Содержание к диссертации
Введение
I Литературный обзор 10
1 Природные полисахариды хитин ихитозан 10
1.1 Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана 10
1.2 Структурные характеристики хитина и хитозана 12
1.3 Деструкция хитозана
1.3.1 Химическая деструкция хитозана 21
1.3.2 Ферментативная деструкция хитозана
1.4 Свойства и применение хитозана 28
1.5 Применение хитозана в медицине
1.5.1 Полимерные покрытия для лечения и защиты ожоговых и гнойных ран 32
1.5.2 Полимеры как носители ферментных препаратов 36
1.5.3 Хитозан как носитель иммобилизованных ферментов 40
Заключение по литературному обзору 41
Экспериментальная часть 45
2.1. Исходные реагенты 45
2.2. Приготовление пленок хитозана 46
2.3 Модификация хитозановых пленок 46
2.3.1. Термомодификация хитозановых пленок 46
2.3.2.Получение хитозановых пленок в основной форме 46
2.3.3. Приготовление пленок хитозана со вторым полимером
(поливиниловый спирт и полидиметилдиаллиламмонийхлорид) 47
2.3 А. Приготовление пленок хитозана с ферментами 47
2.4. Определение степени набухания хитозановых пленок 47
2.5. Определение степени кристалличности исходных и деструктированных образцов хитозана 48
2.6. Определение молекулярных масс образцов хитозана методом скоростной седиментации 48
2.7. Деструкция хитозана в растворе 49
2.8. Деструкция хитозана в пленках 50
2.9 Определение микробиологической активности хитозановых пленок...50
2.10. Определение активности ферментов 51
2.10.1. Определение эндо-Р-гликозидазной активности 51
2.10.2. Определение экзо-Р-гликозидазной (арил-Р-гликозидазной) активности 52
2.10.3. Определение общей р-гликозидазной активности 52
III Обсуждение результатов 54
3.1. Ферментативная деструкция хитозана под действием ферментных препаратов медицинского назначения 54
3.1.1. Ферментативная деструкция хитозана в растворе 55
3.1.2. Ферментативная деструкция пленочных образцов хитозана 75
3.2. Регулирование ферментативной устойчивости пленочных хитозановых покрытий 80
3.2.1. Модификация пленочных хитозановых образцов. Перевод солевых пленок в основную форму 81
3.2.2. Модификация 83
3.2.3. Модификация пленочных хитозановых образцов. Изотермический отжиг 86
3.2.4. Возможность изменения степени кристалличности, Ферментсодержащие пленки 88
3.3. Некоторые практические следствия 93
Заключение 109
Выводы 112
Список литературы
- Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана
- Термомодификация хитозановых пленок
- Ферментативная деструкция хитозана в растворе
- Модификация пленочных хитозановых образцов. Изотермический отжиг
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из перспективных направлений в области поиска новых материалов для медицины стало изучение, создаїше и внедрение в практику материалов на основе хитозана. Уникальный комплекс нативных свойств хитозана - биосовместимость, биодеградируемость, нетоксичность на фоне высокой биологической и сорбционной активности, позволяют отнести этот аминополисахарид к немногочисленной группе промышлешю доступных, экологически безопасных полимеров и, в перспективе, -к потенциально новым биоматериалам на его основе, исключительно подходящим для использования в медицинских целях. Поскольку хитозан достаточно быстро претерпевает биодеградацию под действием ферментов живого организма, не образуя токсичных веществ, он может стать прекрасным биоразлагаемым защитным материалом для лечения открытых ран и ожогов. Особый интерес могут представлять ферментсодержащие пленочные хитозановыс материалы, которые целесообразно использовать на стадии очищения раны от некротических тканей и в косметической терапии келоидных рубцов. При этом существует принципиальная возможность регулирования скорости ферментативного разложения материалов на раневой поверхности.
В связи с этим особую актуальность приобретает целенаправленное изучение закономерностей ферментативной деструкции хитозана под действием неспецифических для хитозана ферментов, присутствующих на ране, а также поиск путей регулирования ферментативной устойчивости пленочных материалов, полученных на его основе.
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет» по теме «Химия и физико-химия полимеров и полимерных систем медицинского назначения» (ГР № 01.2006.10183). Научные исследования проводились при поддержке РФФИ проекта: «Физико-химические основы создания физиологически активных полимерных материалов с управляемыми свойствами для медицинского применения на основе полимеров природного происхождения» (грант р_поволжье_а №08-03-97030), а также ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (г/к №02.740.11.0648).
Цель работы. Изучение закономерностей ферментативной деструкции хитозана в растворе и в пленочных образцах, полученных из раствора, и поиск путей регулирования его ферментативной устойчивости.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
-изучение закономерностей ферментативной деструкции хитозана под действием ряда ферментных препаратов в растворе;
-изучение особенностей ферментативной деструкции пленочных хитозановых материалов, полученных методом формования из раствора;
-установление возможной причины деструкции хитозана под действием неспецифических ферментов;
-модификация пленочных образцов с целью регулирования их ферментативной устойчивости;
-изучение закономерности ферментативной деструкции ферментсодержащих пленочных материалов на основе хитозана.
Научная новизна и практическая значимость. В результате исследования закономерностей ферментативных превращений хитозана в растворе и твердой фазе:
выявлена роль надмолекулярных эффектов при ферментативной деструкции хитозана под действием неспецифических для него ферментов в растворе и в твердых пленках;
показано, что в области разбавленных растворов в термодинамически хороших растворителях макромолекулы хитозана в различной степени ассоциированы, что в свою очередь является причиной наблюдающейся зависимости скорости деструкции от термодинамического качества растворителя и концентрации раствора; в ферментативной дест-
рукции пленочных образцов хитозана надмолекулярный эффект проявляется как зависимость скорости и степени ферментативной деструкции от степени кристалличности образцов и плотности упаковки макроцепей;
выявлена принципиальная возможность регулирования ферментативной устойчивости пленочных образцов путем их направленной структурной модификации, при которой изменяется плотность упаковки макромолекул (перевод хитозана из солевой формы в основную, изотермический отжиг), следствием чего является уменьшение степени ферментативной деструкции пленок; добавление второго полимера -поливинилового спирта или полидиметилдиаллиламмоний хлорида, склонного к образованию гетероассоциатов с хитозаном в растворе, напротив, приводит к увеличению степени ферментативного разложения пленки, вследствие понижения плотности упаковки макромолекул;
показано, что ферментативной деструкции подвергается преимущественно аморфная фаза хитозана, в результате - повышается степень кристалличности деструктированных образцов; в случае твердых пленок с иммобилизованными ферментными препаратами повышение степени кристалличности хитозана приводит к повышению устойчивости пленок к последующему процессу ферментативного разложения при внешнем контакте с ферментами.
Разработаны принципиальные подходы к созданию пленочных хитозановых материалов с регулируемой биоустойчивостью, соответствующих современным требованиям к временным покрытиям для защиты и лечения ожоговых и гнойных ран. Материалы могут быть рекомендованы для клинического применения.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, МГУ, 2008 г. и 2011 г.), DC и X Международных конференциях «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Ставрополь, 2008 г. и Нижний Новгород, 2010 г.), Всероссийской конференции, посвященной 40-летию кафедры высокомолекулярных соединений ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет» «Высокомолекулярные соединения. Наука и практика» (Уфа, 2008 г), VII Всероссийской конференции «Химия и медицина. Орхимед-2009» (Уфа, 2009 г.), XVI Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2009г.), V Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры - 2010» (Москва, 2010г.), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы химии. Теория и практика» (Уфа,2010 г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новые материалы, химические технологии и реагенты для промышленности, медицины и сельского хозяйства на основе нефтехимического и возобновляемого сырья» (Уфа,2011 г.)
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 2/печатных работ, из них 6 статей - в журналах, входящих в перечень, рекомендованный ВАК для публикации материалов диссертационных исследований, 4 статьи - в сборниках статей и 2 статьи - в материалах Международных конференций, тезисы 2 докладов - на Международных и 6 докладов - на Всероссийских конференциях, получен 1 патент РФ с решением о выдаче.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 152 источника. Работа включает 14 таблиц и 41 рисунок.
Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана
XT — химически инертное вещество, нерастворимое в воде, в разбавленных растворах кислот и щелочей, органических растворителях. Он растворим в концентрированных растворах соляной, серной и муравьиной кислот, а также в некоторых солевых растворах при нагревании, но при этом он заметно деполимеризуется [2].
XT в качестве гликопротеина представляет самостоятельный интерес благодаря его особым биологическим, сорбционным и другим физико-химическим свойствам. Так, хитин-белковый комплекс, содержащий около 10% белка, обнаруживает, в отличие от хитина, повышенное набухание и приемлемую растворимость в водных средах. Это обусловлено тем, что такой комплекс, благодаря наличию в них определенного числа аминокислотных остатков, обладает в достаточной степени гидрофильной структурой [21].
Следует отметить, что хитин различается по своим физико-химическим свойствам в зависимости от источника получения. Хитин грибов содержит меньше азота, чем хитин крабов, и является менее кристаллическим, а также имеет более низкую степень ацетилирования [22].
Как и хитин, хитозан представляет собой аморфно-кристаллический полимер, но количество его структурных модификаций увеличивается до 6. Конформация макромолекул при переходе от хитина к хитозану существенно не изменяется, но заметно уменьшается общая упорядоченность структуры (степень кристалличности) [4, 23].
Композиционная неоднородность, присущая XT, сохраняется и в ХТЗ. Остатки белка, содержание остаточных ацетильных групп в ХТЗ, обусловленные неполной завершенностью реакции деацетилирования хитина, и характер распределения этих групп по цепи полимера могут заметно влиять на некоторые физико-химические свойства хитозана. Распределение ацетильных групп в хитозане, очевидно, будет зависеть от степени кристалличности или соотношения кристаллических и аморфных областей используемого хитина, так как реакция деацетилирования последнего легче протекает именно в аморфных областях. Вследствие этого распределение остаточных ацетильных групп в хитозане может иметь преимущественно блочный характер, а длина блоков, будет зависеть от размера и расположения аморфных областей хитина.
ХТЗ является-, довольно сильным основанием, и- легко образует устойчивые соли в кислой среде, чем объясняется его растворимость в разбавленных органических и неорганических кислотах (кроме серной) [24]. Наиболее часто в качестве растворителя используют водные растворы уксусной кислоты.
Растворы ХТЗ являются структурированными и неустойчивыми во времени системами. Некоторые авторы связывают снижение вязкости растворов хитозана при выдерживании с деструкцией полимера, другие -только с изменением конформации макроцепей и степени структурирования [25-29].
В работе [26] показано, что понижение вязкости растворов ХТЗ в уксусной кислоте во времени тем значительней, чем меньше концентрация кислоты в растворителе и выше концентрация полимера в растворе. Авторы считают, что эти процессы не являются следствием деструкции полимера (разрывом гликозидной связи или ассоциатов), и связывают изменение вязкости со структурными перестройками: образованием внутримолекулярных водородных связей макромолекул хитозана в 2%-ной уксусной кислоте, что приводит к сжатию макромолекулярных клубков и снижению вязкости, увеличение концентрации кислоты приводит к набуханию макромолекул, что препятствует образованию внутрицепных водородных связей, а образующиеся при этом межцепные контакты способствуют структурной стабилизации раствора.
В работе [25] исследовано фазовое состояние и реологические свойства системы хитозан - уксусная кислота - вода в широком интервале составов. Показано, что наименьшее структурирование имеют растворы в 10%-ной уксусной кислоте (УК), где, имеет место более полное протонирование аминогрупп полимера и их электростатическое отталкивание, затрудняющее образование крупных и прочных надмолекулярных образований. Высокие значения вязкости растворов ХТЗ в концентрированной 70%-ной УК объясняются авторами высокой степенью структурированности растворов, обусловленной структурированностью самого растворителя.
Авторами работ [25-26] установлено, что при хранении уксуснокислых растворов хитозана происходит снижении их вязкости, при этом более стабильны растворы в более концентрированной СНзСООН, за счет повышения степени структурированности растворов.
В работе [27] предполагается, что первопричиной снижения вязкости уксуснокислотных растворов хитозана при хранении является, деструкция полимера, протекающая даже в слабокислой среде. В свою очередь следствием деструкции является снижение степени структурированности раствора и его вязкости, резкое в первые несколько суток и замедляющееся, но приводящее к сильному разжижению раствора при выдерживании в течение более длительного времени.
Термомодификация хитозановых пленок
За последние годы появилось изобилие новых материалов, предназначенных для покрытия раны. Некоторые — используются для временного, другие — для постоянного покрытия ран. Одни являются полностью синтетическими, другие - производными биологических источников, в то время как есть и смешанный тип синтетических и биологических материалов.
Покрытие на раны и ожоги должно выполнять защитные и лечебные функции, в соответствии с которыми ему должны быть присущи следующие свойства [97]: 1. защитные (защита ран от проникновения инфекции извне, от внешнего механического травмирования, включая предотвращения повреждений при удалении покрытия); 2. адсорбирующие (покрытия должны поглощать выделяющийся экссудат или препятствовать экссудации, предотвращать скопление экссудата под повязкой и ослаблять его испарение через покрытие); 3. лечебные (покрытия должны препятствовать развитию инфекции в ране, обладать, анестезирующим и гемостатическим действием, препятствовать плазмопотере, совмещаться с необходимыми лекарственными веществами, способствовать отторжению некротической ткани, стимулировать заживление ран).
Эффективность перевязочных материалов для лечения ран в значительной степени обусловлена их сорбционными свойствами [98]. Обширные раны продуцируют значительное количество экссудата — до 0,35 ил/си" в сутки. Удаление выделяющегося экссудата с раневой і поверхности необходимо для предотвращения обратного всасывания в организм токсичных продуктов распада некротических тканей. Одновременно, вследствие элиминации ионов Na+ и К , обеспечивается нормализация осмотического давления, благодаря чему снижается уровень деструкции тканей. Сорбирующая способность раневой повязки зависит от скорости впитывания экссудата и сорбционной емкости перевязочного материала. Первое свойство особенно важно и обусловлено природой перевязочного материала. В случае использования гидрофобных материалов экссудат, не сорбируясь, быстро распространяется под повязкой, способствует мацерации кожи и активизации воспалительного процесса в ране.
Серьезным недостатком многих повязок является их прилипание к ране, в результате чего перевязки становятся болезненными, а главное — при этом происходит травмирование регенерирующих тканей. Многие положительные свойства перевязочных материалов снижаются вследствие повреждений, вызываемых снятием повязки, прилипшей к заживающей ране. Адгезия повязки к ране возникает в силу разных причин. В большинстве случаев происходит склеивание покрытия с поверхностью раны. Роль «клея» выполняет экссудат, который при высыхании образует струп. Прочность такого соединения зависит от химической природы полимера. С увеличением гидрофильности полимерного материала прочность его прилипания к ране повышается. Адгезия повязки к ране зависит также от морфологической структуры материала и увеличивается с возрастанием площади повязки, приходящейся на единицу поверхности контакта. На стадии заживления прилипание покрытия связано с прорастанием грануляционной ткани в поры перевязочного материала. Существует возможность создания прилипающих, но атравматичных, сорбирующих покрытий на основе природных и синтетических полимеров. Покрытия такого типа не нуждаются в удалении и остаются в ране до полного рассасывания полимера. Природа рассасывания может быть различной — медленное растворение полимера в экссудате либо биодеструкция [98].
Все полимерные покрытия с инкапсулированными в них лекарственными препаратами (обезболивающие, антибактериальные и гемостатические препараты, факторы роста, протеолитические ферменты и др.) должны обеспечивать дозированное и пролонгированное их высвобождение в ране.
В настоящее время используется широкий спектр полимерных покрытий: тканые и формованные пленки [98], губки [99], пены [100], гидроколлоидные и гидрогелевые покрытия [101, 102]. Для получения последних используются различные синтетические, искусственные и природные полимеры: поливиниловый спирт [103], коллаген [104], желатин [105], целлюлоза и альгинат [106, 107], хитозан [108] и карбоксиметилхитин [109]. Следует отметить, что покрытия на основе хитиновых соединений занимают особое место в этом списке, поскольку они обладают антимикробной активностью, активизируют макрофаги, усиливают
пролиферацию фибробластов [ПО]. Ацетилглюкозамин (структурная единица хитинов) может использоваться организмом в качестве предшественника мукополисахаридов [111], таких как гиалуроновая кислота, кератин, кератинсульфат и др., которые являются важными компонентами биоструктур.
Раневые покрытия на основе хитозана «Коллахит» (ТУ 9393-003— 78455243-2006) выпускает ООО «Коллахит» (г. Железногорск Красноярского края) в нескольких модификациях: «Коллахит-Г», покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса; «Коллахит-ФА» - покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса с включением антисептика фурагина калия и анестетика анилокаина, «Коллахит-Ш» - покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса с включением антисептика растительного происхождения шиконина, предназначенные для лечения инфицированных и неинфицированных ран, язв, пролежней различного генеза [124]. На их основе были получены модернизированные раневые покрытия, направленные на глубокую реконструкцию кожи в случаях обширной и глубокой ожоговой травмы.
Ферментативная деструкция хитозана в растворе
Поскольку протеолитические ферменты не должны вызывать гидролиз полисахарида, естественным было бы предположить, что деструкции подвергаются не 3-гликозидные связи ХТЗ, а белковые фрагменты, ковалентно связанные с макромолекулами ХТЗ. О том, что хитозан может иметь ковалентно связанные с ним белковые примеси, известно. В используемом нами образце ХТЗ они тоже присутствуют в количестве не более 0,1% масс. Предположение о том, что такое ничтожное количество белка может вызывать столь внушительное уменьшение характеристической вязкости и, следовательно, молекулярной массы ХТЗ, кажется маловероятным. Тем не менее, для проверки данной гипотезы, был проведен ферментативный гидролиз карбоксиметилцеллюлозы, которая априори не содержит веществ белкового происхождения, но имеет так же как и ХТЗ, 3-гликозидные связи. Как показали вискозиметрические исследования, добавление к водному раствору КМЦ ферментных препаратов «Трипсин», «Пепсин», «Лираза» и «Коллагеназа», приводит к аналогичным зависимостям. Как видно из рисунков 3.5 и 3.6, происходит закономерное изменение и относительной, и характеристической вязкости растворов по мере их выдержи с ферментами.
Зависимость изменения характеристической вязкости КМЦ, выделенной из 2% раствора, в воде от времени выдержки раствора с ферментными препаратами «Лираза» (1), «Трипсин» (2), «Коллагеназа»(3) и «Пепсин» (4). Массовое отношение (%) КМЦ : фермент = 95 : 5. Так же как для ХТЗ, наибольшая скорость ферментативного гидролиза наблюдается в случае использования ферментного препарата «Коллагеназа», наименьшая — при использовании «Трипсина». Таким образом, причина падения характеристической вязкости не связана с наличием в полимерах примесей белка.
В принципе изменение вязкости раствора полимера может являться следствием изменения молекулярной массы полимера под действием раствора уксусной кислоты, а не собственно ферментных препаратов. Это тем более возможно, если учесть тот факт, что в. отсутствие фермента, растворение ХТЗ в уксусной кислоте сопровождается резким, правда однократным изменением (уменьшением) в значениях его характеристической вязкости. Так, значение характеристической вязкости ХТЗ-1, не прошедшего стадию растворения в уксусной кислоте, и определенное в ацетатном буфере с рН=4,5, составляет [т]= 4,45 дл/г. Если этот же образец ХТЗ выдержать в 1% растворе уксусной кислоты в течение суток, выделить из раствора и снова определить его характеристическую вязкость в ацетатном буфере, то полученное значение [г\] составляет 3,1 дл/г, т.е. существенно меньше исходного значения, и от дальнейшего времени выдержка полимера в растворе не зависит. Подобные закономерности наблюдаются для всех изученных нами образцов ХТЗ. Как видно из данных таблицы 3.1, после выделения ХТЗ из раствора в уксусной кислоте, его характеристическая вязкость уменьшается всегда. Дополнительный прогрев переосажденного образца также сопровождается некоторым уменьшением значения вязкости. Для того чтобы корректно определить, с чем именно связано изменение характеристической вязкости ХТЗ в присутствии ферментных препаратов, и почему происходит уменьшение вязкости после переосаждения полимера, поставлены независимые эксперименты по изучению молекулярных масс ХТЗ методом скоростной седиментации; и определению продуктов гидролиза полисахаридов — восстанавливающих Сахаров. Как. видно из данных табл.. 3.1 и для переосажденного ХТЗ; и для прогретого образца; значение: константы седиментации и коэффициента диффузии фактически совпадает с их значениями для исходных образцов
Некоторые физико-химические характеристики образцов?хитозана, определенные в ацетатном буфере с рН=4; Образец ХТЗ Используемый фермент дл/г So 10й ед. Сведб. D0 10v Мщ Шу Msd 10iD
Это однозначно свидетельствует о том,, что- значение молекулярной массы ХТЗ в процессе его прогрева и переосаждения не изменяется, а значит растворение ХТЗ в растворе уксусной кислоты, не приводит к деструкции полимера. Напротив, выдержка ХТЗ в уксуснокислом растворе в присутствии фермента приводит к значительному уменьшению константы седиментации и увеличению коэффициента диффузии, а следовательно, значительному уменьшению молекулярной массы ХТЗ, имеющему место в результате протекания процесса ферментативной деструкции.
Определение концентрации восстанавливающих Сахаров в ходе эксперимента также показало, что выдержка растворов ХТЗ в уксусной кислоте в присутствии ферментных препаратов приводит к закономерному накоплению концентрации восстанавливающих Сахаров (схема 3.2, табл. 3.2), в то время как в отсутствии ферментного препарата этого не наблюдается.
Модификация пленочных хитозановых образцов. Изотермический отжиг
Зависимость степени ферментативного разложения от степени кристалличности вполне предсказуема - чем больше доступность звеньев XT3J находящихся в аморфной фазе, для взаимодействия с ферментом, тем интенсивнее проходит процесс ферментативного разложения полимера.
Факты повышения устойчивости пленок ХТЗ к процессу ферментативной деструкции вследствие уменьшения доступности его звеньев для взаимодействия с ферментом, подтверждаются изучением ферментсодержащих пленок, т.е. таких, в которых фермент был включен еще на стадии формирования.
Получение ферментсодержащихг пленок может быть рассмотрено как способ модификации пленочных хитозановых материалов, и как отдельный, важный и перспективный путь получения пленочных хитозановых материалов, которые целесообразно использовать на стадии очищения раны от некротических тканей. Ускорение отторжения струпа и очищение ран от омертвевших тканей является важнейшей задачей при лечении ожогов III А и III Б степени, т.к. тканевой детрит является питательной средой для развития микроорганизмов, и омертвевшие ткани препятствуют развитию грануляций и эпителизации ран. Использование хитозана для создания ферментсодержащих пленок как полимера, макромолекулы которого имеют ионизирующиеся группы, весьма актуально, так как устраняет необходимость модифицирования полимерной матрицы с целью иммобилизации ферментного препарата.
Как видно из рисунка 3.19, в том случае, когда фермент был добавлен в раствор ХТЗ, из которого потом путем удаления растворителя, формировалась пленка, полимер подвергался ферментативному разложению еще на стадии высыхания пленки. Именно по этой причине значения характеристической вязкости ХТЗ, выделенного из ферментсодержащей пленки, не приведенной в контакт с раствором фермента на подложке, отличаются от значения характеристической вязкости аналогичных хитозановых пленок, не содержащих фермент. При этом, обращает на себя внимание тот факт, что при содержании фермента в пленке более 10% масс. по отношению к ХТЗ, дальнейшего изменения характеристической вязкости практически не происходит. содержание фермента в пленке, % масс.
Изменение характеристической вязкости ХТЗ-3, выделенного после контакта пленки с раствором ферментного препарата «Коллагеназа» (7), «Пепсин» (2), «Лираза» (3) и «Трипсин» (4) в течении часа, от содержания фермента на подложке, в % масс, по отношению к ХТЗ.
Таким образом, получается, что при биодеструкции пленки под действием гликозидаз, которые, безусловно, присутствуют на раневой поверхности, и которые имеются в используемых нами ферментных препаратах, происходит медленное разрушение каркаса пленки, вследствие чего собственно протеолитический фермент выходит из пленки на поверхность раны. Для того чтобы промоделировать процесс деструкции ферментсодержащей пленки на ране, пленку, в которую уже был включен фермент в процессе формирования, помещали на ферментсодержащую подложку. При этом оказалось, что степень падения характеристической вязкости ХТЗ, определяется тем, сколько фермента уже содержится в пленке. Как видно из рис. 3.21, с увеличением количества фермента в пленке степень деструкции ХТЗ при контакте с раствором фермента уменьшается. При значительном содержании фермента в пленке порядка 5-10 %, помещение хитозановой пленки на подложку фактически не вызывает дальнейшего падения характеристической вязкости. Поскольку в соответствие с данными рентгеноструктурного анализа (см. рис. 3.12) при контактировании ХТЗ с ферментом, индекс кристалличности ХТЗ возрастает (поскольку фермент последовательно расщепляет гликозидные связи, находящиеся именно в аморфной части) понятно, что образцы с различным содержанием фермента в пленке можно охарактеризовать как образцы с различной степенью кристалличности. При этом, чем больше фермента содержится в пленке, тем большую часть «аморфных» звеньев он успеет расщепить за время формирования пленки, тем соответственно выше будет степень структурированности пленки и тем меньше будет степень и скорость ее ферментативного разложения. 40 время , мин Рис. 3.21. Изменение характеристической вязкости ХТЗ-3, выделенного из ферментосодержащих пленок с концентрацией фермента 0(7), 3(2), 5 (3) и 10 (4) мае. %, после контакта с раствором ферментного препарата «Коллагеназа» с концентрацией 5 мае. %, по отношению к массе ХТЗ, в зависимости от времени контакта. Таким образом, исследования ферментсодержащих хитозановых пленок подтверждают существование взаимосвязи между степенью и скоростью ферментативного превращения ХТЗ и его надмолекулярным состоянием, в частности, плотностью его упаковки, степенью структурированности раствора и индексом кристалличности"1 сформированной пленки. Немаловажным является и тот факт, что протеолитический фермент, выделяясь из хитозановоЙ! пленки, сохраняет свою активность на высоком уровне [151, 152].
