Введение к работе
Актуальность. Структурно-функциональное состояние белков на границах раздела фаз в значительной степени определяет протекание многих жизненно важных процессов в клетках. Именно на границах раздела фаз локализованы и функционируют многие биомолекулы, отвечающие за процессы транспорта, метаболизма и сигнальной трансдукции. Таким образом разработка новых подходов к исследованию структурно-функциональных особенностей белков и ферментов в модельных коллоидных системах представляет очевидный интерес с фундаментальной точки зрения. Кроме того, исследование на молекулярном уровне механизмов образования и с табилизации искуственных коллоидных систем имеет огромное значение для разработки новых лекарственных форм, а также новых технологий для пищевой и косметической промышленности. Исследование функционирования белков и ферментов в коллоидных системах, на границе раздела фаз и в микроэмульсиях, тесно связано с изучением механизмов регуляции и обмена в живых системах. Наряду с неоспоримой фундаментальной значимостью, исследование особенностей функционирования белков в коллоидных системах представляет особый интерес с точки зрения практического приложения. В первую очередь речь идет о разработке новых лекарственных форм, пищевых коллоидных систем и биологически активных добавок, а также, фермент-содержащих синтетических моющих средств. В связи с открывающимися перспективами практического применения, исследование адсорбции белков на поверхностях раздела фаз привлекает все большее внимание исследователей.
В настоящее время, в арсенале исследователей практически отсутствуют прямые методы, позволяющие на молекулярном уровне изучать структурные и динамические свойства белков адсорбированных на поверхности раздела фаз. Информация, встречающаяся в литературе, носит скорее качественный характер.
Таким образом, разработка новых высокочувствительных методов, позволяющих получать информацию о структурных и динамических свойствах белков в коллоидных системах, открывает широкие перспективы, как для фундаментальных исследований, так и для создания новых технологий для пищевой промышленности, биотехнологии и медицины.
Целью работы является разработка новых подходов для исследования структурно-функциональных свойств ферментов и белков в коллоидных системах, на поверхности раздела фаз и в микроэмульсиях. Для проведения данного исследования были применены модельные системы:
-
Белки и их комплексы адсорбированные на поверхности раздела фаз вода-воздух;
-
Ферменты в системе обращенных мицелл ПАВ;
-
Ферменты в составе фермент-полиэлектролитных комплексов и ковалентных конъюгатов с полиалкиленоксидами (ПЭГ и плюрониками) в неводных средах.
Использование выбранных модельных систем позволяет в широких пределах варьировать условия
функционирования и характер взаимодействия компонентов в белок-содержащих
супрамолекулярных структурах. В работе были поставлены следующие основные задачи:
о На основе высокочувствительных микроспектроскопических методов, применяемых для
исследования свойств белков в растворах (флуоресцентных методов, TRFA, FCS, а также ИК-
спектроскопии), разработать методы исследования структурно-функциональных свойств белков в
коллоидных системах, на поверхности раздела фаз.
о С применением разработанных спектроскопических методов изучить основные закономерности
функционирования и структурные свойства ферментов и белков в коллоидных системах (включая
мультикомпонентные системы).
В качестве объектов исследования выбраны белки, широко применяемые для стабилизации пищевых
коллоидных систем, овальбумин куриного яйца и молочный Р-лактоглобулин, а также целый ряд
ферментов различных классов. При исследовании свойств белков и ферментов в
мультикомпонентных коллоидных системах использовали надмолекулярные белковые комплексы
(ассоциаты) и конъюгаты с соединениями различной природы:
комплексы ферментов с синтетическими полиэлектролитами различной структуры;
комплексы ферментов с природными олигоэлектролитами (олигоаминами);
олигомерные ферменты;
природные белковые ассоциаты, тела включения;
искуственно агрегированные белки;
комплексы белков с полианионными и поликатионными полисахаридами;
препараты ферментов, модифицированные соединениями различной природы;
конъюгаты ферментов с полиалкиленоксидами (ПЭГ, плюрониками).
о На основе найденных закономерностей разработать подходы для регуляции структурно-функциональных свойств белков и ферментов в коллоидных системах.
Научная новизна работы. В настоящее время, практически отсутствуют прямые методы, позволяющие изучать структурные свойства белков адсорбированных на поверхностях раздела фаз. Данных по структуре белков и белок-содержащих надмолекулярных ансамблей на поверхностях раздела фаз в литературе практически не встречается. В представленной работе впервые разработаны принципиально новые подходы, позволяющие исследовать структурные свойства белков адсорбированных на поверхности раздела фаз на основе высокочувствительных микроспектроскопических методов, применяемых для изучения структурных свойств белков в гомогенных системах. Суть разработанных подходов состоит в применении методов разрешенно-временной флуоресцентной спектроскопии и ПК спектроскопии в режиме внешнего отражения (соответственно, ER-TRFA и IRRAS) и разработка соответствующих методов спектральной симуляции для получения количественной информации о свойствах белков (концентрации, конформации, степени агрегации, молекулярной подвижности) адсорбированных на поверхности вода-воздух. Кроме того, для получения информации о диффузионных свойствах белков на поверхности раздела фаз впервые адаптирован и применен метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Впервые показано, что данные методы (ER-TRFA и IRRAS и FCS) чувствительны к изменениям пространственной структуры, общей и внутренней молекулярной динамики белков, а также состояния агрегации белков адсорбированных на поверхности вода-воздух. Продемонстрировано, что разработанные методы, ER-TRFA, FCS и IRRAS применимы как в случае моно-, так и мультикомпонентных коллоидных систем различного состава. С применением комбинации данных методов впервые получена детальная количественная информация о распределении белка в поверхностном слое, кинетике адсорбции, а также о структурно-
динамических свойствах белков адсорбированных на поверхности вода-воздух. Показано, что применение комбинации методов ER-TRFA, FCS и IRRAS открывает новые возможности для исследования на молекулярном уровне механизмов адсорбции биополимеров и их комплексов на поверхностях раздела фаз.
С применением модельной системы обращенных мицелл ПАВ, позволяющей целенаправленно регулировать олигомерный состав ферментов, был разработан принципиально новый метод для проведения рефолдинга рекомбинантных ферментов, образующихся в виде тел включения. Эффективность и универсальность предложенного метода была продемонстрирована на примере ферментов: галактозооксидаз (Fusgalox и Sagalox) и альдонолактоноксидазы (TcGAL).
Предложены новые подходы для исследования механизмов регуляции функционирования олигомерных и мембранотропных ферментов с применением модельной системы обращенных мицелл ПАВ. Изучена роль межсубъединичных взаимодействий в функционировании олигомерных ферментов на примере п-гидроксибензоат гидроксилазы (РНВН) и галактозооксидазы (Fusgalox). Были впервые получены полностью активные олигомерные формы данных ферментов, не реализующиеся в водных растворах, мономерная - в случае РНВН и димерная и тетрамерная - в случае Fusgalox. Найдено, что каталитическая эффективность полученных олигомерных форм выше по сравнению с таковыми в водном растворе, как в случае РНВН, так и Fusgalox. Установлено, что в случае РНВН механизм изменения каталитических параметров при образовании мономера, связан с конформационными перестройками в молекуле фермента при диссоциации димера, приводящими с одной стороны к увеличению каталитической активности, а с другой стороны - к инактивации и агрегации мономерной формы в водном растворе. Показано, что образование димера играет ключевую роль в поддержании нативной конформации фермента в случае РНВН.
Предложен новый подход для исследования влияния липидного состава матрицы на функционирование мембранотропных ферментов, основанный на применении системы обращенных мицелл. Показано, что данный подход является исключительно информативным для проведения такого исследования: позволяет варьировать липидный состав мицеллярной матрицы путем получения смешанных мицелл; учитывать влияние химической природы липидов на каждую из олигомерных форм фермента, а также исследовать влияние структуры липида на мембранотропные свойства фермента. На примере периферического мембранного фермента, кислой фосфатазы (КФ), показано, что липидный состав матрицы играет ключевую роль в функционировании мембранотропных ферментов. Показано, что влияние липидного состава системы на каталитические свойства КФ могут быть вызваны как влиянием липидного состава системы на структуру и свойства мицелл, так и являться следствием белок-липидных взаимодействий.
Детально изучен молекулярный механизм влияния комплексообразования с полиэлектролитами (ПЭ) на структурно-функциональные свойства ферментов и белков. Найдено, что взаимодействие белков с ПЭ приводит к образованию квази-регулярной компактной структуры комплекса двух уровней: внутренняя, доменная структура и общая - глобуло-подобная. Обнаружено, что в водно-органических системах, а также при адсорбции на гидрофобных поверхностях эффективность взаимодействия белков с ПЭ усиливается, что приводит к снижению константы диссоциации
комплексов и образованию более конденсированной структуры комплекса. Найдено, что образование таких структур приводит к ограничению как общей, так и внутренней подвижности фермента (увеличивает жесткость активного центра). Впервые показано, что образование компактной и упорядоченной структуры фермент-ПЭ комплексов является основной причиной активационного и стабилизационного эффектов, наблюдаемых в водно-органических системах.
Практическая значимость работы. Способность белков адсорбироваться на поверхностях раздела фаз вода-воздух и вода-масло является молекулярной основой образования и стабилизации белок-содержащих коллоидных систем, пен и эмульсий. Многие пищевые продукты представляют собой коллоидную систему, в которой белки и их комплексы играют роль стабилизаторов. Адсорбционные свойства белков здесь определяют условия получения, текстуру и вкусовые качества пищевых продуктов. На основе детального изучения механизмов адсорбции белков найдены корреляции между поверхностными свойствами белков и их способностью стабилизировать коллоидные системы. Предложены возможные пути регуляции поверхностно-активных свойств белков и реологических свойств белковых пленок. Показано, что эффективными методами контроля процесса образования, текстуры и стабильности белок-содержащих коллоидных систем являются: влияние на агрегационные процессы; образование комплексов белков с полиэлектролитами, а также варьирование физико-химических свойств среды. Найденные закономерности и предложенные подходы могут служить физико-химической основой при разработке новых продуктов в пищевой и косметической промышленности, при поиске новых лекарственных форм.
Разработан новый эффективный метод проведения рефолдинга рекомбинантных ферментов на основе мицеллярного подхода. Данный подход был успешно применен для ренатурации тел включения ферментов: галактонолактоноксидазы из Trypanosoma cruzi (TcGAL) и галактозооксидазы из Fusarium (Fusgalox). Преимуществом предлагаемого в данной работе подхода является возможность оптимизировать условия сворчивания фермента путем подбора оптимального размера мицелл, а также, возможность изолировать молекулу фермента в отдельной мицелле. Это, с одной стороны, повышает эффективность процесса сворачивания, а с другой стороны, защищает фермент от агрегации, включая образование межмолекулярных S-S-связей в процессе рефолдинга. Результаты исследований предназначены для получения рекомбинантным методом труднодоступных ферментов для их последующего использования в промышленной биотехнологии, в производстве косметических и лекарственных средств.
Разработан новый подход для повышения эффективности функционирования ферментов класса гидролаз, щелочной протеазы и целлюлазы, в составе синтетических моющих средств (CMC), основанный на комплексообразовании ферментов с природным полисахаридом, хитозаном. Продемонстрировано, что образование комплексов с хитозаном стабилизирует оба фермента. Общий эффект повышения каталитической активности ферментов, учитывая как увеличение уровня начальной активности фермента, так и стабилизационный эффект, составляет порядка 50-60%. Использование хитозана в качестве стабилизирующей добавки могло бы позволить снизить количество используемых в CMC ферментных преператов щелочной протеазы и целлюлазы в 2 раза,
что важно с точки зрения экологической безопасности использования фермент-содержащих моющих средств.
Предложены методы регуляции функциональных свойств ферментов (растворимости, каталитической активности и стабильности) в водно-органических смесях, основанные на образовании комплексов ферментов с ПЭ и конъюгатов с полиспиртами и низкомолекулярными полярными соединениями. Полученные результаты перспективны в плане расширения круга практического использования ферментов для аналитических целей и в тонком органическом синтезе. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих международных конференциях и симпозиумах: «Полиэлектролиты» (Коимбра, 2008); «Высокоорганизованные каталитические системы» (Москва, 2004); «Инженерия и изучение функционирования белков» (Москва, 2003); «ПАВ в растворах» (SIS-2002) (Барселона, 2002); «Биокатализ» (Москва, 2002); «Фолдинг» (Москва, 2000); «Биокатализ» (Москва, 2000); «Коллоидные системы на основе липидов и ПАВ» (Москва, 1999); «Высокое давление и Биотехнология» (Лиссабон, 1998); «Биокатализ» (Пущино, 1998); «Структура, Стабильность и Фолдинг белков» (Москва, 1998); «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 1997); «2 Съезд биохимического общества РАН» (Москва, 1997); «Растительные пероксидазы» (Вена, 1996); «16 Международный конгресс по биохимии и молекулярной биологии» (Нью-Дели, 1994); «Молекулярная подвижность и порядок в полимерных системах» (Санкт-Петербург, 1994); «Протеолитические ферменты» (Москва, 1994). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 статьи и 21 тезисы докладов на российских и международных конференциях.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, постановки задачи, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 430 ссылок. Диссертация изложена на 320 страницах машинописного текста.
