообразующих агентов [49, 50]. Все перечисленные вещества, согласно классификации, приведенной выше, можно разделить на группы: (1) растворители, способные к сольватированию образующегося полимера; (2) несольватируюшие полимер растворители; (3) несовместимые с полимером полимерные агенты и частицы.
В классической системе стирол-дивинилбензол, как правило, в качестве порогенов используют толуол и циклогексанол. Параметр растворимости для циклогексанола составляет 23.3 (МПа)1/2, а для толуола – 18.2 (МПа)1/2, что является достаточно близким значению растворимости сополимера стирола с дивинилбензолом, равному 18.6 (МПа)1/2. Поэтому толуол с его большой степенью физического сродства к образующимся полимерным цепям является хорошим растворителем для данной системы, способным сольватировать и удерживать определенное время полимер в жидкой фазе. Было показано, что увеличение доли толуола в порогенной смеси приводит к значительному увеличению площади поверхности сорбента и, соответственно, уменьшению среднего размера пор. Напротив, циклогексанол не является сольватирующим образующийся полимер растворителем. В итоге, полимер стремится к переходу в отдельную фазу даже при невысокой степени конверсии мономера. Следствием данного процесса является сдвиг в сторону увеличения доли крупных пор. Таким образом, изменение природы порогена приводит к изменению механизма порообразования от - к -индуцированному синерезису.
Несмотря на то, что сольватирующий эффект порогенов достаточно широко исследовался на примере макропористых диспергированных сорбентов (частиц), основные выводы применимы и для монолитных продуктов. В частности, было установлено, что общая пористость интенсивно возрастает при уменьшении взаимодействия между полимером и порогенами во время образования гелевой фракции. Влияние степени сольватации макропористого сополимера на образующуюся поровую структуру в зависимости от вида порогена изучали методом флуоресцентной спектроскопии [51, 52]. В данных экспериментах изучали поведение полимерных цепей, меченых флуоресцентными группами, которые закреплялись в структурах гелей, синтезируемых либо при использовании хорошего растворителя, либо в присутствии порогена с низкой сольватирующей способностью. Результаты показали, что образцы, полученные в присутствии порообразующих веществ с более высокой сольватирующей активностью, имеют большую площадь поверхности гелевой фазы. Также было установлено, что изменения состава смеси порогенов в сторону увеличения концентрации вещества с более высокой сольватирующей способностью приводят к уменьшению размеров пор.
В случае использования полимерных порогенов наблюдалась тенденция уменьшения удельной площади поверхности образцов по сравнению с характеристиками материалов, полученных с использованием смеси низко- и высокомолекулярных порогенов, а именно, линейные полимеры - сольватирующие растворители или полимеры - несольватируюшие порогены. Таким образом, роль высокомолекулярных агентов в качестве порообразователей можно охарактеризовать их способностью к формированию макропор. Также было показано, что молекулярная масса и молекулярно-массовое распределение полимерных порогенов влияют на поровую структуру конечного материала. При уменьшении молекулярной массы происходит сдвиг в сторону пор с меньшим радиусом с одновременным увеличением удельной площади поверхности. При использовании в качестве порогена полиэтиленгликоля было показано, что вариация его молекулярной массы от (1.5х103 до 20х103) позволяет получать образцы со средним размером пор от 0.02 до 1.05 мкм и, соответственно, удельной площадью поверхности от 48 до 3.7 м2/г [44].
Получение пластин на основе стеклянной поддерживающей среды и метакрилатного монолита
Для получения непроточных аналитических систем на основе стеклянной подложки и полимерной макропористой матрицы на поверхности стекла формировали операционные ячейки в соответствии методикой [163]: осуществляли обработку парафином поверхности стекла, не подлежащей травлению; проводили травление в растворе 11М плавликовой кислоты в течение 30 мин (глубина сформированных ячеек составляла 0.15 мм); погружали стеклянные пластины в 0.1 M NaOH, кипятили в течение 40 минут, затем промывали дистиллированной водой и высушиванием при 100оС; модифицировали поверхность ячейки 15% раствором 3 (триметоксисилил)пропилметокрилата в сухом толуоле в течение 12 ч в темноте при комнатной температуре; последовательно промывали: ацетоном и этиловым спиртом; перед полимеризацией стекла высушивали в термостате при 35 оС в течение 1.5 ч.
Синтез ГМА-ЭДМА сополимера осуществляли методом свободно-радикальной фотоинициируемой полимеризации в соответствии с ранее разработанной методикой [167]. Во всех экспериментах использовали смесь следующих реагентов: мономеры глицидилдиметакрилат (ГМА) и этиленгликольдиметакрилат (ЭДМА) в соотношении 60:40 об%; порогенный растворитель циклогексанол (соотношение порогенов и мономеров составляло 60:40 об%); инициатор 2-гидрокси-2-метилпропиофенон (Дарокур 1173) в концентрации 1% от массы со-мономеров. Время облучения составляло 20 минут. Выход сшитого полимера - 93%.
Полимеризация
В сосуд, содержащий предварительно взвешенный инициатор, вносили порогенный растворитель, а затем добавляли смесь мономеров и перемешивали. С целью удаления молекулярного кислорода, ингибирующего процесс, через реакционную смесь пропускали азот в течение 5 минут. Далее смесь помещали в пластиковый контейнер (высота 0.4 cм, диаметр 2.0 см) или модифицированную силаном ячейку на поверхности предметного стекла. Синтез сополимера осуществляли в токе азота. Реакционную форму накрывали кварцевым колпаком и с помощью вентилятора проводили охлаждение системы до комнатной температуры. После завершения синтеза, полученные матрицы промывали последовательно несколькими порциями этилового спирта и ацетона для удаления избытка непрореагировавших мономеров и порообразующих агентов, а затем высушивали при 70 оС до постоянной массы.
В случае получения полимерных слоев, связанных с поверхностью предметного стекла, процедуру промывания этиловым спиртом осуществляли с использованием шейкера при нагревании до 60 оС; порции этанола меняли через 30 мин. Полученные слои хранили в холодильнике при 4 оС в 50%-ном водном растворе этилового спирта. 2.3.3 Синтез сополимеров ГЭМА-ГДМА, ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ГДМА
Так же, как и в случае ГМА-ЭДМА сополимера, все перечисленные материалы получали методом свободно-радикальной фотоинициируемой полимеризации в условиях, аналогичных описанным в пункте 2.3.2. Для осуществления указанных экспериментов использовали следующие соотношения реагентов:
концентрация инициатора - 1% от массы мономеров;
соотношение порообразующие растворители: мономеры - 60:40 (%, об/об);
соотношение реакционноспособный мономер: сшивающий агент - 60:40 (%, об/об).
С целью установления оптимальных условий синтеза исследовали влияние нескольких параметров, а именно, времени реакции (вариация от 5 до 40 мин), концентрации (от 0.2 до 1.4 масс%) и природы инициатора (бензофенона, 2-гидрокси-2-метилпропиофенона и 2-метокси-2-фенилацетофенона), а также систем порообразующих веществ. В качестве порообразующих веществ использовали: додеканол, циклогексанол, толуол, гептан, полиэтиленгликоль с молекулярной массой (ПЭГ Mw =200), растворы полистирола (ПС, Mw =44х103, 382х103 и 2х106) в толуоле, раствор полидиметилсилоксана (ПДМС, Mw =90х103) в гептане.
Использованные в работе исходные соотношения мономеров и порообразующих веществ, концентрации инициатора, а также поровые характеристики синтезированных матриц представлены в ГЛАВЕ 3 - раздел 3.1.3 (Таблица 5), раздел 3.1.4 (Таблица 7), раздел 3.1.5 (Таблица 9).
После завершения процесса полимеризации образцы, полученные с использованием смеси низкомолекулярных порообразующих агентов, промывали последовательно несколькими порциями этилового спирта и ацетона. В случае полимерных порогенов промывание осуществляли по схеме: толуол (для смесей, содержащих растворы ПС) или гептан (в случае ПДМС), 40 мин; хлористый метилен, 60 мин; ацетон, 30 мин; этиловый спирт, 30 мин.
В случае пластин (тонкий слой полимера на стекле) промывание проводили с использованием лабораторного шейкера. Полученные платформы хранили в 50%-ном водном растворе этилового спирта при температуре 4C. Образцы, предназначенные для исследования поровой структуры, состава и выхода сополимера, высушивали в вакууме при температуре 40 C в течение 48 ч. Исследование продуктов синтеза
Состав синтезированных сополимеров подтверждали качественно методами твердотельного ЯМР и ИК-спектроскопии. Для определения среднего размера пор и распределения пор по размерам использовали метод интрузионной ртутной порометрии. Метод растровой электронной микроскопии применяли для оценки качества поверхности и гомогенности поровой структуры полученных монолитных матриц.
Реакцию гидролиза эпоксидных групп сополимера проводили в избытке 0.1 M серной кислоты при 80 оС в течение 6 ч. После завершения реакции слои промывали водой в течение 5 ч с использованием лабораторного шейкера и хранили при 4 оС.
Окисление гидроксильных групп гидролизованного сополимера
С целью окисления гидроксильных групп 150 мг предварительно гидролизованного полимера инкубировали в 5% растворе йодной кислоты в 90% уксусной кислоте (110 мг йодной кислоты, 0.5 ммоль). Реакция протекала при комнатной температуре. Для этого слой погружали в раствор модифицирующего агента и выдерживали в течение 4 ч. После окончания процесса матрицы промывали на шейкере дистиллированной водой в течение 3 ч, 1 час – 2 М. NaCl и, наконец, 3 часа – дистиллированной водой. Окисленные слои хранили в воде при 4 оС.
Полимераналогичные превращения с участием N,N-дисукцинимидилкарбоната
Реакцию гидроксильных групп предварительно гидролизованного ГМА-ЭДМА монолитного материала (150 мг сухого образца) с N,N-дисукцинимидилкарбонатом (44 мг, 0.17 ммоль) осуществляли в ацетонитриле в присутствии катализатора 4-(диметиламино)-пиридина (33 мг, 0.27 ммоль). Реакция протекала в течение 2 ч при комнатной температуре. После завершения процесса образец промывали ацетонитрилом в течение 2 ч, затем в течение часа – дистиллированной водой. Для промывания прикрепленных к стеклу слоев использовали лабораторный шейкер. Слои хранили при 4 оС в воде. Полимераналогичные превращения с участием 1,1-карбонилдиимидазола
Образец монолитного полимерного материала с гидроксильными группами помещали в раствор, содержащий 1,1-карбонилдиимидазол и 4-(диметиламино)-пиридин; в качестве растворителя использовали ацетонитрил. Количество 1,1-карбонилдиимидазола, использованное для модификации 150 мг сополимера, составляло 31 и 310 мг (0.2 и 2.0 ммоль, соответственно), а 4-(диметиламино) – пиридина 33 и 330 мг (соответственно, 0.27 и 2.7 ммоль). Так же, как и в предыдущем случае, реакцию поводили при комнатной температуре путем погружения слоя в раствор модифицирующего агента на 2 часа. Промывание и хранение образцов осуществляли аналогичным описанному выше методом.
Оптимизация процесса иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности монолитных слоев
Для иммобилизации на поверхности стеклянного носителя использовали растворы мышиного IgG с подобными раздел 2.3.7.1 концентрационными интервалами. Время реакции связывания белка составляло 1 час. Затем слои промывали: ФСБ – 5 мин, 2 М NaCl – 5 мин, ФСБ – 5 мин. Для блокирования остаточных реакционных групп использовалась процедура, описанная в п 2.3.7.1. После этого слои дважды промывали бидистиллированной водой и проводили реакцию комплементарного связывания анализируемого белка с иммобилизованными лигандами. Связывание проводили в течение 16 ч при температуре 25 C и перемешивании со скоростью 300 об/мин. Алгоритм процессов промывания, высушивания и сканирования был тот же, что использовался в случае полимерных чипов.
Метод анализа ДНК на двумерных стеклянных слайдах, содержащих на поверхности реакционноспособные альдегидные группы, соответствовал описанному [170]. Растворы олигонуклетидов с концентрацией 50 мкмоль/л в 0.45 М НХЦБ буфере (pH 7.0) наносились точечно на поверхность стеклянных слайдов, при этом каждый раствор наносили в десятикратном повторе в объеме 200 пл. Затем слайды с нанесенными пробами олигонуклеотидных лигандов подвергали в течение 3 мин УФ-облучению при длине волны нм и помещали в термостат при температуре 80C на два часа. После этого пластины выдерживали при комнатной температуре в темноте в течение 14 ч. Для удаления избытка олигонуклеотидов и дезактивации остаточных альдегидных групп, а также восстановления, образовавшихся в результате реакции между амино- и альдегидными группами азометиновых связей слайды промывали по следующей схеме: 0.2% додецилсульфат натрия – 2 мин; бидистиллированная вода – 2х1 мин; раствор 1 г боргидрида натрия в смеси 300 мл ФСБ и 100 мл этилового спирта – 5 мин; бидистиллированная вода – 1 мин.
Для минимизации неспецифической адсорбции анализируемой ДНК проводили блокирование поверхности с использованием раствора 1% БСА в 0.9 M НХЦБ, содержащем 0.1% додецилсульфат натрия; время процесса составляло 45 мин. Затем слайды промывали водой (пятикратно по 1 мин) и высушивали в потоке воздуха. В качестве анализируемой пробы использовали синтезированную биоинженерным способом кДНК (комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота), методики получения и очистки которой описаны [171]. После проведения денатурации кДНК к анализируемому образцу добавляли 1/10 объема раствора детергента Topblock с концентрацией 20 мг/мл, перемешивали и вносили в каждую гибридизационную ячейку, предварительно закрепленную на поверхности микрочипа, 130 мкл раствора. В процессе гибридизации чипы инкубировали в ячейках термошейкера при перемешивании 650 об/мин и температуре 42 C в течение 16 ч. После завершения реакции комплементарного связывания чипы промывали по следующей схеме: 0.3 М НХЦБ, содержащий 0.1% додецилсульфата натрия, pH 7.0 – 5 мин; 0.15 М НХЦБ, pH 7.0 – 5 мин; 0.075 М НХЦБ, pH 7.0 – 5 мин. Затем чипы сушили в потоке воздуха и флуоресцентные зоны детектировали сканированием при длине волны 635 нм. Рассчитывали интенсивность сигнала, относительную интенсивность сигнала и отношение сигнал/шум.
Для установления оптимальных условий иммобилизации олигонуклеотидных лигандов было изучено влияние параметров процесса, а именно, концентрации и рН наносимого в виде зон раствора, времени, температуры, а также влияния УФ-облучения на эффективность последующего анализа. Все эксперименты проводили с использованием B2573RpoE олигонуклеотида, связываемого со стандартной ГМА-ЭДМА матрицей. Для иммобилизации лиганда использовали два буферных раствора: 0.01 М натрий-боратный буфер, pH 9.4, и 0.45 М НХЦБ, pH 7.0. Концентрации растворов олигонуклеотидов варьировали от 10 до 50 мкмоль/л. Раствор с одинаковой концентрацией наносили в десятикратной повторности в одну линию. Объем образца составлял, так же, как и в случае со стеклянными слайдами, 200 пиколитров. Время процесса иммобилизации включало в себя две стадии, а именно, термостатирование при 80 C и инкубирование при комнатной температуре. Макропористые слои с нанесенными растворами B2573RpoE олигонуклеотида облучали при длине волны 254 нм в течение 3 мин. Затем чипы помещали в термостат при температуре 80 C и время стадии термостатирования варьировали от 1 до 3 ч. Инкубирирование при комнатной температуре проводили, изменяя временной интервал от 30 минут до 14 ч. Для сравнения, проводили идентичные эксперименты, но исключающие стадию УФ-облучения. После завершения процесса иммобилизации слои промывали в течение 10 мин раствором 0.2% додецилсульфата натрия, а затем 5 мин – бидистиллированной водой.
Для блокирования поверхности оперативного слоя были апробированы 1% БСА в 0.9 М НХЦБ, содержащем 0.1% додецилсульфат натрия и 50 ммоль этаноламин в 0.1 М Трис буфере, pH 9.0 также с добавкой 0.1% додецилсульфата натрия. В случае БСА блокирование проводили в течение 45 мин при температуре 42oC; реакция с этаноламином протекала за то же время (45 мин), но при комнатной температуре. Затем слои промывали бидистиллированной водой (дважды по 10 мин) и сушили потоком воздуха. Полученные чипы хранили в темноте при комнатной температуре.
Для реакции комплементарного связывания (гибридизации) с олигонуклеотидным лигандом использовали синтезированную по описанному в [171] методу кДНК. Процесс проводили при температуре 42 C, слайды помещали в ячейки термошейкера (650 об/мин), время связывания варьировали от 2 до 14 ч. После завершения гибридизации слои последовательно промывали 0.3 М НХЦБ, содержащим додецилсульфат натрия 0.1%, pH 7.0 (15 мин), 0.15 М НХЦБ, рН 7.0 (10 мин) и 0.075 М НХЦБ, рН 7.0 (10 мин). Затем пластины сушили в потоке воздуха, и флуоресцирующие зоны детектировали путем сканирования.
В качестве специфических зондов на поверхностях монолитных слоев использовали олигонуклеотиды, содержащие по 19 оснований и обозначенные как Yl, Y2, и Y3. Иммобилизацию данных нуклеотидных последовательностей осуществляли по ранее описанному методу (раздел 2.3.9.1). Для проведения диагностического теста были использованы два вида ПЦР-продуктов, а именно, содержащий мутационный фрагмент ген (2р т4580) и подобную последовательность без соответствующей мутации. Для осуществления гибридизации 70 нг ПЦР-продукта растворяли в 130 мкл соответствующего буфера и проводили денатурацию ДНК. Процесс гибридизации и последующее промывание пластин выполняли в соответствии с методом, использованным для модельных систем (раздел 2.3.9.2.).
Введение в структуру ГМА-ЭДМА монолитов альдегидных, сукцинимидкарбонатных и имидазолкарбаматных групп
С целью генерации альдегидных групп в структуре макропористого сополимера 2,3-дигироксипропилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ДГПМА-ЭДМА), полученного в результате гидролиза эпоксидных групп ГМА-ЭДМА продукта, использовали метод окисления гидроксильных групп избытком йодной кислоты. Наличие альдегидных групп в окисленных образцах подтверждали качественно специфической реакцией с фуксинсернистой кислотой (реагент Шиффа) [185]. Равномерное окрашивание полимерного носителя в сиреневый цвет подтверждало наличие альдегидных групп в структуре модифицированного сополимера. Анализ образцов методом ИК-спектроскопии оказался неэффективным из-за наложения полос поглощения альдегидных (1724 см"1) и находящихся в большом избытке сложноэфирных (1730 см"1) групп сополимера.
Полимераналогичное превращение гидроксильных групп ДГПМА-ЭДМА сополимера с использованием дисукцинимидилкарбоната проводили в ацетонитриле с использованием в качестве катализатора 4-(диметиламино)пиридина (ДМАП). Количество модифицирующего агента соответствовало 20%-ой конверсии гидроксильных групп. Данная степень конверсии должна обеспечивать достаточную поверхностную концентрацию лигандов и сохранить необходимое количество интактных гидрофильных ОН-групп. Введение сукцинимидкарбонатных групп подтверждали методом ИК-спектроскопии. Детектирование «плеча» в области 1790 см"1 свидетельствовало о появлении в составе сополимера пятичленного имидного цикла.
Реакцию модификации ДГПМА-ЭДМА карбонилдиимидазолом проводили в условиях, аналогичных предыдущему случаю. Процесс осуществляли в условиях недостатка и избытка модифицирующего агента по отношению к содержанию гидроксиильных групп. Введение в структуру сополимера имидазолкарбаматных групп подтверждали методом ИК-спектроскопии (появление характеристических полос в области 1804 см""1).
Для образца, полученного в условиях недостатка модифицирующего агента (т. е. при избытке гидроксильных групп полимера), в ИК-спектре наблюдалось появление небольшого «плеча» в области 1804 см-1. Во втором случае, при избытке модифицирующего агента, в той же области ИК-спектра наблюдалось появление выраженного сигнала (Рисунок 32). В обоих случаях появление характеристических полос в указанной области связано с введением в структуру сополимера имидазолкарбаматных групп.
Для количественной оценки имидазолкарбаматных групп, введенных в структуру метакрилатного сополимера, использовали метод элементного анализа. Содержание азота в образце, полученном при использовании двукратного избытка реагента, составляло 2.2 % при степени конверсии, равной 30 %.
Для оценки влияния времени реакции модификации на количество ковалентно связываемого бычьего сывороточного альбумина (БСА) изучали соответствующие кинетические зависимости (Рисунок 33). Время реакции модификации варьировали, а последующую иммобилизацию белка проводили в течение 2 ч. Таким образом, результаты оценивали косвенно по количеству, белка ковалентно связывающегося с поверхностями модифицированных метакрилатных сополимеров. Было установлено, что для альдегидсодержащего сополимера максимальная емкость связывания достигалась за 4 ч, тогда как в случае карбонатных и карбаматных производных это время составляло 8 и 10 ч, соотвественно.
Схемы реакций ковалентной иммобилизации белков на поверхности альдегид, сукцинимидилкарбонат- и имидазолкарабамат-содержащих носителей представлены на Рисунке 30. Для разработки и оптимизации метода ковалентного связывания белка на поверхности модифицированных полимерных носителей исследовано влияние ряда параметров на значение биоспецифической адсорбционной емкости получаемых матриц, выражаемой в количестве связанного лиганда (белка) на единицу веса или поверхности монолитного носителя. В частности, были исследованы зависимости количества иммобилизованного лиганда от времени реакции, исходной концентрации белка, рН раствора и температуры.
Изучение зависимости количества лиганда, ковалентно присоединяемого к поверхности полимерной матрицы, от концентрации белка в растворе позволило установить, что для всех исследованных носителей максимум емкости достигается при использовании раствора с концентрацией белка 5 мг/мл. Данная концентрация соответствует значению, при котором достигался максимум связывания на ГМА-ЭДМА полимерном материале [186].
Влияние рН на процесс ковалентного связывания белка с альдегидными, сукцин имидилкарбонатными и имидазолкарбаматными группами исследовали при иммобилизации соевого ингибитора трипсина (СИТР) (Таблица 10). Максимальное значение связанного с сорбентом белка для альдегидсодержащего сополимера наблюдалось в области рН 8.1-9.4, тогда как для двух других реакционных групп (сукцинимидкарбонатных и имидазолкарбаматных) максимальная емкость связывания имела место при рН 7.6-9.4. Следует отметить, что связывание белка изменялось незначительно в столь широком интервале значений данного параметра.
