Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 8
1 1. Биосинтез пуриновых нуклеотидов 8
1.2 SAICAR-синтаза Saccharomyces cerevisiae 12
1 2 1 Биохимические свойства фермента SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae . 14
1 2 2 Пространственная структура SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae 15
1 2 3 Сравнение структуры SAICAR-синтазы с другими АТР- зависимыми ферментами цикла биосинтеза пуриновых нуклеотидов 19
Глава 2 Рентгеноструктурное исследование комплексов SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae 24
2.1 Получение и очистка фермента 24
2 2 Исследование комплекса (SS+ASP) 24
2 2 1. Получение кристаллов 24
2.2.2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений 25
2.2 3 Определение и уточнение структуры комплекса (SS+ASP) 26
2 2 4 Анализ качества модели . 29
2 2 5 Структура комплекса (SS+ASP) . 29
2 3 Исследование комплексов с аденозинтрифосфатом, (SS+ATP)-I и (SS+ATPMI - 34
2 3 1 Получение кристаллов комплексов с аденозинтри фосфатом 34
2.3 2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений 35
2 3 3 Определение структуры комплексов с АТР . 35
2 3.4 Анализ качества моделей .37
2.3.5 Структуры комплексов (SS+ATP)-I и (SS+ATP)-II 39
2.4. Исследование комплекса с AICAR и янтарной кислотой (SS+AIC+SUC) 46
2.4.1. Получение кристаллов комплексов с A1CAR и янтарной кислотой 46
2.4.2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений 46
2.4 3 Определение структуры комплекса (SS+AIC+SUC) 47
2.4 4 Анализ качества модели 48
2 4 5 Структура комплекса (SS+AIC+SUC) 48
2.5. Исследование комплекса с аденозинтрифосфатом, AICAR и янтарной кислотой (SS+ADP+AIC+SUC) 56
2 5.1 Получение кристаллов комплекса (SS+ADP+AIC+SUC)... 56
2.5 2 Измерение интенсивностей дифракционных отражений,.,. 56
2 5 3 Определение структуры комплекса (SS+ADP+AIC+SUC) 57
2.5.4 Анализ качества модели 59
2.5.5. Структура комплекса (SS+ADP+AIC+SUC) 59
2.6. Исследование комплекса с SAICAR (SS+SAICAR) 78
2 6.1. Получение кристаллов комплексов с SAICAR 78
2.6 2 Измерение интенсивностей дифракционных отражений , 78
2 6 3. Определение структуры фермент-субстратного комплекса 79
2 6 4. Анализ качества модели 80
2 6 5. Структура комплекса (SS+ SAICAR). 80
Глава 3 Сравнение пространственной структуры SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae с пространственными структурами SAICAR-синтаз Thermatoga maritima и Е coli 86
3.1. Сравнение с SAICAR-синтазой Thermatoga maritima 87
3.2. Сравнение с SAICAR-синтазой co/i 91
Глава 4 Механизм каталитической реакции SAICAR-синтазы 99
4.1. Предлагаемые модели механизмы каталитической реакции SAICAR-синтазы 99
4 2. Каталитический механизм SAICAR-синтазы Saccharomyces serevisiae 104
Основные результаты и выводы 109
Благодарности. 111
Список цитируемой литературы 112
- Пространственная структура SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae
- Получение кристаллов комплексов с аденозинтри фосфатом
- Определение структуры фермент-субстратного комплекса
- Предлагаемые модели механизмы каталитической реакции SAICAR-синтазы
Введение к работе
Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды - важнейшие участники клеточного метаболизма как в низших, так и в высших живых организмах. Помимо того, что они являются мономерными единицами нуклеиновых кислот и играют ключевую роль в репликации ДНК и энергетическом обмене клетки, они также выполняют функции регуляторов, сигнальных молекул и кофакторов ферментов. В связи с этим изучение структуры и действия ферментов, участвующих в их биосинтезе, может быть использовано для создания антисептических и противоопухолевых лекарств на основе специфических ингибиторов пуринового биосинтеза de novo [1]-[9]. Синтез de novo пуриновых и пиримидиновых мононуклеотидов в клетках осуществляется в ходе цепочки превращений из низкомолекулярных азотистых предшественников и является в значительной степени инвариантным процессом для известных биологических организмов [10]. Цикл пуринового биосинтеза осуществляется за 10 ступеней в высших организмах и за 11 ступеней (включая дополнительную промежуточную ступень) в большинстве микроорганизмов [11], последовательно превращающих 5-фосфорибозил-1-пирофосфат в инозинмоно фосфат (IMP), который за два следующих шага преобразуется либо в аденозинмонофосфат (AMP), либо в гуанозинмонофосфат (GMP). Стремительное развитие в последние годы методов рентгеновской кристаллографии позволило значительно увеличить количество расшифрованных белковых структур. Однако, несмотря на то, что в настоящее время известны пространственные структуры всех ферментов, осуществляющих 11 этапов синтеза de novo IMP, пространственные структуры комплексов ферментов с лигандами (субстратами, ингибиторами или продуктами), дающие информацию, необходимую для понимания механизма их каталитического действия, определены только для пяти из них [12]. Более того, ни для одного из 6-ти ферментов этого цикла, использующих в качестве субстратов АТР,
мононуклеотид и малую молекулу, не исследован комплекс, содержащий все три субстрата одновременно, а также отсутствуют экспериментальные данные для определения положения малой молекулы. Данная работа, выполненная с использованием методов рентгеноструктурного анализа, восполняет эти пробелы в отношении SAICAR-синтазы, фермента, катализирующего восьмую ступень биосинтеза пуриновых нуклеотидов. В ней представлены пространственные структуры 6-ти комплексов SAICAR-синтазы с лигандами:
аспарагиновой кислотой (SS+ASP);
аденозинтрифосфатом (SS+ATP)-I и (SS+ATP)-IT;
аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой (SS+AIC+SUC);
аденозинтрифосфатом и аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой (SS+ADP+AIC+SUC);
продуктом реакции SAICAR (SS+SAICAR).
Два из представленных комплексов, тройной комплекс и комплекс с аспарагиновой кислотой, исследованы при разрешении lA. Высокое разрешение позволило не только впервые определить положение малой молекулы - аспарагиновой кислоты, но также получить наиболее полную информацию о структуре фермента, подвижности боковых групп и основной цепи аминокислотных остатков белка и, наконец, обнаружить конформационные изменения активного центра молекулы фермента, сопровождающие реакцию. Данные, полученные из структур комплексов, о расположении и характере связывания субстратов и продуктов в белковой молекуле, а также о конформационных изменениях ее активного центра позволили предложить механизм каталитической реакции SAICAR-синтазы и могут быть полезны для понимания каталитического механизма других ферментов, осуществляющих синтез амидной связи.
В связи с вышесказанным ОСНОВНЫМИ ПОЛОЖЕНИЯМИ, ВЫНОСИМЫМИ НА ЗАЩИТУ, являются:
Определенные методами рентгеноструктурного анализа пространственные структуры 6-ти комплексов фермента SAICAR-синтазы;
места и характер связывания субстратов в активном центре фремента;
конформационные изменения молекулы SAICAR-синтазы при связывании субстратов;
предполагаемый механизм каталитического действия SAICAR-синтазы.
Пространственная структура SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae
Выделение фермента SAICAR-синтазы и исследование ее биохимических свойств было проведено в Биологическом институте Санкт-Петербургского Университета, откуда были получены исходные препараты, позволившие провести данные структурные исследования. Мясников и сотр. установили, что фермент состоит из одной полипептидной цепи, включающей 306 аминокислотных остатков, последовательность которых была определена по нуклеотидной последовательности гена ADE1 [24] Расчетная молекулярная масса SAICAR-синтазы составляет 35.5 кДа. Аленин и сотр. определили оптимальные условия функционирования фермента. Максимальная ферментативная активность SAICAR-синтазы достигается при значении рН 8.0 и концентрации хлорида магния 5 мМ. Однако ионы магния в концентрации выше 30 мМ ингибируют реакцию. Были установлены величины констант Михаэлиса для трех субстратов реакции: CAIR - 1.6 мкМ, АТР - 14 мкМ и аспарагиновой кислоты - 960 мкМ [19]. Проведенный анализ субстратной специфичности SAICAR-синтазы в отношении некоторых природных аналогов субстратов, а также набора аналогов CAIR с модификациями в недостроенном адениновом основании, рибозном кольце и фосфатной группе, выявил важность для реакции наличия отрицательно заряженных групп субстратов [25], [22]. Установлено, что природные аналоги CAIR, промежуточные продукты пуринового метаболизма 5 -фосфорибозил-5-амино-4-имидазол (AIR) и 5 -фосфорибозил-5-амино-4-имидазолкарбоксамид (AICAR) являются слабыми ингибиторами фермента, тогда как конечные продукты пуринового метаболизма, AMP и IMP, не влияют на скорость каталитической реакции дрожжевой SAICAR-синтазы. GTP и 2 -dATP проявляют функции субстрата, а СТР и UTP - ингибитора реакции по отношению к АТР [19]. Аналоги L-аспарагиновой кислоты, L-малат, фто роаспартат и L-аланозин, природный противоопухолевый агент [1], [26], (рис. 26) могут служить субстратами дрожжевой SAICAR-синтазы [22].
Пространственная структура саоехдаой SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae была определена в лаборатории белковой кристаллографии ИК РАН с разрешением 1.9 A (PDB, 1а48), [27], [28],[29]. Было установлено, что молекула SAICAR-синтазы имеет глобулярную форму с общими размерами 70 х 60 х 40 А3. Сворачиваясь в пространстве, полипептидная цепь образует три домена, обозначенные как А, В и С и выделенные разными цветами (Рис.4а). N-концевой домен А состоит из И1 остатков (Ser2 - Hisl 12), центральный домен В -из 143 остатков (Leul 13 -Gln255), С-концевой домен С содержит 51 остаток с Asp256 по His306. В центре молекулы имеется полость с размерами приблизительно 15 х 15 х 30 А3 (Рис.4б). В образовании этой полости участвуют остатки из всех трех доменов, в том числе большинство из эволюционно-консервативных остатков, выявленных сравнением аминокислотных последовательностей известных SAICAR-синтаз из различных организмов [30]. Эта полость, как подтвердило изучение комплексов SAICAR-синтазы с субстратами и их аналогами, является активным центром фермента. В нативной структуре SAICAR-синтазы в ней были найдены два сульфат-иона (SA и SB на рис. 4а), каждый из которых характеризуется независимой системой водородных связей с ферментом. SA расположен возле фосфат-связывающей петли в позиции р1-фосфата АТР, что подтвердили данные комплекса с АТР (структура не была завершена после предварительного уточнения, SB предположительно занимает место фосфатной группы CAIR [29]). А и В домены можно отнести (а + Р)-типу. В центре обоих доменов расположены 5-цепочечные антипараллельные Р-слои. Для этих -структур наблюдается правостороннее скручивание при взгляде вдоль хода цепи. Одной из своих сторон р-слои выходят в междоменную полость, другая сторона экранируется от внешнего раствора а-спиралями. Основу домена С составляют две а-спирали, тесно контактирующие между собой и примыкающие к спирали ссА1 из домена А. Всего молекула SAICAR-синтазы содержит 9 спиральных участков, 4 р-складчатых листа и 8 Р-поворотов (табл. 1, рис.За). В спиральных сегментах и Р-складчатых листах содержится 218 аминокислотных остатков, что составляет 71% от всей полипептидной цепи. Все спирали SAICAR-синтазы, за исключением аВ2, имеют области, образующие водородные связи, характерные для спиралей 3 ю- Молекула содержит один р-поворот типа I (237-240), который образует петлю в середине Р-слоя В7, фактически разделяя этот слой на два, рВ7 и рВ7\ Три р-поворотатипаГ(8-11, 41-44, 139-142) входят или находятся близко к р-слоям. Было найдено также 4 р-поворота типа II (50-53, 80-83, 149-152, 272-275). Два из них соединяют слои и спирали в домене А, один формирует петлю между двумя слоями в домене В, и один связывает две спирали в домене С. Два тс-поворота (206-211, 267-272) расположены в конце спиралей аВЗ и аС1.
Получение кристаллов комплексов с аденозинтри фосфатом
Предварительное исследование АТР-связывающего места в активном центре фермента было сделано ранее вместе с определением пространственной структуры нативной SAICAR-синтазы [29]. Однако, несмотря на добавление при кристаллизации ионов магния, образующего связи с АТР, обнаружить их в активном центре молекулы белка тогда не удалось. В настоящей работе были исследованы два комплекса SAICAR-синтазы с АТР, называемые ниже (SS+ATP)-I и (SS+ATP)-II, различные как способом получения, так и содержанием магния с целью изучить установленную биохимическим путем зависимость активности фермента от концентрации магния в растворе. Согласно биохимическим данным присутствие ионов магния необходимо для протекания ферментативной реакции, однако, их концентрация в растворе больше 30 мМ ингибирует реакцию [19].
Кристаллы комплекса (SS+ATP)-I получены сокристаллизацией при комнатной температуре методом диффузии паров в висячей капле. Капли содержали белок в концентрации 24 мг/мл, 1М сульфат аммония, 0.04 мМ аспарагиновую кислоту, 0.05 М АТР, 0.01М MgCl2 и 0.05М Tris-HCl буфер, рН 7.5. Осаждающий раствор состоял из 2.25М сульфата аммония, 0,04 М аспарагиновой кислоты, 0,04 М АТР и 0,01 М MgCl2 в 0,05 М Tris-HCl буфере, рН 7.5.
Кристаллы комплекса (SS+ATP)-II получены настаиванием кристаллов нативной SAICAR-синтазы в растворе, содержащем 2.25М сульфата аммония, С АТР, 0,04 М аспарагиновой кислоты, 0.04 М MgCIj и 0.05 М Tris-HCl буфера, рН 7.5. Хотя при кристаллизации было добавлено 0.04 М AICAR (5 фосфорибозил-5-амино-4-имидазолкарбоксамида, аналога природного субстрата CAIR), его концентрация оказалась їіедостаточной для того, чтобы прочно связаться с молекулой белка, и на разностных синтезах Фурье его обнаружить не удалось. Полученные кристаллы комплексов имели размеры 0.5 - 1.0 мм и принадлежали к пр. гр. Р2і2[2]. Размеры их элементарных ячеек приведены в табл.5. Интенсивности рентгеновских дифракционных отражений от кристаллов фермент-субстратных комплексов были измерены на синхротроне DESY (накопительное кольцо DORIS, 4.5 ГэВ, станции ХЗ1 и XII, EMBL, Гамбург) с использованием детектора "Imaging Plate". Дифракционные данные от кристаллов (SS+ATP)-I были получены при комнатной температуре до разрешения 2.05 А, а от кристаллов (SS+ATP)-II -при 100К до разрешения 1.4 А. Раствор, в котором выдерживали кристаллы перед низкотемпературной съемкой, содержал 30 % (от насыщения) глюкозы, 2.5 М сульфата аммония, 0.04М аспарагиновой кислоты, 0.01 М MgCb и 0.05 М Tris-HCl буфера, рН 7.5. Обработка экспериментальных данных была выполнена с помощью программ DENZO/SCALEPACK [4]. Статистические характеристики экспериментальных данных представлены в табл. 5.
Кристаллы (SS+ATP)-! имеют ту же пр. гр. Р2і2]2ь что и кристаллы с&оєонюго фермента, однако параметры элементарной ячейки кристаллов комплекса (а=69.8, Ь=74.2, с=76.0 А) существенно отличаются от параметров кристалловсвобсзного фермента (а=62.4, Ь=63.4, с=81.2 А), поэтому структура этого комплекса была решена методом молекулярного замещения с использованием программы MOLREP [59]. Для расчета функций вращения и трансляции была использована модель СВОБОДНОГО фермента и дифракционные данные в интервале разрешения от 8.0 до 4.0 А. После уточнения модели как жесткого тела значения R-фактора и коэффициента корреляции были равны 34.2% и 69.1% соответственно при разрешении до 3 А.
Параметры элементарной ячейки (SS+ATP)-II мало отличаются от параметров нативных кристаллов SAICAR-синтазы, поскольку кристаллы были получены методом вымачивания (табл. 5). Поэтому в качестве стартовой модели для уточнения этого комплекса была использована модель нативного фермента с разрешением 1.9 А [29]
Атомные модели комплексов были уточнены MFJK с использованием программ PROLSQ [60] и REFMAC [51] совместно с автоматизированным процессом модификации структуры растворителя, осуществляемым с помощью программы ARP/wARP [52]. Для построения и корректировки атомной модели молекулы фермента были использованы графические программы FRODO [61] и О [53]. Корректировка основывалась на анализе разностных синтезов Фурье с коэффициентами и фазами структурных факторов (3F0-2FCi фс), (2F0-FC, фс) и (F0-FCj фс), где F0} Fc - экспериментальные и рассчитанные модули структурных факторов, фс.- фазы структурных факторов, рассчитанные по атомной модели. Омит-синтезы рассчитывали с коэффициентами (F0-FCj фс), но вклад атомов АТР в Fc и фс не учитывали.
Координаты атомов молекул АТР, связанных с ферментом, были определены по разностным синтезам электронной плотности после первых циклов уточнения и затем были включены в уточнение вместе с атомами белка. Также был вписан в электронную плотность и включен в уточнение ацетилированный N-концевой остаток Ser. Параметры элементарных ячеек и статистические характеристики экспериментальных данных и уточненных моделей фермент-субстратных комплексов SAICAR-синтазы с АТР приведены в табл. 5.
Определение структуры фермент-субстратного комплекса
В этом разделе результатов исследования структуры и механизма каталитической реакции SAICAR-синтазы мы предлагаем структуру комплекса фермента с продуктом его ферментативной реакции 5 -фосфорибозил-4-(г -сукцинокарбоксамид)-5 аминоимидазолом (SAICAR). Продукт SAICAR был синтезирован и любезно предоставлен др. В.Д. Домкиным из Биологического института Санкт Петербургского Университета. Кристаллы комплекса были приготовлены вымачиванием кристаллов нативной SAICAR-синтазы в течение двух дней в растворе, содержащем 0.1 М SAICAR, 2.26М сульфат аммония, 0.01М MgCl2 и 0.05 М Tris-HCl буфер, рН 7.5. Необходимо уточнить, что в действительности «нативные» кристаллы фермента содержали аспарагиновую кислоту, добавленную при кристаллизации в концентрации 0.04 М. Кристаллы принадлежали к пространственной группе симметрии P2i2]2] с одной молекулой в независимой части элементарной ячейки и содержанием растворителя около 45 %. Интенсивности дифракционных отражений от кристаллов исследуемого комплекса были измерены с помощью синхротронного излучения в Европейской лаборатории молекулярной биологии (г. Гамбург) на накопительном кольце DORIS (4.5 ГэВ) с использованием детектора Imaging Plate, Измерения проводили при комнатной температуре. Для обработки дифракционных данных были использованы программы DENZO/SCALEPACK [50]. Размеры элементарной ячейки кристаллов и статистические характеристики экспериментальных данных приведены в табл. 13.
Кристаллы комплекса фермента с SAICAR оказались изоморфными кристаллам нативного фермента, поэтому в качестве стартовой модели для уточнения его пространственной структуры были использованы координаты атомов нативной SAICAR-синтазы, определенные при разрешении 1.9 А [29]. Уточнение осуществлялось программой REFMAC [51], и на начальном этапе проводилось без учета вклада в структуру атомов продукта SAICAR. Их координаты были определены по разностному синтезу электронной плотности, рассчитанному без участия лиганда (омит-синтезу) с коэффициентами (Fo - Fc, фс), где Fo, Fc - экспериментальные и рассчитанные модули структурных амплитуд, фс - фазы структурных амплитуд, рассчитанные по атомной модели. Полученные координаты SAICAR были включены в последующие циклы уточнения с полной или частичной заселенностью. Молекулы растворителя включались в модель постепенно с помощью программы ARP/wARP [52], осуществляющей автоматизированную модификацию структуры растворителя, а также вручную. Для вычисления Rfree фактора использовалось пять процентов рефлексов. Циклы автоматизированного уточнения координат чередовались с корректировкой модели на графической станции с помощью программы О [53] в соответствии с разностными синтезами электронной плотности, рассчитанными с коэффициентами (2Fo - Fc, фс) и (Fo-Fc, фс).
Структура комплекса (SS+SAICAR) была уточнена до R t = 17.3% HF23.8% при разрешении 2.0 А. Большую разницу между R и Rfree можно объяснить тем, что на таком разрешении невозможно распознать альтернативные положения некоторых остатков, обладающих большой подвижностью, как это было выявлено по экспериментальным данным других комплексов SAICAR-синтазы, собранным на более высоком разрешении.
Уточненная модель состоит из 288 аминокислотных остатков, молекул воды, одной молекулы SAICAR, двух сульфат-ионов, двух молекул аспарагиновой кислоты (места А" и А "). В электронной плотности не определены остатки 164-170 и 306. Боковые цепи семи остатков имеют альтернативные конформации. На карте Рамачандрана 91.7% всех остатков попадают в наиболее предпочтительные области, 6.8% - в дополнительно разрешенные области, и 4 остатка, Glu52, Aspl04, Asn227 и Asp233 находятся на границе с условно разрешенной областью. Напряженное состояние Glu52 обусловлено его нахождением в начале а-спирали А1, Asp 104 расположен в конце а-спирали А4, Asp233 попадает между р слоями В7 и В7 , Asn227 принадлежит участку полипептидной цепи, имеющей в этом комплексе двойную конформацию. Статистические характеристики уточненной модели комплекса (SS+SAICAR) приведены в таблице 13.
По картам разностной электронной плотности мы определили, что место присоединения продукта SAICAR расположено в полости активного центра молекулы белка и занимает или, точнее, объединяет, места связывания AICAR (соответствующее расположению в белковой молекуле природного субстрата CAIR) в комплексе (SS+AIC+SUC) и аспарагиновой кислоты в (SS+ASP) (рис.25). При этом фосфатная группа и рибозное кольцо молекулы SAICAR находятся в том же положении, что и у молекулы AICAR, а сукцинатподобная часть молекулы SAICAR располагается в месте связывания аспарагиновой кислоты. Недостроенное пуриновое основание для AICAR было слабо определено в электронной плотности в (SS+AIC+SUC), и поэтому его положение установить не удалось. В данном комплексе большинство атомов молекулы SAICAR, за исключением атома азота N6, хорошо определены в электронной плотности (Рис. 26). Связи, образованные аминокислотными остатками с молекулой SAICAR, соответствуют связям с AICAR и аспарагиновой (как и янтарной) кислотой в описанных ранее комплексах. Атомы кислорода фосфатной группы SAICAR формируют водородные связи с Argl22, Serl28 и Arg242, рибозное кольцо связано с Asp215, а карбоксильные группы SAICAR - с Ser40, Tyr42, Asp43 и Arg264. Недостроенное пуриновое основание образует контакт с Asp239 (Рис. 26 и табл. 14). Очевидно, что аминокислотные остатки, обеспечивающие связывание субстратов в белковой молекуле, их правильную ориентацию и распределение зарядов, отвечают и за связывание продукта реакции. Как видно из таблицы 14, большинство этих остатков строго консервативно среди известных SAICAR-синтаз.
При анализе карт разностных синтезов Фурье были обнаружены две дополнительные молекулы аспарагиновой кислоты, расположенные так же, как в комплексе (SS+ASP), что естественно, учитывая условия получения комплекса (SS+SAICAR). Поскольку их связывание, как мы полагаем, явилось следствием высокой концентрации аспарагиновой кислоты при кристаллизации и не обусловлено участием консервативных аминокислотных остатков белка, мы ограничили их обсуждение схематичным обозначением на рисунке 25.
Предлагаемые модели механизмы каталитической реакции SAICAR-синтазы
Несмотря на то, что в тройном комплексе, где мы надеялись увидеть все три субстрата одновременно, мы увидели ADP вместо АТР в активном центре и не обнаружили соответствующей плотности в аспартат-связывающем месте, совокупные данные по всем исследованным комплексам, а также моделирование позволили нам воссоздать полную картину взаимного расположения и взаимодействия субстратов во время реакции. На рисунке 35 показано взаимное расположение молекул ADP и AICAR в активном центре в комплексе (SS+ADP+AiC+SUC) вместе с моделированным положением молекулы аспарагиновой кислоты. Положение ASP получено наложением с помощью программы LSQKAB [60] координат аспарагиновой кислоты и 20-ти остатков, испытывающих наибольшее смещение при изменении конформации молекулы белка (39-45 и 260-271) из комплекса (SS+ASP) на соответствующие остатки в комплексе (SS+ADP+AIC+S UC). Также показано возможное положение у-фосфатной группы АТР, взятое из комплекса (SS+ATP)-IL В результате моделирования становится очевидно, что расстояние между атомом фосфора у-фосфатной группы АТР и карбоксильным атомом кислорода CAIR, как и расстояние между атомом С6 AICAR и аминогруппой аспарагиновой кислоты могут составлять около 3.5 А.
На основании выводов, сделанных в соответствии с анализом рентгенеструктурных данных, о местах и характере присоединения субстратов к белковой молекуле, о конформационных изменениях, претерпеваемых молекулой фермента во время реакции, а также проанализировав приведенные выше схемы возможных механизмов, мы предлагаем свою модель каталитического действия фермента S AICAR-синтазы, включающую как необходимое условие конформационные изменения активного центра.
Присоединение субстратов начинается в «открытой» конформации белковой молекулы, как в комплексе (SS+ASP), где ASP связан с остатками 40-43 из аспартат-связывающей петли и Arg264. Связывание АТР и CAIR приводит молекулу белка в «закрытую» форму, как в комплексе (SS+ADP+AIC+SUC), где Arg264 сдвигается на 5.8 А, чтобы образовать водородную связь с атомом 02 гидроксильной группы рибозного кольца AICAR, в то же время сохраняя связи сй-карбоксильной группой аспарагиновой кислоты. Новое положение Arg264 фиксировано образующейся системой водородных связей, включающей Arg264, Gln261 и Arg242. Lysl9 NZ, сохраняя контакт с АТР, одновременно может формировать водородную связь с А - карбоксильной группой аспарагиновой кислоты. Чтобы обеспечить эти новые взаимодействия, домен С (две С-концевые а-спирали) и аспартат-связывающая петля из домена А (остатки 39-45) испытывают сдвиг как жесткое тело по отношению к домену В и остальной части домена А, практически не изменяющих своих позиций. Водородная связь Ser40 О - Lys260 NZ способствует этому движению. В результате активный центр, находящийся между доменами, становится значительно уже. Более того, в «закрытой» конформации водородная связь His 170 ND1 - Asp43 ODl может фиксировать «невидимую» петлю, которая защищает активный центр во время реакции. Взимодействие карбоксильных групп аспарагиновой кислоты с Ser40, атомами основной цепи остатков 41-43 и гуанидиновой группой Arg264 может уменьшать отрицательный электростатический потенциал карбоксильных групп и способствовать депротонированию аминогруппы аспарагиновой кислоты. Положительно заряженный атом фосфора у-фосфатной группы АТР вступает в электроф ильное взаимодействие с одним из кислородных атомов карбоксильной группы CAIR, усиливая положительный заряд на ее атоме углерода, который в то же время подвергается нуклеофильной атаке со стороны аминогруппы аспарагиновой кислоты. В ходе реакции связь С-О разрывается, и образуется связь С-N. Одновременно происходит расщепление АТР на ADP и неорганический фосфат (рис. 36). Отрицательно заряженная у-фосфатная группа АТР способна акцептировать протон аминогруппы аспарагиновой кислоты как уходящая группа в реакции. После каталитической реакции молекула фермента снова возвращается к «открытой» форме со связанным продуктом, как было обнаружено в комплексе (SS+SAICAR).
