Введение к работе
Актуальность работы. Вопрос о фолдинге (процесс сворачивания белковой глобулы за счёт нековалентных взаимодействий, приводящий к компактизации полипептидных цепей) белков на различных уровнях молекулярной организации является одним из важнейших в современном естествознании, причём одной из основных проблем является изучение нековалентных взаимодействий, определяющих специфичность формирующихся супрамолекулярных структур. Два подхода, развитые в современной химии высокомолекулярных соединений и коллоидной химии - оперирование с мономолекулярными плёнками с использованием техники Ленгмюра и прямое измерение сил взаимодействия с помощью силовой микроскопии - являются перспективными для исследований ассоциации и других специфических взаимодействий, характерных для белков.
Коллагены относятся к самому распространённому классу белков животного происхождения с ярко выраженной способностью к образованию надмолекулярных структур, заложеной в него природой. Этот процесс включает по крайней мере следующую иерархию структур: три полипептидные а-цепи (первичная структура), свёрнутые в левую спираль (вторичная структура), ассоциируются с образованием тройной правозакрученной спирали (супервторичная структура), образуя молекулу коллагена (называемую тропоколлагеном). Далее тропоколлаген (длина 300 нм, диаметр 1,4-1,5 нм) ассоциируется в фибриллы. В свою очередь фибриллы образуют супрамолекулярные ансамбли, играющие in vivo роль внеклеточного матрикса, выполняющего не только функции несущих конструкций, но и определённую роль в передаче информации клеткам, регулируя их адгезию, миграцию и др., а также специфические взаимодействия с белками, нуклеиновыми кислотами и неорганическими ионами. Нарушение специфической ассоциации приводит к тяжёлым патологиям, зачастую мало исследованным (так называемые "коллагеновые болезни").
Изучение мономолекулярных слоев позволяет экспериментально моделировать отдельные этапы ассоциации белков в двумерном (2D) пространстве. Актуальность исследований механизма ассоциации коллагена в 2D системах определяется также практическими задачами воспроизведения in vitro биосовместимых материалов, по механическим и функциональным свойствам аналогичных коллагеновым структурам in vivo.
Цель работы. Моделирование отдельных этапов образования надмолекулярных структур коллагена с использованием метода мономолекулярных слоев при широком варьировании состава водной субфазы.
Научная новизна.
Впервые изучены свойства стабильных мономолекулярных слоев коллагена. Использованный подход позволил контролировать нековалентные взаимодействия при образовании надмолекулярных структур коллагена.
Показано, что изотермы поверхностное давление - площадь, приходящаяся на молекулу (гс-А) монослоёв коллагена характеризуются двумя близкими к линейным участками, разделёнными плато, условно названными жидко-растянутым и жидко-конденсированным. Жидко-растянутый участок отвечает мономолекулярному слою коллагена, в области плато образуются фибриллы. Жидко-конденсированный участок соответствует поверхностным плёнкам фибрилл коллагена. Плато разделяет ориентированные поверхностные слои: из ориентированных палочкообразных молекул тропоколлагена и ориентированных жёстких фибрилл коллагена. Точка коллапса связана с образованием неупорядоченных волокон.
Показан вклад электростатических взаимодействий при образовании фибрилл и волокон коллагена. Отклонение рН субфазы от изоэлектрической точки в кислую и щелочную область препятствует образованию надмолекулярных структур коллагена.
По изменению изотерм п-А монослоёв коллагена при варьировании природы и состава субфазы показано, что потеря устойчивости монослоёв коллагена может быть вызвана фазовыми переходами в смешанных монослоях (с н-гексанолом), изменением активности воды (mpem-бутанол) или денатурацией коллагена (мочевина и тиомочевина).
Практическая ценность работы. Полученные результаты позволяют определить оптимальные условия для получения устойчивых многослойных ЛБ-плёнок коллагена определённой структуры и контролируемыми свойствами.
Автор защищает:
о Предложенную схему ориентационных и фазовых переходов в монослоях коллагена на границе раздела вода-воздух и уточнённую модель фибриллы коллагена.
о Наличие вклада электростатических взаимодействий в монослое с процессами фибриллообразования и видом изотерм л-А.
о Предложенные модели взаимодействия спиртов (н-гексанола и трет-бутанола) и денатурирующих агентов (мочевины и тиомочевины) с монослоями коллагена, ведущие к потере устойчивости монослоёв вследствие образования смешанного монослоя (с и-гексанолом), нарушения слоя структурированной воды вокруг молекулы коллагена (трет-бутанол) и частичной или полной денатурации (мочевина и тиомочевина).
Апробация работы. Отдельные части данной работы представлены на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-97" (12-14 апреля 1997 года), "Ломоносов-98" (7-Ю апреля 1998 года) и "Ломоносов-99" (20-23 апреля 1999 года); на International Conference on Colloid Chemistry and Physical-Chemical Mechanics, 4-8 October
1998, Moscow, Russia; на Научно-технических конференциях МГТУ: 8-й (1997 г.), 9-й (1998 г.) и 10-й (20-30 апреля 1999 г.); на XIX Symposium on Rheology, June 22-27, 1998, Lithuania, Klaipeda.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ (2 статьи, 1 методическая разработка и 9 тезисов докладов на конференциях), часть материалов готовится к публикации.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы (347 наименований) и приложения. Работа изложена на 160 страницах, содержит 38 рисунков, 3 таблицы и приложение (6 страниц, 12 таблиц).
