Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 5
1.1 Синтез полимерных микросфер для иммунохимических исследований. 5
1.2. Реакция латексной агглютинации . 10
1.3. Иммобилизация биолигандов на поверхность полимерных микросфер 17
ГЛАВА 2.0бъекты и методы исследования. 36
2.1.Исходные вещества. 36
2.2. Методы исследования. 37
2.2.1 .Получение полимерных суспензий и оценка их свойств. 37
2.2.2. Иммобилизация биолигандов на поверхность полимерных микросфер. 38
2.2.3 Реакция латексной агглютинации (рла). 39
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение. 41
3.1 .Сополимеризация стирола с метакриловой кислотой. 43
3.2. Полимеризация стирола в присутствии карбоксил содержащего кремни йор ганич ес кого пав. 49
3.3. Коллоидно-химические свойства липидов различной природы. 61
3.4. Полимеризация стирола в присутствии липидов различного происхождения . 70
3.5. Получение тест-систем с использованием в качестве носителей биолигандов полимерных микросфер с карбоксильными группами на поверхности. 78
3.6. Получение тест-систем для определения срб с использованием полимерных микросфер, содержащих на поверхности фосфолипиды различного происхождения. 90
Заключение 94
Выводы 96
Список литературы 97
- Реакция латексной агглютинации
- Полимеризация стирола в присутствии карбоксил содержащего кремни йор ганич ес кого пав.
- Полимеризация стирола в присутствии липидов различного происхождения
- Получение тест-систем с использованием в качестве носителей биолигандов полимерных микросфер с карбоксильными группами на поверхности.
Реакция латексной агглютинации
Реакция латексной агглютинации, РЛА, т.е. сшивание частиц корпускулярного антигена клеток, инертных частиц, нагруженных антигеном, под действием соответствующих антител с образованием агглютината (осадка), известна уже давно и детально описана в литературе.[144] Разработанные иммунохимические методы анализа на основе РЛА, позволяющие проводить определение любого растворимого антигена (белка, гаптена), имеют большое диагностическое значение. [106-124]
РЛА можно использовать для количественного, полуколичественного и качественного анализа. Ее проводят в пробирках, на планшетах для микротитрования, либо на специальных пластинах. В первых двух случаях время РЛА составляет от Юмин до 1-4 ч. В последнем варианте, с применением слайдов, учет результатов анализа можно проводить через 2-5 мин, что позволяет использовать этот тест в экспресс - диагностике.
Принцип работы тестов основан на иммунохимической реакции между антигеном (веществом, несущим признаки генетически чужеродной информации для данного вида организма) и антителами (белками, относящимися к классу иммуноглобулинов, продуцируемых клетками иммунной системы организма в ответ на появление антигена) с образованием комплекса антиген-антитело. Реакция образования такого комплекса является высокоиммуноспепифической, т.е. на появление в организме определенного антигена иммунная система вырабатывает антитела строго определенного строения, способные взаимодействовать только с этим антигеном. Вследствие того, что и антиген, и антитело могут взаимодействовать одновременно с несколькими молекулами, образуются пространственные сетки, узлами которой служат молекулы антигена.
Образование сеток - агломератов, а следовательно, и обнаружение того или иного вида антигенов, может быть зарегистрировано различными методами, например, методами спектрофотометрии, турбидиметрии, нефелометрии, лазерной автокорреляционной спектроскопии и т.д.
Использование для обнаружения комплекса антиген-антитело специального дорогостоящего оборудования создает заметные трудности для широкого применения указанных методов при диагностике заболеваний. В то же время связывание антигенов (антител) с полимерным носителем, который выполняет исключительно индикаторную функцию, позволяет даже невооруженным глазом обнаружить появление комплексов как скопление агломератов частиц носителя.
Первое сообщение об успешном применении поливинилтолуольных и полистирольных микросфер с узким РЧР для диагностики ревматоидного артрита появилось в 1956r.[171J Сообщалось, что взаимодействие антигенов, находящихся в сыворотке крови пациента, с гамма-глобулином, адсорбированным на поверхности микросфер суспензии, привело к слипанию (агглютинации) полимерных частиц и образованию крупных агломератов, легко различимых невооруженным глазом. Вслед за этим появились публикации по использованию частиц полистирольных и полиметилакрилатных суспензий в качестве носителей белка при получении диагностических тест-систем на другие типы заболеваний. [7]
Схема реакции латексной агглютинации. Антигены Антительный коньюгат Комплекс «Антиген-Антитело» Объектами исследования в реакции агглютинации могут быть сыворотка крови[152,153] молозиво, слезная жидкость, слюна, моча[153-155], цереброспинальная жидкость, т.е. все доступные биожидкости и биообъекты, содержащие антитела или антигены. Эту реакцию также можно использовать для выявления микроорганизмов, выделенных из среды культивирования. [51] В настоящее время реакция агглютинации превратилась в один из важнейших серологических методов, и для ее проведения стали применять частицы полимерных суспензий различной природы.[42-51,148-160] Существует два варианта тест-систем; антительный (AT) и антигенный (АГ). В АГ-тест-системе антигенные детерминанты находятся на поверхности полимерных микросфер и способны вступать в реакцию со специфичными антителами - реакция латексной агглютинации (РЛА). В АТ-тест-системе специфические антитела находятся на поверхности полимерных частиц и способны, как и в первом случае, реагировать с антигеном, образуя видимые агрегаты. Среди полуколичественных методов наиболее используемой является реакция на стекле.[161] Это один из первых тестов, который обычно проводился на стеклянной пластине многоразового пользования, обычно черного цвета. Для постановки данной реакции используют водную дисперсию неокрашенных полимерных частиц. В настоящее время данный анализ проводится на пластиковых или бумажных пластинках со специальным покрытием. Применение окрашенных полимерных частиц упрощает регистрацию агглютинации и дает возможность ставить реакцию на белых пластинках. Результаты реакции учитываются визуально через 2-5 мин. после смешивания образца и сенсибилизированных полимерных микросфер. Реакция считается положительной, если образуется творожистый осадок, и отрицательный - если система остается гомогенной.
Полимеризация стирола в присутствии карбоксил содержащего кремни йор ганич ес кого пав.
Полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам получают полимеризацией стирола в присутствии ПАВ, нерастворимых в воде [44,184,191,192,194,200]. Среди этих ПАВ особый интерес представляет карбркси л содержащий кремний-органический ПАВ -сЦкарбоксиэтил)-ш-(триметилсилокси) полидиметилсилоксан, ПДС [184,189].
Выбор ПДС в качестве стабилизатора полимерных микросфер был основан на следующих его свойствах. Во-первых, ПДС нерастворим в воде, поэтому образование частиц в такой эмульсии стирола будет происходить только из микрокапель мономера, что предполагает, при обеспечении их устойчивости в процессе синтеза, формирование полимерных микросфер одного размера.
Во-вторых, ПДС несовместим с полистиролом, поэтому по мере образования полимера он будет им вытесняться в межфазные слои частиц, тем самым повышать их вязкость и прочность, что должно привести к получению полимерных суспензий, устойчивых в процессе синтеза при иммобилизации биолигандов и при хранении.
И, наконец, в межфазных слоях полимерных микросфер будут содержаться карбоксильные группы молекул ПДС, которые после их активации одним из известных способов [7,34,42,111,144], взаимодействуют с аминогруппами биолиганда.
Во всех случаях полимеризацию стирола инициировали персульфатом калия. Полимерные молекулы, содержащие в своем составе ионогенные фрагменты молекул инициатора, ориентируются на границе раздела полимерная частица/вода и формируют в межфазном слое частиц электростатический фактор стабилизации, тем самым повышая устойчивость полимерной суспензии.
Для того, чтобы получить в присутствии ПДС полистирольные суспензии с различными диаметрами частиц и свойствами, предъявляемыми к частицам, используемым в качестве носителей биолигандов, необходимо было изучить влияние способа проведения процесса, а также концентраций всех компонентов рецепта полимеризации на диаметр частиц, их распределение по размерам и І;-потенциалу.
Полимеризацию проводили двумя способами: обычной гетерофазной полимеризацией, когда стирол, содержащий растворенный ПДС, эмульгируется водой и одновременно в образующейся эмульсии инициируется полимеризация стирола, и затравочной полимеризацией стирола, содержащего растворенный ПДС, на полистирольных затравочных частицах, полученных полимеризацией стирола в отсутствие эмульгатора. Эти два способа синтеза полимерных суспензий позволяют получить полистирольные микросферы с различным диаметром и значением -потенциала.
Исследования были начаты с изучения влияния концентрации ПДС на скорость полимеризации, молекулярную массу полимеров, диаметр частиц и их распределение по размерам. Кинетические кривые конверсия - время полимеризации стирола, инициированной персульфатом калия, в присутствии ПДС различной концентрации приведены на рисунке 3.2.1.
Распределение по -потенциалу для частиц, полученных полимеризацией стирола в присутствии ПДС, взятого при концентрации 4% масс в расчете на стирол. Агрегативная устойчивость полимерных суспензий при всех исследованных концентрациях ПДС была высокой, при полной конверсии мономера коагулюм отсутствовал.
Наблюдаемый характер зависимостей скорости полимеризации молекулярных масс полимеров и диаметров частиц от концентрации ПДС заметно отличаются от наблюдаемых при эмульсионной и суспензионной полимеризации стирола в присутствии традиционных эмульгаторов (алкилсульфоната натрия, солей жирных кислот и т.д.) и стабилизаторов (поливинилового спирта, желатина и т.д.) [196]. В первом случае (при эмульсионной полимеризации стирола) скорость полимеризации и молекулярные массы полимеров возрастают с увеличением концентрации эмульгатора, а средние диаметры частиц уменьшаются [199]. Во втором случае, при суспензионной полимеризации стирола, скорость полимеризации и диаметры частиц не зависят от концентрации стабилизатора [196].
И в первом и во втором случаях распределение частиц по диаметрам шире наблюдаемого в присутствии ПДС. Полученные результаты подтверждают ранее высказанную гипотезу о механизме формирования частиц [196], согласно которой наблюдаемый характер кинетических зависимостей обусловлен тем, что при полимеризации стирола в присутствии ПДС образование частиц и формирование в их межфазных слоях факторов устойчивости происходит по иному механизму. Так как ПДС нерастворим в воде, то полимерно-мономерные частицы образуются только из микрокапель мономера и формирование в межфазном слое структурно-механического фактора стабилизации происходит уже на ранних стадиях полимеризации в результате вытеснения образующимся полистиролом ПДС на границу полимерная микросфера/вода. Концевые ионогенные группы полимерных цепей, фрагменты молекул инициатора и карбоксильные группы ПДС формируют в межфазном слое частиц электростатический фактор устойчивости. Таким образом, реакционная система устойчива в процессе полимеризации, а полимерные частицы имеют узкое распределение по размерам.
В пользу предложенного механизма образования частиц свидетельствуют и данные по исследованию поверхности полимерных микросфер методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии для химических анализов, РФЭС, определению -потенциала частиц методом лазерной спектроскопии и изучению формирования структуры частиц методом сканирующей и просвечивающей элек тронной микроскопии. Оказалось, что на поверхности частиц содержится в 37 раз больше молекул ПДС, чем в объеме. Полимерные частицы имеют структуру типа "ядро-оболочка" [184].
Исследования формирования структуры пол и сти рольных частиц полученных в присутствии ПДС показали, что если их размеры порядка 0,5-1 мкм, то образующийся по мере протекания полимеризации полимер успевает до начала фазового распада системы вытеснить кремнийорганический ПАВ к границе раздела, т.е. на поверхность частиц [200].
Повышение концентрации ПДС приводит к увеличению вязкости и прочности межфазного слоя частиц, а также к уменьшению эффективности дробления капель мономера на начальной стадии полимеризации. Это соответственно является причиной уменьшения числа капель мономера и увеличения их диаметра, затруднения диффузии мономера и инициатора в частицы, уменьшения молекулярной массы полимера и увеличения диаметра частиц.
Полимеризация стирола в присутствии липидов различного происхождения
В литературе сведения о полимеризации мономеров в присутствии липидов в качестве ПАВ весьма ограничены. Опубликованы данные по изучению эмульсионной полимеризации стирола в присутствии фосфолипидов, химически и физически связывающихся с поверхностными функциональными группами полимера латексных частиц [201,202]. Авторами специально были синтезированы функциональные фосфолипидные производные и в их присутствии инициировали полимеризацию стирола персульфатом калия (ПК) и 2,2 азобис (4-метокси-2,4 диметил) валеронитрилом (ВН). Было показано, что при использовании сополимеризующихся фосфолипидов образуются полимерные суспензии, содержащие частицы сферической формы, а в присутствии не содержащих двойную связь - частицы несферической формы. Распределение частиц по размерам шире при инициировании полимеризации маслорастворимыми инициаторами, чем при инициировании водорастворимыми, диаметры частиц в зависимости от природы и концентрации инициатора изменяются в интервале 0,1 0,4мкм.
Авторами установлено, что фосфолипиды локализованы на поверхности частиц, причем при инициировании полимеризации ВН, они полностью гидролизованы, а при инициировании ПК - нет. Данных о взаимодействии фосфолипидов, находящихся на поверхности частиц, с белками не приводится.
Приведенных результатов явно не достаточно для выбора условий синтеза полимерных суспензий, отвечающих требованиям, предъявляемым к частицам, которые используются в качестве носителей биолигандов при получении тест-систем.
Полимеризацию стирола изучали в присутствии ЛР, ЛРМ, ЯФХ и ягЯФХ. Анализ коллоидно-химических свойств липидов (гл.3.3.1) показал, что они характеризуются высокой поверхностной активностью на границе вода/воздух и совместно с полимером образуют межфазные слои высокой прочности, т.е. можно ожидать образования полистирольных суспензий с узким распределением частиц по размерам. Зависимости конверсия-время приведены на рис. 3.4.1.
Зависимости выхода полимера от времени. Условия полимеризации: объемное соотношение мономер/вода 1:9, [K2S2O8]=1,0%Macc в расчете на мономер, концентрация липида - 1% масс в расчете на мономер: Полимеризацию стирола проводили при объемном соотношении стирол/вода, равном 1:9, концентрации K2S2O8 равной 1%масс в расчете на стирол. Все полученные зависимости имеют типичную для гетерофазной полимеризации S-образную форму и незначительно отличаются друг от друга длиной стационарного участка и значениями скорости процесса, которые достаточно близки (0,32-0,5 % / мин).
С наибольшей скоростью протекала полимеризация стирола в эмульсии, стабилизированной ЛР; наибольшей длиной стационарного участка на кривой конверсия-время характеризовалась зависимость, полученная при полимеризации стирола в эмульсии, стабилизированной гидрогенизированным и яичным фосфолипидами. Практически до полной конверсии мономера полимеризация в дилатометре протекает за 8 часов, а в реакторе емкостью 1 л в тех же условиях за 20 часов.
Изменение размеров полимерно-мономерных частиц в процессе синтеза полистирольной суспензии показано на рис. Видно, что независимо от природы липида, характер изменения размеров полимерно-мономерных частиц с увеличением конверсии мономера одинаков: начиная с 10 %-ной конверсии стирола размеры частиц практически не изменяются. Кроме того, частицы суспензии сохраняют сферическую форму и узкое распределение по размерам в течение всего процесса полимеризации. Средние размеры частиц равны 0,5-0,6 мкм.
Полученные результаты свидетельствуют о высокой прочности межфазных адсорбционных слоев полимерно-мономерных частиц, обеспечивающих их стабильность с низких конверсии мономера. Необходимо отметить, что несмотря на то, что поверхностная активность ЯгФХ и РЛ отличается в 5 раз, в их присутствии были получены полистирольные суспензии с близкими значениями средних диаметров (0,5-0,6 мкм) и узким распределением по размерам.
Получение тест-систем с использованием в качестве носителей биолигандов полимерных микросфер с карбоксильными группами на поверхности.
Видно, что они характеризуются близкими значениями средних диаметров полимерных микросфер и -потенциала. IgG ковалентно связывали с карбоксильными группами, содержащимися на поверхности полимерных микросфер после их предварительной активации. Вначале получали конъюгаты lgG-ПСТ-МАК с концентрацией IgG в широком диапазоне значений: от 10"9 до 2 мг/мл и находили оптимальные условия проведения РЛА. Как показали эксперименты, активность тест-систем зависит сложным образом от исходной концентрации IgG (табл. 3.5.2). Исключение составили тест-системы под номером б и 7. Тест-системы №6 и №7 участвовали в РЛА в интервале концентраций СРБ от 25 до 380 мкг/мл. В остальных случаях результаты РЛА были плохо воспроизводимы. При использовании тест-систем №6 и №7 для определения содержания СРБ в сыворотке крови чувствительность метода составляла 25 мкг/мл. По чувствительности эти результаты вполне сравнимы с результатами, наблюдаемыми при использовании метода турбидиметрического анализа, который на сегодняшний день используется в прктической медицине. Чувствительность РЛА при использовании тест-систем lgG-ПСТ-ПДС показана в табл. РЛА протекает примерно в те же временные периоды, как и при использовании тест-системы lgG-ПСТ-МАК, но чувствительность РЛА составляет 1,5 мкг/мл (по сравнению с 25 мкг/мл для тест-системы lgG-ПСТ-МАК). Наилучшие результаты были получены с тест-системой №3, в которой концентрация у-глобулиновой фракции IgG была равной 1 мг/мл. Эта тест-система определяла СРБ в достаточно широком диапазоне концентраций (3-380 мкг/мл) и по своей чувствительности превосходила используемые для этой цели другие, ранее известные способы анализа СРБ. Таблица . Результаты исследования тест-систем lgG-ПСТ-ПДС в РЛА № Концентрация IgGдля конъюгацииПСТ-ПДС(1%масс), мг/мл Концентрация СРБ, мкг/мл Примечание: наличие агглютинации отмечено знаком "+" ее отсутствие - знаком "-". Влияние концентрации ПДС, используемой при синтезе полимерных микросфер, на свойства тест-систем в РЛА показано в таблице 3.5.4. Количество ковалентно иммобилизированного IgG было одинаковым и равным 1 мг/мл. Та блица 3.5,4. Результаты исследования РЛА. № ПолимерныемикросферыиммобилизирванныеIgG (1 мг/мл) Концентрация СРЄ, мкг/мл
Видно, что концентрация ПДС практически не влияет на чувствительность РЛА, и тест-система определяет СРБ практически в тех же концентрационных интервалах. В литературе имеются сведения о том, что заряд частиц оказывает заметное влияние на физическую адсорбцию биолиганда и ковалентное связывание белка с полимерными микросферами.[140] Была предпринята попытка, используя метод лазерной спектроскопии, оценить изменение распределения частиц по размерам и ij-потенциалу в полученных тест-системах. Результаты исследований представлены в таблице 3.5.5. и на рисунках 3.5.1-3.5.8. Видно, что тест-системы, представляющие собой полимерные микросферы с иммобилизованным lgG-лигандом на поверхности путем физической адсорбции и ковалентного связывания имеют большие средние диаметры и значения -потенциала, чем частицы исходных полистирольных суспензий. Полимерные микросферы с иммобилизованным на их поверхности биолигандом сохраняют сферическую форму и узкое распределение по размерам (рис.3.5.8). Показано, что оптимальной концентрации белка, при которой наблюдается наибольшая чувствительность РЛА, соответствует наибольшее значение заряда частиц и наибольшее значение диаметра. Увеличение концентрации ПДС не оказывает сильного влияния на -потенциал тест-систем, однако, заметно влияет на средний диаметр частиц (рис. 3.5.4-3.5.6). Размеры и -потенциал исходных полимерных микросфер и полученных на их основе тест-систем, № Полимерная суспензия Конц. IgG при конъюгации,мг/мл Диаметр частиц, мкм -потенциал,мВ Таким образом, тест-системы для определения СРБ методом РЛА, полученные с использованием полимерных микросфер с карбоксильными группами на поверхности, позволяют в течение короткого времени (5-7 мин) визуально (в отсутствие приборного оснащения) проводить учет результатов анализа. Для установления диагностической значимости была проведена апробация разработанного метода РЛА для определения СРБ в сыворотках крови больных с различными патологиями: ишемической болезнью сердца (ИБС) (15 образцов), воспалительными ревматологическими заболеваниями (РЗ) (13 образцов), асцитные жидкости онкологических больных (ОБ) (5 образцов) и острым панкреатитом (ОП) (3 образца). Тестирование данных сывороток на наличие СРБ проводили также рутинным методом радиальной иммунодифузии (РИД). Результаты проведенных исследований представлены в табл.3.5.6. Как видно из представленных в табл.3.5.6 данных, методом РЛА при определении концентрации СРБ в сыворотках крови больных ИБС, РЗ, ОБ хорошо коррелировали с рутинным методом РИД, причем коэффициент корреляции колеблется от 0,91 до 0,97 (р 0,001). Таким образом, диагностические тест-системы, включающие полимерные микросферы ПСТ-МАК и ПСТ-ПДС и lgG-фракцию к СРБ, могут быть применены для определения СРБ в крови человека. Предпочтительны тест-системы, полученные с использованием в качестве носителя биолиганда полимерных микросфер ПСТ-ПДС, так как они обладают более высокой чувствительностью и позволяют определять СРБ в широком диапазоне концентраций. Они сохраняют свои свойства при хранении более 6 месяцев.
