Введение к работе
Актуальность темы
Развитие и доступность технологий микроэлектроники привели к появлению аналитических систем на основе микрофлюидных устройств (МФУ), позволяющих осуществлять уникальные манипуляции с микроколичествами жидкой или газообразной пробы. Такие системы получили название «лаборатория на чипе» (lab on a chip). Объединение всех стадий и этапов аналитического определения в одном компактном устройстве дает возможность проводить анализ пробы в микроформате с высокой чувствительностью, точностью и экспрессностью определения компонентов.
Современными тенденциями развития МФУ являются: а) миниатюризация; б) интеграция в устройства новых функциональных модулей; в) увеличение числа измерительных каналов; г) применение наноразмерных элементов; д) управление и контроль за всеми стадиями анализа; е) увеличение информативности измерений.
Создание аналитической системы на МФУ связано с решением ряда научных, методических, технических и технологических задач. Анализируемый компонент пробы и метод его анализа (или способ обнаружения) определяют топологию и конструкцию устройства, ассортимент применяемых материалов, технологии изготовления устройства, методы детектирования. Только комплексный подход, увязывающий выбор материалов, конструирование, способы изготовления, интеграцию новых элементов, внедрение оригинальных принципов управления движением и разделением компонентов пробы, дает возможность создавать современные приборы на МФУ. Известные зарубежные конструкции МФУ защищены патентами и режимами коммерческой тайны (know-how). Поэтому требуется проведение собственных исследований и разработок, которые позволят создавать аналитические системы на основе МФУ.
Наиболее востребованными при исследованиях многокомпонентных биологических проб являются электрофоретические методы анализа. При разнообразии конфигураций (конструкций) МФУ, применяемых для электрофоретических методов, существуют общие требования к этим устройствам. Поэтому перспективной является разработка универсальной и простой топологии, которая могла бы использоваться для решения различных исследовательских задач.
Применение оптически прозрачных материалов (стекол, полимеров) в микрогидродинамике (микрофлюидике) дает возможность использовать высокочувствительные оптические методы детектирования компонентов пробы. Востребованными являются исследования по изучению возможности применения отечественных марок стекол для МФУ, адаптация технологий изготовления и способов герметизации для этих материалов, изучение влияния различных факторов на свойства и характеристики устройств. В качестве альтернативных, относительно дешевых материалов могут применяться полимеры (поликарбонат, полиимид, полиметилметакрилат и др.). В этой связи важной задачей является исследование режимов воспроизводимого формирования микроразмерных структур с заданными характеристиками в полимерных материалах при использовании коммерческих технологических установок.
Интеграция в МФУ новых функциональных микро- и наноразмерных элементов и систем (микро- и наноэлектродов, наноразмерных каналов, нанопроволок, нанопористых сред и т.д.) представляется перспективным, так как дает возможность значительно расширить круг решаемых задач за счет использования новых физических принци-пов и методик анализа, улучшить аналитические характеристики устройств. Все это требует проведения комплексных исследований по изучению: способов создания наноразмерных элементов, взаимодействия наноструктур с жидкими средами, определению возможностей детектирования аналита.
Внедрение МФУ в практику лабораторных исследований все еще ограничено, так как рынок оснащен альтернативными аналитическими системами и приборами. Только немногие фирмы производят коммерческие аналитические системы на МФУ, среди них: Agilent Technologies Inc., Caliper Technologies Inc., Bio-Rad, Shimadzu Corp. и др. Разработка и создание отечественной приборной базы на основе МФУ позволила бы отказаться от импорта дорогостоящего оборудования и создать системы с техническими характеристиками, не уступающими лучшим зарубежным образцам.
Вышеизложенное определяет актуальность данного направления исследований, развивающего комплексный подход к созданию аналитических систем на основе МФУ и оптических методов детектирования.
Цель работы: создание микрофлюидных устройств для исследований биологических проб методами флуорометрии и оптической микроскопии высокого разрешения.
Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:
-
Теоретические и экспериментальные исследования влияния геометрических и конструктивных параметров устройств, физико- химических свойств используемых материалов, технологий их обработки на характеристики МФУ;
-
Создание МФУ и приборно-аппаратных средств для электрофоретического разделения пробы и методов анализа на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР);
-
Обоснование и реализация новых принципов исследований биологических проб с применением микро- и наноразмерных структур (нанопористых стекол, массива нитевидных нанокристаллов - ННК, наноразмерных каналов, микроэлектродов), как новых функциональных элементов МФУ (оптического сенсора, гидродинамических и диэлектрофоретических ловушек);
-
Апробация актуальных методик на МФУ: электрофоретического анализа пробы; ПЦР в реальном времени; изучения микрообъектов методами оптической микроскопии высокого разрешения.
Научная новизна диссертационной работы состоит в оригинальном методологическом подходе к проектированию приборно-аппаратных средств на основе МФУ, заключающемся в проведении комплексной системной разработки с учетом: специфики исследуемого объекта, методики анализа, свойств применяемых материалов, технологий формирования микро- и наноструктур, конструктивных элементов устройства, физико-химических свойств поверхности функциональных элементов, метода детектирования. Все это позволяет расширить область функциональных возможностей МФУ и улучшить аналитические характеристики создаваемых на их основе устройств.
В работе впервые:
1. Предложена и реализована новая универсальная топология микрофлюидного чипа (МФЧ), обеспечивающая возможность
дозирования разных объемов пробы электрокинетическими и гидродинамическими способами.
-
-
Экспериментально установлено, что отражательные свойства массива ННК из GaAs определяются формой вершины нанокристаллов. Обнаружено спектрально-селективное воздействие лазерного излучения на наноструктуры GaAs, приводящее к «слипанию» нанокристаллов и вызывающее изменение отражательной способности.
-
На примере обнаружения инсулина в пробе продемонстрирована возможность использования пористых стекол (в частности 8B-MAP), как основы нового оптического сенсорного элемента для регистрации конкурентной иммунной реакции.
-
Получены результаты теоретических и экспериментальных исследований, позволяющие осуществлять оценки влияния конструкционных, технологических, методических факторов при применении МФУ для анализа биологических проб, что является основой для решения задач оптимизации топологий или/и режимов анализа (управления).
Практическое значение определяется
-
-
-
Разработанными и созданными макетными образцами аналитических систем на МФУ с флуоресцентными детекторами, которые используются в ИАП РАН при проведении научно - исследовательских работ.
-
Изготовленными стеклянными МФЧ, предназначенными для электрофоретических и диэлектрофоретических методов исследований биологических проб, а также для методов ПЦР (за последние пять лет совместно с ЗАО «Светлана-полупроводники», г. Санкт-Петербург создано более 250 штук).
-
Отработанными режимами формирования микроразмерных структур с заданными геометрическими характеристиками в полиметилметакрилате методом лазерной абляции (ЛА) и полученными экспериментальными образцами МФЧ для электрофоретического разделения пробы (совместно с ООО «Лазерный центр», г. Санкт-Петербург).
-
Обнаруженным эффектом спектрально-селективного воздействия лазерного излучения на массив ННК, пригодным для применения в новых технологиях обработки наноструктур и при изготовлении конструкций МФЧ с наноразмерными функциональными элементами.
5. Внедрением результатов работы в учебный процесс в форме авторских курсов лекций для бакалавров и магистров: «Микро- и нано- технологии в биологических и медицинских исследованиях» в СПб АУ НОЦНТ РАН, «Микро- и наноаналитические методы исследования жидких сред», «Биоаналитические системы на основе микрочиповых технологий» в НИУ ИТМО.
Положения, выносимые на защиту
-
-
-
-
Конфигурации МФЧ и аналитических систем, содержащие новые технические решения: МФЧ с универсальной топологией для электрофоретического разделения пробы, с гидродинамическими ловушками и флуорометрические системы детектирования.
-
Экспериментальные результаты разделения и анализа биологических проб (в частности, фрагментов ДНК) на МФЧ, подтверждающие достижение аналитических характеристик, превосходящих соответствующие макроаналоги: уменьшение объема анализируемой пробы (в 2-5 раз) и времени определения (~ в 10 раз) при сопоставимых пределе обнаружения и динамическом диапазоне.
-
Новые эффекты, выявленные при экспериментальных исследованиях взаимодействия электромагнитного излучения с массивом ННК (зависимость отражательной способности массива от формы вершин кристаллов) и взаимодействия молекул флуорофора с ННК (образование пространственных регулярных структур), их интерпретация и применение в устройствах на основе МФУ.
-
Результаты экспериментальных исследований, подтверждающие возможность использования пористых стекол, как основы оптического сенсорного элемента в МФЧ для регистрации конкурентной иммунной реакции на примере обнаружения инсулина в пробе.
-
Результаты экспериментальных измерений рельефа поверхности структур при кислотном травлении и термической обработке стекла, полученные при исследовании технологий изготовления микроструктур в стеклянных материалах, и оценка их влияния на характеристики МФЧ.
-
Результаты экспериментальных исследований по выбору режимов ЛА для формирования микроразмерных каналов заданной
геометрии (шириной от 30 до 300 мкм и аспектным отношением <1) в полимерных материалах.
7. Способы управления движением и фиксацией микрочастиц размером от 1 до 6 мкм на МФЧ с микро- и наноструктурами для последующей их визуализации методами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и их практическая реализация.
Личный вклад автора
Автор является одним из инициаторов работ по созданию и развитию МФУ и приборов на их основе для анализа биологических проб. Вклад автора состоит в формировании направления исследований, постановке цели и задач, разработке приборов и устройств, проведении экспериментальных, технологических и методических работ, интерпретации полученных результатов. Все экспериментальные результаты, представленные в работе, их обработка и анализ получены непосредственно при участии автора. Диссертация представляет собой обобщение материалов исследований и разработок, выполненных автором лично, с сотрудниками лаборатории, с коллегами из СПб АУ НОЦ НТ РАН (д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлин), ИХС РАН (д. хим. наук Т.В. Антропова), ФТИ РАН, НИУ ИТМО, ЗАО «Светлана- полупроводники», ООО «Лазерный центр». В работах, опубликованных в соавторстве, автору принадлежат результаты, сформулированные в защищаемых положениях и выводах.
Связь с государственными программами и НИР
Тематика исследований поддержана:
Межведомственной научно-технической программой "Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего" проекты «Микроаналитические системы: портативные и лабораторные экспресс-анализаторы и биосенсоры на основе чип-реализации одноканального и мультиканального приборов капиллярного электрофореза» (2000-2001 гг.) и «Новые принципы детекции и разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторно- диагностических методов исследования» (2002-2006 гг.);
Научными Программами СПб НЦ РАН, проекты «Микрофлюидные чип-анализаторы» (2001 г.), «Аналитические приборы на основе микрофлюидных технологий» (2003 г.); «Микрофлюидные чип-анализаторы с интегрированными
наноструктурами (нановискерами)» (совместно с лаб. д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлина, 2005-2006 гг.), «Микрофлюидные аналитические системы с интегрированными наноструктурами (пористыми стеклами)» (совместно с ИХС РАН, 2009г.);
Грантом РФФИ-ГФЕН 03-01-39003_а «Теоретические и экспериментальные исследования явлений переноса и взаимодействия биологических объектов в микрофлюидных устройствах» (2004-2005гг);
Грантом РФФИ 05-02-08090 офи_а "Микроаналитические системы с интегрированными нитевидными кристаллическими наноструктурами" (совместно с лаб. д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлина, 2005-2006 гг.);
Программой фундаментальных исследований ОХМН РАН «Создание и совершенствование методов химического анализа и исследования структуры веществ и материалов», проекты «Создание наноструктурных пористых элементов функционального назначения для микроаналитических систем» (совместно с ИХС РАН, 20062008гг.), «Микрофлюидные чипы для анализа биополимеров» (20102011 гг.);
Аналитической ведомственной целевой программой "Развитие научного потенциала высшей школы" проект «Исследования и диагностика клеточных структур: новые методические подходы и инструментальные решения на основе сканирующей зондовой микроскопии и микрочиповых технологий» (НИУ ИТМО, 20092011гг.)
Апробация работы
Основная часть разработок и результатов исследований, изложенных в диссертации, докладывалась и обсуждалась на Всероссийских и международных конференциях и симпозиумах: SPIE Conference BiOS 2002 (San Jose, USA, 2002); 1-ой Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (Санкт- Петербург, Россия, 2002 г); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы аналитической химии» (Москва, Россия, 2002 г); 14-th International Symposium Boron, Borides and Related Compounds (St Petersburg, Russia, 09-14 June 2002); XIV и XVI Российских конференциях по использованию синхротронного излучения (Новосибирск, 2002, 2006 гг); 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies SBS-2003 (Moscow, Russia, 2003);
Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, Россия, 2003 г); Seventh, Eight, Night Seminars on Porous Glasses- Special Glasses (PGL'2005, 2007, 2009, Szklarska Por^ba, Poland); 2-ой Международной научно-практической конференции «Исследования, разработки и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, Россия, 2006 г); XIV Int. Symposium «Nanostructure: Phys&Techn» (Репино, Россия, 2006 г); European conference on surface science ECOSS 24 (Paris, 2006); Сессии Научного совета РАН по аналитической химии. Школа-конференция «Успехи аналитической химии» (Звенигород, 2006 г); XVIII и XIX Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (Москва, 2007 г, Волгоград, 2011 г); VIII и IX Международных конференциях «Прикладная оптика» (Санкт-Петербург, 2008, 2009 гг); XX Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2008 г); Spring Meeting European Materials Research Society (EMRS Spring- 2011, Nice, France, 2011); International Conference on Materials for Advanced Technologies (ICMAT 2011, Singapore, 2011); Lab-on-a-Chip European Congress (Hamburg, Germany, 2011); семинарах по микрочиповым технологиям, организованных в МГУ (Химический факультет) и Институте аналитического приборостроения РАН.
Публикации
Основные результаты работы представлены в 105 научных трудах, в том числе 45 работ опубликовано в рецензируемых отечественных и зарубежных научных изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских диссертаций.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, списка литературы из 551 наименования. Текст диссертации изложен на 353 стр., включая 104 рисунка и 9 таблиц.
Похожие диссертации на Микрофлюидные устройства для исследований биологических проб методами флуорометрии и оптической микроскопии высокого разрешения
-
-
-
-
-
-
