Введение к работе
Направления и актуальность исследований
Для решения современных задач диагностики наноструктур требуется адаптация к этим задачам традиционных методов и оборудования, а также развитие новых подходов для анализа свойств и процессов, присущих объектам нанометровой геометрии и системам пониженной размерности (до масштабов 1А). Диссертация посвящена исследованию структуры и морфологии наноразмерных кристаллов и композитов, созданных на их основе, методами количественной электронной микроскопии, которые включали обработку и моделирование электронно-микроскопических изображений высокого разрешения, картин электронной, а также картин рентгеновской дифракции.
Электронная микроскопия высокого разрешения (ВРЭМ) исторически явилась первым методом, реально обеспечившим визуализацию структуры объектов с атомным разрешением, а во многих случаях является единственным источником получения информации о внутренней структуре и структуре границ раздела нанообъектов.
Неоспоримым преимуществом электронной микроскопии является возможность получения количественной информации как в обратном (электронная дифракция), так и в прямом пространстве (электронно-микроскопические изображения с высоким разрешением) и исследования локальной структуры в нанообластях вплоть до атомного уровня.
Среди научных публикаций широко представлены работы по теоретическому обеспечению применения преобразования Фурье для получения кристаллографической информации из экспериментальных изображений [1-3]. Методики, основанные на локализации максимального контраста и связанного с ним положения атомных колонок, применялись для установления изменений в параметрах решёток в многослоевых системах, полупроводниках, выявление искажений структуры и дефектов, и др. Преобразование Фурье ВРЭМ-изображений (дифрактограммы) достаточно точно отражает геометрию структуры. В современных просвечивающих электронных микроскопах низкое значение коэффициента сферической аберрации объективных линз обеспечивает однородную передаточную функцию вблизи брегговского пучка, что позволяет проводить измерения с большой точностью и надежностью. С этих позиций применение дифрактограмм для фазовой идентификации нанокристаллов является очень перспективным.
Особое внимание в настоящей работе уделялось установлению пределов неопределенности при идентификации нанофаз, имеющих большие низкосимметричные элементарные ячейки, для которых характерно большое количество отражений. Для уточнения фазового состава, ориентировки кристаллов проводилось моделирование картин
электронной дифракции и дифрактограмм при разных углах наклона к точной оси зоны, с рефлексами от нескольких Лауэ-зон. В сложных случаях образования многофазных систем привлекались данные рентгеновского энерго-дисперсионного (ЭДС) микроанализа и, как правило, исследование начиналось с проведения качественного и количественного (в тех образцах, где существовала возможность надёжных измерений) микроанализа.
Электронно-микроскопические изображения представляют собой картины интерференции электронных волн и прямая интерпретация подобных изображений как проекций структуры возможна только для тонких образцов (приближение слабого фазового объекта) при шерцеровской дефокусировке [4-6]. Поскольку в общем (реальном) случае картина искажается динамическим рассеянием и оптическими аберрациями микроскопа, то для правильной интерпретации получаемых изображений необходимо проводить компьютерное моделирование, используя известные электронно-оптические параметры и кристаллографические данные образцов с последующим сравнением рассчитанных и экспериментальных изображений.
Моделирование ВРЭМ-изображений при . заданных условиях (кристаллическая структура, толщина и ориентация образца, условия получения изображения в микроскопе, включая значение дефокуса, ускоряющего напряжения, коэффициентов аберраций и угла расходимости) и сравнение с экспериментальными изображениями однозначно подтверждает (или опровергает) структуру исследуемого материала в наномасштабе. Варьирование параметров, связанных со структурой и морфологией образца, последовательно изменяя дефокус или угол наклона образца к точной оси зоны, в свою очередь, дает возможность провести количественный анализ, установить свойства материалов: выполнить оценку размеров, особенно толщины, естественных тонких кристаллов, установить разориентировку зерен и выявить локальное разупорядочение в кристаллах. Все эти параметры необходимы при определении механизма образования или разрушения структуры материалов, композитов на основе нанокристаллов.
Одной из наиболее часто цитируемой и используемой в различных исследованиях программой моделирования ВРЭМ изображений является многофункциональная программа JEMS - Java Electron Microscopy Software (ранняя версия программы EMS, разработанная П.Стадельманном [7]. Особенностью программы является возможность встраивания других программ (модулей) для выполнения разнообразных расчетов и проведения моделирования. Гибкость программы обеспечила уникальную возможность внесения в неё других необходимых функций для решения научных проблем, что сделало JEMS незаменимым средством исследования паноразмерных систем. Новыми функциями JEMS, разработанными и протестированными для различных материалов, стали программа для моделирования
размерного эффекта и определение его влияния на картины электронной дифракции от нанокристаллов, установление влияния отклонения ориентировки образца от точной оси зоны на распределение контраста на ВРЭМ изображениях.
Основными объектами, исследуемыми в данной работе, были биоматериалы: (1) синтетические фосфаты кальция - гидроксиапатит (НАР) и октакальций фосфат (ОСР), осаждаемые из растворов в разных условиях, а также пористые и твердые керамики, созданные на основе гидроксиапатита, (3) покрытия из гидроксиапатита, получаемые в низкотемпературной газовой плазме на различных подложках, (4) керамики на основе трикальций фосфатов, синтезируемые при высокой температуре, (5) биообъекты - костная ткань и минерализованные сердечные клапаны, (б) композиты, представляющие собой стабилизирующую полимерную матрицу с внедренными наночастицами селена и серебра.
Указанные материалы уже сейчас находят широкое применение в биологической и медицинской областях [8-14]. Основными требованиями, предъявляемые к ним являются чистота, эффективность, безопасность. Поэтому разработка оптимальных условий синтеза и характеризация конечных продуктов должны были отвечать данным требованиям, а это, в свою очередь потребовало адекватных методов исследования.
Несмотря на то, что изучению, например, фосфатов кальция как синтетических, так и природных посвящено огромное количество публикаций, интерес к структурным исследованиям не угасает в связи с их жизненной важностью. Один из фосфатов кальция, гидроксиапатит, является минеральной компонентой костной ткани и является основной фазой, которая осаждается на сердечных клапанах, препятствуя нормальной работе сердца. Механизм образования фосфатов кальция в растворах, несмотря на существующие модели, не ясен и остается предметом исследования во многих лабораториях мира. Нанокристаллический НАР, осаждаемый из водных растворах, долгое время считался аморфной фазой из-за уширенных дифракционных максимумов на рентгеновских дифрактограммах. На основе уширенных максимумов и данных химанализа предполагалось, что кристаллизация гидроксиапатита проходила в несколько этапов с помощью превращения осаждающейся аморфной фазы через несколько кальций фосфатных модификаций в НАР.
Обычно исследование папоразмерных объектов, которое включает установление морфологии, размеров, химического и фазового состава проводится с помощью комбинации методов 1) получение изображений с высоким разрешением, 2) микро- и наиодифракции, 3) рентгеновского энергодисперсионного анализа с использованием тонкого папозонда, 4) спектроскопии энергетических потерь электронов. Две первых методики дают информацию о структуре и локальном фазовом составе, с помощью двух других методик определяется химический состав, электронное состояние образца.
В любом электронно-микроскопическом исследовании приходится учитывать радиационную устойчивость образцов к электронному пучку, а для образцов всех указанных биоматериапов, это влияние оказывается критическим. В работе показано, что такие локальные методы, как рентгеновский энерго-дисперсионный анализ с использованием электронного наиозонда, нанодифракции или электронной дифракции в сходящемся пучке не являются информативным, поскольку образцы разрушаются раньше, чем могут быть получены экспериментальные данные. В этом случае наиболее полная информация о наноструктуре была получена с помощью дифрактограмм от ВРЭМ изображений, а также путем моделирования ВРЭМ изображений и дифракции для известных кристаллографических и электронно-оптических параметров.
Стоит особо отметить, что отработка методов приготовления образцов занимали практически половину времени всего электронно-микроскопического эксперимента. В случае исследования мелкодисперсных (порошкообразных) материалов с прозрачными для электронов пластинчатыми кристаллами их не только прямо переносили на поддерживающую медную сетку с углеродной пленкой. Для изучения других проекций кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата (например, [001]) образцы готовили специальным образом, при котором кристаллы заливались эпоксидной смолой с плотностью, близкой к плотности кристаллов, и затем делались тонкие срезы в ультамикротоме. Образцы костной ткани, которая является чрезвычайно пористой, также находились в затвердевшей эпоксидной смоле, которая не давала образцу рассыпаться при получении тонких срезов с помощью ультрамикротомии. Все образцы, особенно включающие органическую матрицу, исследовались с наименьшей интенсивностью электронного пучка, чтобы не допустить его разрушения до получения необходимых данных, но в то же время достигнуть удовлетворительного отношения сигнала к шуму для последующего количественного анализа ВРЭМ-изображения.
Таким образом мотивировать проведение данных исследований по идентификации ианофаз можно как с позиций фундаментальной науки, так и с точки зрения их практического использования. Фундаментальными составляющими в областях физики и химии кристаллов здесь являются особенности структуры наиокристаллов и механизмов ее образования. Перспективы практического использования полученных результатов заложены в методологическом подходе: (I) выявлены возможности и пределы применимости количественных электронно-микроскопических методов фазового анализа на наноуровне с помощью преобразования Фурье и моделирования ВРЭМ изображений и картин электронной дифракции, (2) отработана техника приготовления тонких образцов биоматериалов для электронной микроскопии высокого разрешения.
Проведенные наноструктурные исследования и полученные результаты являются основанием для развития новых представлений о механизме кристаллизации гидроксиапатита в растворе и пересмотра существующей теории фазовых превращений из аморфного состояния, механизма биоминерализации, оптимизации условий синтеза безопасных и эффективных биоматериалов.
Цель работы
Целью работы являлось развитие и определение потенциальных возможностей количественных методов электронной микроскопии высокого разрешения для характеризации нанофаз в биоматериалах, включая моделирование размерного эффекта и его влияния на картины электронной дифракции, установления влияния наклона образца на распределение контраста на ВРЭМ-изображениях, установления структурных особенностей кристаллов, определяющих появление запрещенных рефлексов.
Проводимое исследование наноструктуры было также направлено на решение фундаментальной задачи механизма образования кристаллов и композитов на их основе. Измерения методами ВРЭМ дополнялись исследованием с помощью рентгеновской энергодисперсионной спектроскопии (ЭДС), а также рентгеновской дифракции и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) для получения информации о фазовом составе в целом от мелкодисперсного образца и для сравнения морфологии различных кристаллов в макромасштабе.
Научная новизна
Разработаны подходы к исследованию влияния уменьшения размеров
кристаллов (изотропных и анизотропных) с разной структурой на появление диффузного
рассеяния на картинах электронной дифракции. Соответствующая программа
моделирования размерного эффекта является составной частью программы JEMS. Проведенное исследование позволило выявить причины сильного диффузного рассеяния на элсктронограммах и сравнить с уширенисм максимумов на картинах рентгеновской дифракции.
Усовершенствована программа моделирования ВРЭМ изображений, в которой учтены отклонения от точной оси зоны на любой угол, случайные вибрации и дрейф образца (из-за зарядки под электронным пучком непроводящих частиц) для выявления более точного соответствия расчетных и экспериментальных изображений. Результатом проведённой модификации стала возможность надёжной идентификации нанофаз (размер кристаллитов до 5 нм), измерения толщины естественных кристаллов гидроксиапатита и относительной
разориентация иаігозерен в кристаллах с помощью моделирования ВРЭМ изображений, установления причин появления запрещенных рефлексов с ростом толщины.
Создана программа построения сверхячейки анизотропного кристалла и образования структурной модели изотропной сферической частицы.
Проведено усовершенствование графического интерфейса для оптимизации времени вычислений и моделирования, а также использования оперативной памяти компьютера при работе с кристаллами, имеющими большие многоатомные (до 300 атомов) элементарные ячейки с низкой симметрией.
Впервые проведены исследования микро- и наноструктуры кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата, выращенных в условиях микрогравитации и выявлены различия в морфологии, размерах и структуре кристаллов, полученных в разных режимах смешивания исходных растворов. Впервые получены и исследованы чистые и большие (несколько миллиметров длиной) кристаллы октакальций фосфата.
Исследована структура смешанных кристаллов гидроксиапатит/октакальций фосфат, впервые установлены ориентационные кристаллографические соотношения между двумя фазами, вычислены напряжения в кристаллах.
Определена наноструктура слоев гидроксиапатита, полученных плазменным осаждением на подложки.
Определена устойчивость кальций фосфатных биоматериалов, полученных при высоких температурах. Впервые выявлено образование оксида кальция во время спекания и приготовления пористого костного биозаместителя на основе а-СазР04 при температуре 1430С, которая ниже температуры, определённой фазовой диаграммой в системе СаО-Рг05 и равной 1720С.
Исследована структура нормальной и патологически измененной костной ткани и получены изображения отдельных нанокристаллов гидроксиапатита на коллагеновых волокнах, оценены их размеры в трех направлениях.
Исследован фазовый состав минерального осадка на сердечных клапанах и предложена модель его образования.
Проведена характеризация образующихся нанофаз под влиянием внешних условий и определена устойчивость манокомпозитов, представляющих собой внедренные в органическую стабилизирующую матрицу наночастицы селена и серебра.
Впервые обнаружен и описан эффект кристаллизации внутри рыхлых бесструктурных наночастиц селена, синтезированных в водных растворах с помощью окислительно-восстановительной реакций и стабилизированных в разных органических средах.
Практическая значимость работы
Главным практическим результатом, полученным в работе, является обоснование применения комбинации методов по идентификации фазового состава в паномасштабе на основе количественной обработки ВРЭМ изображений с помощью преобразования Фурье и моделирования ВРЭМ изображений от радиациоипо-чувствительных объектов, оценка толщины естественных (не утонченных) кристаллов.
Установлены закономерности изменений наноструктуры и морфологии кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата в зависимости от скорости смешивания исходных растворов, температурь! кристаллизации.
Определены условия для получения нанокристаллических гидроксиапатитных покрытий из плазмы газового разряда на различных подложках.
Результаты исследования структуры как осаждающихся из растворов кристаллов гидроксиапатита, так и плазменных покрытий на подложках, актуальны с точки зрения производства эффективных и безопасных биоимплантатов и выяснения механизмов патологических отклонений в живых организмах.
Предложен механизм биоактивности бактерицидных средств, включающих наночастицы серебра, в основе которого химическое взаимодействие серебра с серосодержащими агентами в окружающей среде и в организмах, установлены причины недостаточной эффективности медицинских препаратов с наночастицами селена в органических средах.
Всё это способствовало прояснению различий и сближению позиций между химическими, биологическими, медицинскими подходами с одной стороны и физическими подходами в получении и интерпретации результатов, с другой стороны.
Защищаемые положения
1. Комбинированный метод по идентификации нанокристаллов и нанофаз в разных биокомпозитах с помощью преобразования Фурье и моделирования электронной дифракции и электронно-микроскопических изображений с высоким разрешением, среди которых недавно разработанные программы для моделирования ВРЭМ изображений с учетом отклонения от точной оси зоны, атомных вибраций, дрейфа образца; создания сверхячейки анизотропного кристалла; образования структурной модели изотропной сферической частицы; исследования зависимости уширения дифракционных максимумов с уменьшением размера частиц.
-
Результаты экспериментальных исследований наноструктуры, морфологии и размером кристаллов гидроксиапатита, синтезируемых в водных растворах в условиях конвективного смешивания реагентов, в диффузионном режиме смешивания в невесомости и в случае принудительного смешивания с разными скоростями при низких (25- 40С) и высоких (95С) температурах.
-
Установление зависимости и определение толщины малорастворимых в воде кристаллов от температуры растворов. Обнаружение запрещенных гексагональной симметрией отражений в кристаллах гидроксиапатита благодаря локальному разупорядочепию в их структуре.
-
Обнаружение размерного эффекта на рептгеподифракционных картинах и электронограммах и его моделирование на примере нанокристаллов гидроксиапатита.
-
Результаты экспериментального исследования наноструктуры смешанных кристаллов гидроксиапатита / октакальций фосфата: определение кристаллографических ориентационных соотношений и напряжений.
-
Результаты экспериментального исследования наноструктуры плазменных покрытий гидроксиапатита на различных подложках: определение фазового состава, размеров и относительной ориентации нанокристаллов в покрытиях.
-
Результаты экспериментального исследования наноструктуры высокотемпературных биоматериалов на основе гидроксиапатита и трикальций фосфатов.
-
Результаты сравнительной характеризации здоровой костной ткани и образцов с патологическими изменениями. Модельное представление механизма снижения минеральной плотности кости и развития деструктивных процессов.
-
Результаты экспериментального исследования - определение фазового состава минеральной фазы, осаждающейся на сердечных клапанах, структуры, морфологии, размеров кристаллов в осадке. Модельное представление механизма патологической минерализации мягких тканей в живых организмах.
10. Обнаружение эффекта кристаллизации наночастиц селена под действием
органических веществ. Анализ экспериментальных данных с помощью структурного
моделирования напочасти селена.
11. Обнаружение продуктов химического взаимодействия наночастиц серебра с
реагентами из окружающей среды. Модельное представление механизма
бактерицидной активности наночастиц Ag.
Личный вклад автора
Все оригинальные результаты электронно-микроскопического исследования, обработки данных и моделирования, вошедшие в диссертацию, были получены самим
автором или при непосредственном его участии в модернизации программы моделирования, а также в разработке ростовых экспериментов.
Апробация результатов работы и публикации
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих международных и российских национальных конференциях, конгрессах и семинарах:
1. 9th European Symposium Gravity-Dependent Phenomena in Physical Science. Berlin, Germany,
2-5 May 1995;
2. 16 Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 29 ноября-2
декабря 1996;
3. 26'h International School on Electron Crystallography, Erice, Italy, May 22-June 2, 1997;
4. 17 Российская конференция но электронной микроскопии. Черноголовка, 15-18 июня
1998;
-
12а> International Conference on Crystal Growth, Jerusalem, Israel 26-31 July, 1998;
-
18"' International Congress of the International Union of Crystallography, Glasgow, Scotland 4Ih-
13th August, 1999;
7. 18 Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 5 июня - 8 июля,
2000;
8. 9 национальная конференция по росту кристаллов НКРК-2000, Москва, 16-20 октября
2000;
9. First International Symposium on Microgravity Research and Applications in Physical Sciences
and Biotechnology. Sorrento, Italy, 10-15 September 2000;
10. 11th Interdisciplinary Research Conference on Biomaterials (GRIBOI). Calais, France, 8-9
March 2001;
-
4th International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 24-28 September 2001;
-
Fifth ISTC Scientific Advisory Committee Seminar "Nanotechnologies in the area of physics, chemistry and biotechnology" St Petersburg, Russia, May 27-29,2002;
13. 10 национальная конференция по росту кристаллов НКРК-2002, Москва, 24-29 ноября
2002;
14. Gordon Research Conference on BIOMINERALIZATION. New London, USA, August 2002;
-
9th General meeting of the Swiss Society for Biomaterials. Ncuchatel, Switzerland, May 14-15, 2003;
-
5"1 International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 22-26 September 2003;
-
16th International Conference on Bioceramics, Porto, Portugal, November, 7-10, 2003;
18. 4-ая Национальная конференции по применению рентгеновского, синхротронного
излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов - РСНЭ-2003, Москва,
17-22 ноября 2003;
-
XX Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 31 мая-4 июня, 2004;
-
13 European Congress on Electron Microscopy. Antwerp, Belgium, 23-28 August, 2004;
-
14"' International Conference on Crystal Growth. 9-13 August 2004, Grenoble, France;
-
2nd Joint Meeting of the European Calcified Tissue Society (ECTS) and the International Bone and Mineral Society (IBMS), Geneva, Switzerland, 24-29 June 2005;
-
XX International Congress of the International Union of Crystallography, Florence, Italy, 23-31 August, Book of Abstracts, p. 116, 2005.
-
16"' International Congress on Electron Microscopy, IMC16, 3-8 Sept.2006, Sapporo, Japan.
Основные результаты диссертационной работы опубликованы в реферируемых отечественных и зарубежных научных журналах и сборниках, список публикаций приведён в конце автореферата.
Структура диссертации
Диссертация состоит из введения, семи глав, каждая из которых заканчивается кратким обзором результатов, заключения и списка литературы, изложенных на 230 страницах печатного текста, включающих 140 рисунков, 11 таблиц и список литературы из 215 наименований.
