Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методы исследования деформируемости эритроцитов 9
1.1 Состав крови 9
1.2 Структура эритроцита 12
1.3 Моделирование формы эритроцита 19
1.4 Гемолиз и сопутствующие явления 21
1.5 Методы исследования механических свойств эритроцитов 24
1.6 Оптические методы контроля параметров эритроцитов 30
1.7 Дифракция на объемных телах 37
Выводы
Глава 2. Осмотическая резистентность эритроцитов 49
2.1 Сравнительный анализ моделей формы эритроцита 49
2.2 Изменение радиуса эритроцита в гипоосмотических растворах 53
2.3 Дисперсия при трансформации диск - сфера 56
2.4 Влияние жесткости мембраны на кривую гипоосмотического гемолиза 57
оыводы 61
Глава 3. Лазерная дифрактометрия гипоосмотического набухания эритроцитов 62
3.1 Методика приготовления образцов крови 63
3.2 Материалы исследования 69
3.3 Анализ погрешностей экспериментальных исследований 72
3.3.1 Расчет погрешности приготовления растворов
3.3.2 Анализ влияния параметров лазерного излучения 75
3.3.3 Анализ точности экспериментальной установки 78
3.4 Исследование гипоосмотического набухания методом лазерной дифрактометрии 82
3.5 Гипоосмотическое набухание эритроцитов у разных групп больных 85
3.6 Скачкообразный характер набухания сферулированного эритроцита 90
Выводы 94
Глава 4. Дифрактометрия гипоосмотической кривой 96
4.1 Модель дифракции лазерного излучения на образце эритроцитов 96
4.2 Эхиноцитоз при гипоосмотическом набухании 100
4.3 Влияние эхиноцитоза на контраст ДК 105
Выводы 110
Заключение 112
Приложение 115
Список литературы
- Моделирование формы эритроцита
- Изменение радиуса эритроцита в гипоосмотических растворах
- Расчет погрешности приготовления растворов
- Эхиноцитоз при гипоосмотическом набухании
Введение к работе
Актуальность работы. В науке и техяихс измерения занимают центральное место. Изобретение лазеров расширило возможности оптических методов измерения в силу их основных преимуществ: высокого пространственного разрешения и высокой точности. Особенно высок интерес к применению когерентно-оптических методов измерения в биологии и медицине.
Среди когерентных методов наиболее перспективна лазерная дифрактометрия. Основные достоинства лазерной дифрактометрии -инвариантность, неконтактность, высокая точность (до сотых долей мкм), возможность автоматизации измерения - способствуют широкому ее применению, и в частности, для измерения геометрических размеров эритроцитов. Показатели реологии крови -вязкость, агрегация и деформируемость эритроцитов (ДЭ). Снижение ДЭ является одним из признаков ухудшения снабжения тканей кислородом. При ряде заболеваний системы крови, и в частности, множественной миеломе (ММ), нередко наблюдаются осложнения, в основе которых лежит нарушение реологических свойств крови с расстройством микроциркуляции: гипервискозный синдром, недостаточность кровообращения, острая и хроническая почечная недостаточность и другие, которые существенно ухудшают ее течение и способствуют развитию осложнений. Совершенно очевидно, что их раннее выявление и проведение своевременных лечебных мероприятий будет способствовать предупреждению и даже ликвидации осложнений, стабилизации основного патологического процесса. Так как ДЭ - один из основных параметров, определяющих реологические свойства крови, то его изучение безусловно представляется актуальным. Важно выявить причины ухудшения ДЭ при ММ и определить основные пути по их устранению.
К настоящему времени предложено много прямых и косвенных методов оценки ДЭ, недостатками которых, в одних случаях, можно считать слишком быстро протекающие процессы гемолиза (разрушение эритроцитов), что не позволяет фиксировать момент разрыва мембраны, или, в других методах, слишком большое время выдержки (порядка 24 часов) в гемолизирующих растворах. Кроме
того, фиксирование момента гемолиза осуществляется визуально по изменению цвета суспензии.
В работе предложено использовать для исследования ДЭ в условиях гипоосмотического набухания метод лазерной днфрактометрии. Высокая пространственная когерентность и монохроматичность лазера как источника излучения позволяет с большой точностью проводить измерения радиуса эритроцитов. Регистрация характерного размера эритроцитов осуществляется по изменению линейного размера дифракционных колец.
Цель и задачи работы: Цель работы: разработка способа лазерной дифрактометрии ДЭ и рассмотрение возможности его использования для диагностики реологических расстройств; оценки эффективности терапии у больных ММ; апробация его в широкой клинической практике. Поставленные задачи:
1 Рассмотреть применимость метода лазерной дифрактометрии ДЭ в
процессе гипоосмотического набухания.
2. Провести математическое моделирование дифракции лазерного излучения на эхиноцитозных эритроцитах.
-
Разработать теоретическую модель набухания эритроцита в гипоосмотичсском растворе и создать методику измерения жесткости эритроцитарной мембраны.
-
Экспериментально исследовать методом лазерной дифрактометрии эритроциты доноров и больных с множественной миеломой и аденомой предстательной железы (АПЖ) в условиях гипоосмотического набухания.
Личный вклад автора: Все представленные экспериментальные исследования и теоретические расчеты проведены при личном участии автора.
Научная новизна работы: 1. Впервые метод лазерной дифрактометрии ДЭ использован в условиях гипоосмотического набухания совокупности эритроцитов
2 Предложен способ оценки жесткости эритроцитарной мембраны в
условиях гипоосмотического набухания.
-
Экспериментально впервые обнаружен прерывистый механизм набухания сферулированного эритроцита, названный нами «скачком», заключающийся в резком уменьшении диаметра сферулированного эритроцита, предложена модель протекания данного процесса, показана его связь с жесткостью мембраны.
-
Экспериментально подтверждено, что одной из причин ухудшения ДЭ при ММ является высокий уровень парапротеина в крови и показана необходимость использования у таких больных в качестве корригирующего метода лечебного плазмафереза.
Практическая ценность Рассмотрена возможность применения метода лазерной дифрактометрии для исследования эритроцитов крови, оценено влияние параметров лазерного излучения на точность измерения. Предложен и апробирован доступный клинической практике и достаточно информативный метод лазерной дифрактометрии для определения жесткости эритроцитарной мембраны. Применение этого метода у больных ММ уточняет диагностику гемореологических расстройств с блокадой микроциркуляторного русла и позволяет своевременно начать активную терапию. Применение лечебного плазмафереза в комплексной терапии больных ММ позволяет существенно улучшить ДЭ.
Положения и результаты, выносимые на защиту:
-
Метод лазерной дифрактометрии может быть применен для измерения среднего радиуса совокупности эритроцитов в условиях гипоосмотического набухания и построения гипотонической кривой.
-
Наличие эхиноцитоза - «шипиков» на поверхности эритроцита -не приводит к изменению положения минимумов ДК.
-
Предложена однопараметрическая модель набухания сферулированного эритроцита, где определяющим параметром является средняя жесткость эритроцитарной мембраны, и способ ее определения по гипотонической кривой.
-
Гипотоническая кривая сферулированного эритроцита имеет две особенности: пологий участок и нарушение монотонности -«скачок». Величина "скачка" и его местоположение зависят от жесткости эритроцитарной мембраны.
Апробация работы: Результаты работы обсуждались на семинарах кафедры КЭиБМО, ИТМО, СПб. Основное содержание диссертации докладывалось на VIII международной НТ конф. "Лазеры в науке, технике, медицине", Пушкинские Горы, 1997; Российской НП конф. Оптика - ФЦП "Интеграция", ИТМО, СПб 1999; конф. "Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения", ВМА, СПб, 1999; международной конф. молодых ученых и специалистов "Оптика-99", СПб, 1999, Российской НП конф. Оптика - ФЦП "Интеграция", ИТМО, СПб, 2000; Юбилейной НТ конф. профессорско-преподавательской состава ИТМО, СПб, 2000.
Структура и объем работы. Диссертация, отражающая основное содержание проделанной работы, состоит из введения, четырех глав, заключения, списка цитированной литературы и приложений с методикой оценки жесткости эритроцитарной мембраны и экспериментального материала. Изложена на /^/машинописных страницах, включая ^Урисунков, _^ таблиц и список литературы, содержащий /^наименований.
Моделирование формы эритроцита
Эритроцит представляет собой наиболее изученный в настоящее время объект крови, который, однако, по-прежнему остается предметом пристального внимания исследователей. Уделяется большое внимание морфологическим особенностям эритроцитов, их различию в норме и при патологии. Эритроцит как физический объект обладает механическими и оптическими свойствами; имеет спектр собственных пространственных колебаний; способен изменять идентифицируется с гемоглобином. Наружная мембрана эритроцита выражена слабо в виде плотной полоски на периферии клетки толщиной, по разным данным, от 7-Ю до 20 нм [1-8]. При циркуляции крови
Фотография дискоцита и его поперечное сечение [5] эритроциты, соударяясь друг с другом и со стенками сосудов, принимают самые разнообразные формы. В отсутствие же внешних воздействий равновесной оказывается форма двояковогнутого диска ("дискоцит"), при которой площадь поверхности на 20% больше, чем сферическая, минимальная для данного объема (рис. 1).
Эритроциты здоровых людей имеют объем V» 90 мкм , площадь поверхности S» 160 мкм2, диаметр дискоцита « 6,5 -9 мкм (средний диаметр на высушенных препаратах 7,55 мкм с колебаниями от 7,16 до 7,98 мкм), глубина центральной впадины «1 мкм, максимальная толщина по краю « 2,4 мкм [1-8]. При анемиях в крови могут одновременно появляться эритроциты как больших, так и малых размеров. Эритроциты с диаметром менее 6,5 мкм называют микроцитами, а с диаметром более 9 мкм - макроцитами. Одновременное появление в крови эритроцитов разных размеров носит название анизоцитоза 1-9]. Если эритроциты отделить от плазмы, то в зависимости от среды, в которую они переводятся, клетки способны принимать различные равновесные формы. Общеизвестное представление о типичной форме возникает в результате наблюдений за клетками крови под микроскопом, когда они не находятся в типичном для них окружении [4-6,10-14].
Классификация эритроцитов по архитектонике [5] архитектонике [6,10-13]. Общим для всех классификаций является то, что более 90% из них имеют форму диска. На рис. 2 приведена классификация, в которой эритроциты в зависимости от их поверхностной архитектоники делятся на следующие типы (Табл. 2):
Преобразование микроэластометрических свойств эритроцитов до и после трансформации дискоцита может быть вызвано различными агентами (рис. 3). После инкубации эритроцитов в условиях, приводящих к снижению концентрации АТФ в клетках, наблюдается появление на них "шипов" в виде "тупых" конусов (кренирование клеток) и происходит общая трансформация формы из диска в сферу. Обычно на поверхности эритроцита образуются 20-30 распределенных случайным образом шипов, имеющих близкие между собой размеры. Кренированные эритроциты называют эхиноцитами. Таблица 2.
После длительного выдерживания эритроцитов в афизиологических условиях происходит постепенная трансформация их формы от кренированной или кап- формы к сферической. Сфероциты - такое состояние клеток, которое через короткий промежуток времени приводит к гемолизу. При некоторых заболеваниях эритроциты принимают патологические формы [5,11,12]. По-видимому, в норме наиболее важную роль в механизме трансформаций эритроцита играют ионы кальция [15-19].
За механические свойства эритроцита (его форма и деформируемость) отвечает его клеточная оболочка (наружная мембрана), отделяющая внутриклеточную жидкость от внешней среды [7,20-25]. По своему строению клеточная мембрана двояковогнутого эритроцита на всем протяжении одинакова. Впадины и выпуклости могут возникать и занимать различные участки мембраны. Проведенные исследования говорят о том, что на форму эритроцита влияют как внешние, так и внутренние факторы и, прежде всего, взаимосвязь между мембраной и состоянием гемоглобина [26,27] (деоксигенированный, полимеризованный, денатурированный), что не исключает действия вторичных факторов.
Основой мембраны эритроцита служит цитоскелет [20] - прочная, эластичная белковая сеть, локализованная на внутренней поверхности липидного бислоя.
Биологическим мембранам принадлежит ключевая роль в обеспечении и регуляции физиологической активности клеток. Отделяя цитоплазму от внешней среды и осуществляя транспорт веществ, мембраны активно участвуют в создании и поддержании клеточного гомеостаза. Мембраны являются местом локализации важнейших полифункциональных комплексов, которые, находясь на границе раздела фаз, обладают удивительной согласованностью и быстротой действия. Определяющую роль играют мембраны в процессах обмена клеток информацией с внешней средой [21].
В мембранах существуют каналы, по которым происходит транспорт малых ионов и молекул. Вероятно, эти каналы образуются вблизи молекул белков [16,19,28].
Температура является неотъемлемым фактором внешней среды, постоянно действующим на клеточные мембраны и оказывающим огромное влияние на происходящие в них физико-химические процессы [25,29,30].
Основными показателями реологии крови являются агрегация, вязкость и деформируемость эритроцитов (ДЭ). Важную роль в процессах переноса кровью кислорода и углекислого газа между легкими и тканями играет высокая ДЭ, которая характеризует способность этих клеток изменять свою форму под действием внешних сил.
Изменение радиуса эритроцита в гипоосмотических растворах
Рассмотрим теоретическую модель поведения эритроцита при воздействии растворов различной осмолярности (то есть при различной концентрации соли NaCl).
При циркуляции крови эритроциты принимают самые разнообразные формы, соударяясь друг с другом и со стенками сосудов. В отсутствие же внешних механических воздействий в изотоническом растворе (при нормальной для организма концентрации NaCl в 0,85 %) равновесной оказывается форма двояковогнутого диска, то есть эритроциты являются дискоцитами. При набухании из ненапряженного двояковогнутого дискоцита в сферу области клеточной мембраны подвергаются очень малым деформациям растяжения, но большим изменениям кривизны поверхности. Центральные участки диска эритроцита деформируются в полярные области сферы при очень малом растяжении мембраны. Большие растяжения происходят главным образом на периферических участках в экваториальной области двояковогнутого диска.
При изменении осмолярности раствора трансформация эритроцита происходит следующим образом: 1. При увеличении осмолярности (гипертонический раствор) происходит сморщивание эритроцита. 2. При уменьшении осмолярности (гипотонический раствор) увеличение объема эритроцита за счет поступления внутрь него воды происходит в два этапа: площадь сферической поверхности мембраны эритроцита увеличивается за счет набухания клетки вплоть до момента гемолиза (разрыва мембраны эритроцита). Рассмотрим поведение эритроцита при гипоосмотическом набухании. Для математического представления выберем моделирование эритроцита семейством овалов Кассини, описанное в 2.1. Это уравнение в полярных координатах имеет вид: р{ р)= (?cos(2 p)+-jc4(cos (2 p)f +(а4 -с4), где с, а - параметры, соотношением которых определяется радиус и толщина фигуры, описываемой кривой. В первой фазе внутреннее давление в клетке мало, и без большой погрешности можно считать, что осмолярность внутри и снаружи эритроцита одна и та же. С учетом этого при создании гипоосмотических условий путем введения в изотоничную среду дистиллированной воды объемом AVo должно выполняться следующее соотношение: АУЭ _ АУ0 V3 " V0 где V3 - исходный объем эритроцита в изотонических средах, V0 - исходный объем изотонической среды, AV3, AVo - соответственно приращения объемов самого эритроцита и внешней среды. Т.о. получается, что относительное изменение объема эритроцита в точности соответствует общему относительному изменению объема суспензии при внесении в нее дистиллированной воды. Без большой погрешности то же самое можно относится и к случаю, когда в суспензии много эритроцитов. При каком-то определенном значении объема дистиллированной воды, введенной в суспензию, эритроцит приобретает сферическую форму. По литературным данным [1-3,5,6,8,9] диаметр эритроцита имеет различные значения, но средний лежит в пределах 7,5-г7,9 мкм. Поэтому при построении теоретической модели поведения эритроцита в гипоосмотическом растворе, в качестве средней величины взяли значение диаметра 7,7 мкм. Объем тела вращения, сечение которого известно: сечения овалом Кассини получим первоначальные: объем V3= 71,1 мкм" и площадь поверхности S3=142,5 мкм . Эти значения не сильно отличаются от известных в литературе [1-3,5,6,8,9], что можно считать достоверным в силу большой погрешности ранее определенных экспериментально геометрических параметров эритроцитов. Если эти значения примем за исходные, то для момента, когда эритроцит примет сферическую форму:
При проведении аналогичных расчетов для радиусов дискоцитов 7,5 мкм и 7,9 мкм получим, соответственно, следующие значения: 1) 1 =3,20 мкм, Усф=137,8 мкм3, RCJ/ROFO ; 2) Rc4 =3,51 мкм, Усф=181,8 мкм3, R /R0=0,89.
Для определения точки сферуляции эритроцита на теоретической кривой, описывающей поведение эритроцита в гипоосмотическом растворе, необходимо приравнять относительное изменение объема эритроцита к относительному изменению объема суспензии, и получили точку сферуляции на уровне осмолярности в 0,69-0,66-0,64% NaCl соответственно для трех первоначальных радиусов.
Видно, что когда для кривых задана определенная вариация первоначального радиуса эритроцита, соответственно, присутствует и разброс точек сферуляции и радиусов сферулированных эритроцитов. Расчет показывает, что для заданной вариации в (±2,7%) радиуса эритроцита от 3,85 мкм точка сферуляции располагается на уровне осмолярности (Ч),66 ± 0,03j% NaCl (разброс составляет ±3%), радиус эритроцита в момент сферуляции Д37 ± 0,17j мкм (вариация размера возросла до ±5%) и относительный радиус на уровне 0,3% - (5,0 ±0,2) (вариация уменьшилась примерно до ±4% при допущении абсолютно растяжимой мембраны, то есть что эритроцит пропускает вовнутрь через мембрану всю поступившую в раствор воду) для нормального радиуса 3,85 мкм. Таким образом, можно сказать, что первоначальная вариация радиуса эритроцита в 2,7% приводит к разбросу от средних значений, для осмолярности в точке сферуляции в 3%, что можно считать существенным при условии, что погрешность приготовления гипоосмотических растворов составляет (0,5ч-3)%; для радиуса же эритроцита в момент сферуляции разброс составляет почти 5% (то есть увеличивается по сравнению с первоначальным почти в 2 раза).
Кроме того, на дисперсность в точке сферуляции оказывает влияние и различная первоначальная толщина эритроцита. По литературным данным [1-3,5,6,8,9] толщина эритроцита в центре составляет 1ч-1,4 мкм. Поэтому при одинаковом первоначальном радиусе и различной толщине, момент сферуляции наступит не одновременно для всех частиц первоначально равного радиуса и, соответственно, и радиусы сферулированных эритроцитов приобретают дополнительную дисперсность. Получается, что при радиусе дискоцита 3,85 мкм и толщине по центру (0,8-й,2) мкм, относительный радиус в момент сферуляции изменяется в пределах (0,89 -0,87), а концентрация соли на момент сферуляции составляет (0,64ч-0,66)% NaCl.
Расчет погрешности приготовления растворов
Для проведения исследований крови необходимо осуществить ее стабилизацию, то есть предотвратить свертывание, которое в нормальных условиях наступает через 3-6 минут. Венозная кровь стабилизируется 3,8% раствором основного цитрата натрия в соотношении 9:1. Для предотвращения влияния плазмы при исследовании красных клеток крови следует отделить их от плазмы и лейкоцитарной пленки центрифугированием.
Кровь брали из локтевой вены человека с помощью инъекционной иглы в сухую центрифужную пробирку, при этом первые капли крови в момент ее взятия оставляли на тампоне для предотвращения попадания в пробирку тканевого тромбопластина, выделяющегося в момент прокола. В пробирки добавлялось 0,2 мл основного цитрата натрия для предотвращения свертывания крови.
Для исключения влияния на эритроциты веществ, находящихся в плазме, кровь подвергали центрифугированию. С целью наблюдения дифракционной картины (ДК) максимально хорошего качества провели сравнительный анализ дифракционных картин для суспензий эритроцитов, подвергнутых центрифугированию при 2000, 4000, 5000 и 6000 об/мин (что составляет, соответственно, 700,1000,1500 и 2500 g). Эксперимент показал, что при 2000 и 4000 об/мин не происходит необходимого сепарирования и дисперсность эритроцитов по размеру еще достаточно велика, что приводит к ухудшению качества ДК, а именно, к невозможности фиксировать радиус второго дифракционного минимума. При 6000 об/мин происходит ранний гемолиз эритроцитов примерно при концентрации NaCI в 0,5-0,55%, что также неприемлемо для наших исследований осмотической резистентности и измерений жесткости мембраны эритроцитов. Таким образом, сделан вывод как о наиболее подходящей скорости центрифугирования пробы крови для наших экспериментов - 5000 об/мин (1500 g).
Полученный осадок помещали в физиологический раствор с концентрацией NaCI порядка 0,85% и дважды центрифугировали при тех же условиях с целью лучшего отмывания клеток от плазмы крови [54].
Обычно при работе с отмытыми эритроцитами используется физиологический раствор с концентрацией NaCI порядка 0,85%, который создает осмотическое давление на клетку приблизительно равное тому, которое создает плазма крови (изотонический раствор). Na+ является основным осмотически активным ионом внеклеточного пространства. Концентрация ионов натрия в плазме крови приблизительно в 8 раз выше (132-150 моль/м3), чем в эритроцитах (17-20 моль/м3) [1-3]. Поэтому при уменьшении концентрации NaCI в растворе между ним и клеткой возникает градиент концентрации, и вода начинает проникать через мембрану внутрь эритроцита.
Растворы большинства чистых химических веществ имеют очень неустойчивый рН. Поэтому в тех случаях, когда надо работать в определенных интервалах рН, пользуются специальными буферными растворами, рН которых изменяется весьма несущественно. Кроме того, рН большинства буферных растворов очень мало изменяется при изменении температуры, что также немаловажно [52]. Известно, что изменение микроокружения эритроцитов (изменение ионного состава среды) влияет на форму и объем эритроцита [1-3]. Особое значение имеют фосфорные ионы как источник неорганического фосфора в процессах фосфорилирования белковых компонентов мембран. По данным работы [20] даже незначительное снижение уровня фосфорилирования мембран сопровождается изменениями формы клеток и их механических свойств. Поэтому для стабилизации мембран эритроцитов мы добавляли в гипоосмотические суспензионные среды Na2HP04 в сочетании с NaFkPC в конечной концентрации 0,01 М при рН=7,4 для более точных измерений зависимости размеров эритроцитов от осмотичности раствора.
Известно, что при прикреплении к стеклу эритроциты переходят в эхиноцитозное состояние (рис. 26), но при нанесении силиконового покрытия образования эхиноцитов не происходит.
Были проведены сравнительные измерения ДК при использовании стеклянных камер Горяева и камер с силиконовым покрытием, заметной разницы при измерении радиуса дифракционных колец обнаружено не было, что позволило пренебречь влиянием шипов (размер которых составляет порядка 0,1 от радиуса эритроцита [1]) на размер колец ДК.
При концентрации порядка 0,01-0,02 мл крови на 2 мл раствора эритроциты распределены по поверхности камеры слишком редко (рис. 27а), что приводит к наблюдению ДК слишком малой интенсивности. При концентрации свыше 0,04 мл происходит наложение эритроцитов друг на друга (рис. 276), что приведет к нарушению структуры ДК. При концентрации 0,03-0,04 мл эритроциты образуют достаточно равномерный монослой на поверхности камеры Горяева (рис. 27в), что приводит к образованию отличной ДК (четкие три дифракционных минимума) близкой к идеально круглой форме и достаточной интенсивности (рис. 28).
Эхиноцитоз при гипоосмотическом набухании
В экспериментальных условиях и при патологии эритроциты могут принимать различные обратимые или необратимые формы, в частности при некоторых условиях наблюдается эхиноцитоз эритроцитов (поверхность покрывается шипиками). «Спонтанно», то есть без специальных химических воздействий, прикрепившись к стеклу, через некоторое время дискоцит также превращается в частицу с шипиками на поверхности [1]. Силиконизация стеклянной поверхности или добавление специальных реактивов в суспензию эритроцитов препятствует возникновению эхиноцитоза. Но нельзя утверждать, что эти вещества не влияют на процесс гипоосмотического набухания эритроцитов, а для силиконизации камер Горяева требуется специальное оборудование.
В силу данных особенностей эритроцитов и учитывая реальные условия проведения экспериментальных исследований - помещение эритроцитов в камеру Горяева (изготовленную из стекла), представляет несомненный интерес учет влияния эхиноцитоза на распределение интенсивности в ДК.
Каждый эритроцит можно рассматривать как частицу сложной формы, состоящую из совокупности частиц разной формы и размеров. В этом случае в качестве модели эхиноцита можно рассматривать совокупность апертур: одна -с характерным размером тела эритроцита, другая - с размером и формой пшпиков. При большой совокупности частиц их размеры и координаты интегралом по плотности распределения размеров апертур.
В силу того, что выборка апертур велика и они статистически независимы, возможно проводить суммирование средних интенсивностей излучения, дифрагировавших на каждой из совокупностей. Такая модель позволяет записать выражение для интенсивности излучения, дифрагировавшего на экране с расположенными случайным образом двумя группами апертур как сумму дифракционных распределений интенсивности от каждой из групп (рис. 48). Тогда интенсивность дифрагировавшего лазерного излучения представляет собой сумму двух интегральных распределений от совокупностей апертур: Ъ = эр шип где 1эр - распределение интенсивности от совокупности круглых апертур с радиусом тела эритроцита, 1шип - от совокупности апертур, соответствующих «шипикам».
Поскольку характерный размер «шипиков» много меньше размера отверстия, пространственный период его дифракционной картины много больше пространственного периода ДК основного отверстия (рис. 48), что существенно с точки зрения формирования структуры ДК.
Эхиноцитозное состояние эритроцитов не является стабильным. В зависимости от степени осмотического набухания можно выделить две основные формы эхиноцитоза, которым соответствуют две модели. Первоначально в изотоническом растворе эритроцит представляет собой ненапряженную дискоидную частицу (зона I) и количество довольно крупных
Модель трансформации эхиноцита при гипоосмотическом набухании шипиков составляет порядка 20-30 штук [1,5,14], хотя может доходить и до 50, при этом их форма ближе к цилиндрической. В процессе набухания эритроцит превращается в сферу, шипики принимают более правильную круглую форму, и по мере набухания сферы (зона П-Ш) количество и размер шипиков уменьшаются. Кроме того, в момент «скачка» (зона IV), обнаруженного экспериментально, происходит выброс части содержимого эритроцита, он «съеживается», его форма становится неправильной и шипики снова увеличиваются в размере и становятся цилиндрическими. Затем эритроцит вновь принимает правильную сферическую форму, сферические шипики постепенно уменьшаются по мере дальнейшего набухания сферы (рис. 49)
При этом выражение для интенсивности дифрагировавшего излучения выглядит аналогично записанному ранее. В качестве геометрической модели эхиноцита дискоидной формы рассмотрим совокупность круглых апертур, представляющих эритроциты правильной дискоидной формы, шипики же имеют цилиндрическую форму. Теневое сечение каждого такого шипа представим в виде прямоугольника (рис. 52). отсутствуют. Рассмотрим ход «лучей» ДК от совокупности таких отверстий (рис. 53). В силу большого количества и хаотической ориентации каждого прямоугольного отверстия, а также условий проведения эксперимента - сканирования ДК в центральной части в определенном направлении - ориентируем отверстия в экране параллельно друг другу и будем считать, что координаты центров отверстий и их поперечные размеры являются реализацией вероятностного процесса. Такая модель позволяет перейти от двумерной задачи к одномерной с последующим суммированием дифракционных распределений интенсивности. Распределение интенсивности при дифракции на одинарной щели шириной D\ в зоне Фраунгофера описывается [80]:
Так как выборка щелей велика, то суммирование Фурье-спектров щелей аналогично можно заменить интегралом по плотности распределения совокупности размеров щелей, введя функцию плотности G I(DI) нормального распределения. стандартное или среднеквадратическое отклонение, D\ - центр распределения размеров щелей. Аналогично можно провести преобразование для щелевидных апертур средним размером Di и тогда общая функция распределения по размерам выражается суммой двух распределений (рис. 54):
