Введение к работе
Актуальность работы. Выделение и тонкая очистка вирусов имеет огромное значение при производстве вакцин и других медицинских препаратов на их основе. Диагностика заболеваний, основанная на высокочувсявительном детектировании вируса, направлена на раннее его выявление и своевременное проведение противоэпидемических мероприятий. Применяемые на практике традиционные методы вьщеления и детектирования вирусов, в том числе и хроматографические, как правило, демонстрируют низкую эффективность. Вероятно, причиной этому являются как физико-химические, так и биохимические особенности вирусов, а именно, их низкая диффузионная подвижность, связанная с большим размером, а также сложная многокомпонентная и достаточно лабильная структура вирусных частиц. Монолитные сорбенты, в частности, твердый макропористый сополимер 2,3-эпоксипропилметакрилата (глицидилметакрилата) с этиленгликольдиметакрилатом (ГМА-ЭДМА), широко используются в качестве стационарных фаз при реализации различных процессов, основанных на межфазовом переносе вещества (хроматография, биоконверсия, твердофазный химический синтез). Высокая проницаемость монолитных сред, обусловленная особенностями морфологической структуры, обеспечивает специфический механизм быстрого переноса вещества, характеризуемый преобладанием конвекции над диффузией. В результате реализуется возможность использования существенно более высоких скоростей элюции, чем в случае традиционных дисперсных сорбентов, что позволит избежать деструкции биопродукта и, соответственно, потери его активности. Таким образом, разработка и оптимизация методологического комплекса, включающего как высокоэффективную сепарацию вирусов, так и их достоверную идентификацию с использованием современных полимерных материалов, в частности, монолитных сорбентов и новейших подходов диагностики вирусных инфекций с привлечением биочиповой технологии, является, несомненно, актуальной задачей.
Цель исследования. Целью настоящей работы являлось исследование особенностей адсорбции крупных модельных частиц и вирусов на функционализированной поверхности ГМА-ЭДМА монолитных фаз в динамическом формате, т. е. в режиме высокоэффективной жидкостной хроматографии на метакрилатных монолитах, а также в статическом формате с использованием трехмерных биочипов с аналогичной полимерной поверхностью. В практические цели исследования также входила разработка схем выделения и методов детектирования вирусов, с учетом выявленных особенностей адсорбции вирусоподобных частиц на поверхности монолитных фаз. В связи с вышесказанным, были поставлены и решались следующие задачи:
конструирование физико-химических моделей вирусов с использованием различных материалов и методов;
исследование особенностей адсорбционного поведения модельных наночастиц в динамических условиях различных вариантов высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ);
построение модельной системы, имитирующей взаимодействие вирус-клетка, при участии специально сконструированных наночастиц и функционализированной поверхности монолитного сорбента;
на примере модельных наночастиц, разработка методов биоанализа в формате биочипа, построенных на использовании монолитных полимерных слоев;
разработка и оптимизация хроматографических схем выделения вируса гриппа из сложных биологических образцов, а также диагностической нанотест-системы для детектирования вируса гриппа непосредственно в клиническом материале.
Объектами исследования являлись физико-химические модели вирусов, полученные с использованием методов сшивки белка с помощью диальдегида и ковалентной мо-
4 дификации поверхности полимерных наносфер белками и другими лигандами, имитирующими компоненты вирусной оболочки, а также вирусы гриппа.
В качестве методов исследования использовались: спектрофотометрия в УФ- и видимой областях, элементный анализ, ИК-спектроскопия, колориметрические, биохимические и биологические методы: экслюзионный, ионообменный и аффинный варианты жидкостной хроматофафии; зональный и фронтальный хроматофафические методы анализа; флюоресцентный и иммуноферментный методы анализа; метод твердофазной денситомег-рии (в УФ и видимой области спектра); полиакриламидный гель-электрофорез.
Научная новизна. На примере вирусоподобных синтетических частиц впервые научно обоснована возможность реализации скоростных эффективных процессов сепарации крупных биологических объектов (вирусов) с использованием ионообменного и биоаффинного вариантов жидкостной хроматофафии на ультракоротких монолитных колонках, отличающихся избирательностью адсорбции и энергией взаимодействия вещества с поверхностью стационарной фазы. Впервые показана возможность проведения количественного анализа вирусоподобных частиц в формате ЗВ-биочипов на основе макропористого сополимера ГМА-ЭДМА с использованием детектирующего метода твердофазной денси-томефии. Путем выбора из широкого ряда кандидатов оптимального лиганда впервые предложен эффективный метод выделения вируса гриппа A (H1N1), основанный на псев-до-аффинном варианте хроматографии на монолитах. Впервые предложен высокочувствительный метод детектирования вирусов фиппа А и В с использованием разработанной тест-системы (биочипа).
Практическая значимость работы. Сконструированы биораспознающие системы для сепарации вирусов методом высокоэффективной псевдо-аффинной хроматофафии на монолитах. Предложен метод чувствительной и эффективной диагностики вирусов фиппа А и В с использованием специально сконструированных ЗБ-биочипов (трехмерных биочипов). Таким образом, разработан и оптимизирован методологаческий комплекс, включающий сепарацию вирусов и их достоверную идентификацию с привлечением одного и того же ГМА-ЭДМА сорбента монолитного типа.
Основные положения, выносимые на защиту:
физико-химические модели вирусов (вирусоподобные наночастицы) могут быть получены конфолируемыми методами сшивки белка с использованием диальде-гида, а также ковалентной модификации полимерных наносфер белком и другими лигандами;
адсорбция вирусоподобных наночастиц на функционализированной поверхности сорбента (монолита) определяется природой белка, локализованного на их поверхности;
величина максимальной адсорбционной емкости сорбента в аффинном и ионообменном вариантах ВЭМДХ уменьшается с увеличением размера наночастиц и не зависит от скорости потока подвижной фазы;
усложнение микроокружения на поверхности как сорбента, так и наночастиц в модельной системе, имитирующей взаимодействия «вирус-клетка», может оказывать влияние на характеристики биоспецифического связывания;
использование различных подходов к иммобилизации лигандов при создании эффективных нсевдо-аффинных носителей демонстрирует возможность увеличения производительности хроматофафических процессов, основанных на биоспецифическом взаимодейсгвии вируса фиппа с адсорбционно-активными сайтами сорбента;
методологические подходы детектирования и количественной оценки связывания, разработанные на примере вирусподобных частиц в формате непроточных ГМА-
5 ЭДМА слоев (биочипов), могут быть положены в основу чувствительных тест-систем для диагностики вируса гриппа.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на ряде международных и российских симпозиумов и конференций: 5* International Symposium «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), II Санкт-Петербургской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, Россия, 2006), 2nd Monolith Summer School «Application in biochroma-tography, bioconversion and solid phase synthesis» (Порто Рож, Словения, 2006), 4th International Congress on Analytical Sciences (Москва, Россия, 2006), The Young Scientists' and Students' International Scientific Conference «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, Украина, 2007), а также обсуждались на научно-практическом семинаре «Ионный обмен, хроматография и альтернативные методы» Российского Менделеевского химического общества (Санкт-Петербург, Россия, 2007) и были представлены на конкурсе молодых ученых ИВС РАН (Санкт-Петербург, Россия, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано десять печатных работ, включающих 3 полнотекстовые статьи и 7 тезисов докладов.
Вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, а также в подготовке докладов и публикаций.
