Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 8
1.1. Влияние замораживания-оттаивания на белок-липидные комплексы я белки . 8
1.2. Влияние состава растворителя и температуры на белок-липидные комплексы и белки . 14
1.3. Структура и функция цитохромоксидазы . 24
Глава 2. Материалы и методы 31
Глава 3. Влияние замораживания-оттаивания на цитохромоксидазу 38
Глава 4.. Влияние солей на цитохромоксидазу . 53
Глава 5. Влияние криопротекторов на цитохромоксидазы 68
5.1. Влияние криопротекторов.на-структурно-функциональное состояние цвдхромоксидазы 68
5.2. Замораживание-оттаивание цитохромоксидазы в присутствии криопротекторов 92
Обсуждение 102
Выводы 114
Список литературы 116
Список сокращений 137
- Влияние состава растворителя и температуры на белок-липидные комплексы и белки
- Влияние замораживания-оттаивания на цитохромоксидазу
- Влияние криопротекторов.на-структурно-функциональное состояние цвдхромоксидазы
- Замораживание-оттаивание цитохромоксидазы в присутствии криопротекторов
Введение к работе
Одним из наиболее актуальных направлений современной криобиологии является изучение механизмов криоповреждения и криозащиты биологических объектов.
Анализ механизмов криоповреждений" на различных уровнях биологической организации привел большинство криобиологов к выводу, что наиболее чувствительными к действию низких температур структурами являются биологические мембраны [5,7,8,59,62,158]. Однако молекулярные механизмы повреждения мембран при замораживании-оттаивании изучены недостаточно. Необходимым этапом выяснения молекулярных механизмов нриоловреядения мембран является исследование влияния низких температур и сопряженных с их действием факторов на белок-липидные комплексы. Целесообразность таких исследований подтверждается данными об изменении активности ряда мембраносвязанных ферментов после замораживания клеток и клеточных органел [52,76,108,180] . Большой интерес для криобиологии представляет изучение криоповреждений мембран митохондрий, вследствие их высокой криолабильности [8І и существенной роли в обеспечении жизнедеятельности клетки. Ферментные системы, встроенные в мембраны митохондрий, осуществляют реакции окисления-восстановления, сопряженные с генерацией и аккумуляцией энергии [66] . Определяющая роль митохондрий в обеспечении энергетического баланса клеток позволяет ряду авторов считать, что именно их повреадение явл причиной гибели клеток при замораживании [14-7,162,178] .
Одним из важнейших ферментов внутренней мембраны митохондрий является цитохром-с -оксидаза (ЕС 1.9.3.1) - терминальный участок дыхательной цепи, сопряженной с целью окислительного фосфорилированил.
Исследование состояния этого фермента в тканях после замораживания свидетельствует о снижении его активности [52,53,180]. Работы, проведенные на изолированном лилопротеиновом комплексе, показывают, что замораживание до -20°С может приводить к изменению структуры фермента [141,1%] .
Вместе с тем, остается невыясненным вопрос о взаимосвязи структурных и функциональных изменений цитохромоксидазы при заморашшашш-оттаивании. Поскольку процесс заиоракивания-отта-ивания представляет собой целый комплекс физико-химических изменений, на характер которых может влиять и искусственная крио-защита, неясно такие, какие именно факторы и каким образом оказывают влияние на структуру и функцию фермента.
Действие низких температур и криопротекторов на изолированный липопротеиьовый комплекс представляет интерес и с точки зрения теоретической криобиологии; в литературе имеются лишь единичные сообщения, посвященные изучению механизмов криолов-реадения и криозащиты лилопротеинов [21,197 1.
В связи с вышесказанным, целью настоящей работы явилось выяснение характера структурно-функциональных изменений цито- хромоксидазы, вызываемых действием низких температур, и выявление основных факторов криоловревдения и криозащиты фермента.
В задачи работы входило: изучение структурно-функциональ -ных изменений цитохромокойдазы под действием различных режимов замораживания-отогрева фермента в средах с различным солевым составом; изучение структурно-функциональных изменений цитохромокойдазы под действием различных концентраций солей и криопротекторов; выяснение возможных путей криопротекции цитохром- с-оксидазы при замораживании-оттаивании.
Исследования проводились на цитохром- с -онсидазе, выделенной из сердца крупного рогатого скота. Для решения поставленных задач был применен комплекс биофизических и биохимических методов. Для характеристики структурного состояния цитохром- с-ок-сидазы использовали методы дифференциальной спектрофотометрии, температурной пертурбационной дифференциальной спектрофотометра, сольвентной пертурбационной дифференциальной спектрофото-метрии, электрофореза в полиакрилаыидном геле, определение количества фосфора на молекулу белка для оценки количества липи-дов, входящих в состав липопротеинового комплекса. Оценка функционального состояния производилась измерением ферментативной активности и расчетом кинетических параметров реакции, катализируемой цитохром- с-оксидазой. Для оценки возможности деструкции липопротеинового комплекса в результате процессов лерекис-ного окисления проводили реакщш на наличие малонового альдегида.
Экспериментальные исследлвания впервые позволили охарактеризовать функциональные изменения цитохром-с-оксидазы при действии ааморатавания-оттаивания во взаимосвязи со структурными изменениями фермента. Показано, что замораживание-оттаивание цитохром-с-оксидазы приводит к изменению конформации фермента, затрагивающему область его активного центра, и к нарушению бе-лок-липидных взаимодействий. Выяснено, чю определяющую роль в криоповрекдении цитохром- с -оксидазы играет солевой состав среды, при этом влияние анионного состава более выражено, чем ка-тионного.
Установлено, что хлориды натрия, калия и лития в концентрациях выше 1,5 М вызывают необратимые структурные изменения цитохромоксидазы, сопровождающиеся инактивацией фермента. Сравнение экспериментальных результатов, полученных при изучении влияния на цитохромоксидазу заморакивания-оттаивания и концентрированных растворов солей, показало, что криодовреждение фермента обусловлено, главным образом, концентрированном растворов солей при вымерзании воды, однако, в него включаются и другие факторы, приводящие к инактивации фермента или усиливающие действие солей.
Показано, то все изученные криопрогепторы с ростом концентрации приводят к смещению предденатурационкого перехода цитохромоксидазы в область высоких температур, а при достижении определенной для каждого криопротектора концентрации этот переход не наблюдается. Показано, что все изученные криопротек-торы стабилизируют белок-липидные взаимодействия в процессе за-моракивания-оттаивания и все, за исключением этиленгпиноля, обеспечивают сохранение структуры белковой части комплекса. Установлено, что концентрация криопротектора, необходимая для эффективной криоващиты фермента, находится в прямой зависимости от концентрации сопи в среде замораживания. Предложен возможный механизм криозащишы фермента, заключающийся в стабилизации бе-лок-лшшдных взаимодействий при сорбции молекул криолротекторов на поверхности липопротеинового комплекса и нейтрализации повреждающего цитохромоксидазу действия солей за счет образования комплексов ионов с криопротекторами.
Впервые получены температурные пертурбационные дифференциальные спектры цитохромоксидазы и показана возможность их использования для изучения конформациошшх переходов фермента.
Практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные найдут применение в разработке общей теории криоза-щиты биологических объектов, в создании эффективных методов криопротекции ферментных ансамблей и в обосновании научных подходов к выбору основных компонентов криозащитных сред.
Основные положения, подлежащие к защите.
1. Криолабильность цитохромоксидазы в значительной мере зависит от солевого состава раствора, в котором находится фермент. Инактивация фермента после замораживания-оттаивания более выражена в средах, содержащих анионы Ct .
2. Повреждающий эффект замораживания-оттаивания выражается в изменении конформации белковой части липопротеинового комплекса и нарушении белок-липидных взаимодействий. Каждое из этих структурных изменений сопровождается снижением ферментативной активности цитохромоксидазы.
3. Основным фактором криопровреждения фермента является повышенная концентрация соли в среде замораживания. Обеспечение криозащиты цитохромоксидазы достигается применением криолротек-торов, которые стабилизируют белок-липидкые взаимодействия и предотвращают изменения белковой части комплекса.
Влияние состава растворителя и температуры на белок-липидные комплексы и белки
Биологические макромолекулы в отличие от обычных полимеров имеют в растворе упорядоченную пространственную структуру, с которой связаны их специфические биологические функции. Пространственная организация биомакромолекул поддеркивается водородными, электростатическими и гидрофобными связный между различными группами белковой молекулы. Значительное влияние на эти связи оказывает взаимодействие аминокислотных остатков с водой и растворенными в ней веществами. Поэтому конформация белка зависит от свойств окружающих раотворов - рН, ионной силы, температуры, наличия неполярных веществ [174 ] . їо же можно сказать и о структуре липопротеиновых комплексов.
Белки образуют комплексы с липидами за счет различных взаимодействий: поверхностные мембранные белки - за счет электростатического взаимодействия с полярными головками пипидов, интегральные - в основном, за счет гидрофобных взаимодействий. Если взаимодействие первых сильно зависит от ионной силы, рН, то влияние этих параметров на вторые опосредованное - через изменение свойств окружающей среды, играющей определяющую роль в гидрофобных взаимодействиях [ 2U5 J . Это подтверждается работами Hotefi У,&Ы(123] и H?i)notclsptaI,[l73l , которые показали, что повышение ионной силы среды, особенно за счет анионов (J , ПОц, ), приводит к ослаблению гидрофобных связей из-за изменения ионами структуры водн. Взаимодействие липидов с белками сопровождаемся изменением конформации последних, binder $. [1831 , изучая взаимодействие растворимых белков с фосфолипидами, установил, что в протеинах при этом происходят значительные информационные изменения. Аналогичные результаты получил Ro.no! ЯР, [ 172 ] при исследовании комплекса сывороточного альбумина с кардиолишшом. Липиды, связанные с белками, обладают более плотной упаковкой и меньшей подвижностью углеводородных цепей, чем липиды мембран в бислое [138,198 ] . Таким образом, структура липидов и белков в липо-протешювом комплексе настолько тесно взаимосвязана, что изменение свойств одного из компонентов будет приводить к изменению свойств другого.
Влияние ионов на белки осуществляется путем электростатического взаимодействия, поскольку основная часть полярных остатков находится на поверхности белковой молекулы и доступна растворителю, кроме того, вследствие сравнительно малых размеров, ионы способны достигать многих экранированных участков белков и вызывать изменение их структуры. При высоких концентрациях ионов монет проявляться влияние, связанное с их гидратными свойствами: за счет изменения структуры воды [112] , играющей вакную роль в поддержании нативной конформации биологических структур [8,102] . Накопленные в настоящее время экспериментальные данные показывают, что ряд катионов и анионов, которые в небольших концентрациях необходимы для поддержания структуры и функции белка, могут оказывать повреждающее действие при высоких концентрациях. К.А.Иаркосян и соавт., изучая взаимодействие неорганических анионов с атомами меди установили, что такие ионы, как F , , способны взаимодействовать с медью, которая находится внутри белковой глобулы только при высоких концентрациях [45 J . Аналогичные результаты получены fceinert Н. с соавт. при изучении взаимодействия этих анионов с генами цитохромоксидазы, также расположенными в поло v стях внутри молекулы [83] . Изменение третичной и четвертичной структуры сывороточного альбумина быка наблюдали ип S- F с соавт. при концентрациях Li Ct свыше 4М [185] . Необ ратимые конформационные изменения иммуноглобулинов под действием солей Hotl , Ш , №оВг происходят при концентрациях выше 2-4 м [48, 50 ] . Денатурация сывороточного альбумина быка наступает при концентрации Nail 4,6 М [49 J . Взаимодействие ионов с белком зависит также от положения мест связывания: З.А.Сабурова и соавт., анализируя различные механизмы взаимодействия белков с анионами установили, что есть специфические места связывания анионов. При этом эффективность связывания зависит от заряда иона, если участок связывания находится в полярном окружении, и является функцией энергии гидратации, если участок связывания находится в неполярном окрукенли [63 ] . Влияние солей на белки зависит не только от концентрации, но и от температуры. С повышением температуры белки становятся менее устойчивыми и действию солей [ 26,47)50 ] . показал, что нейтральные соли могут изменять конформацию белков, входящих в состав мембран, что приводит к нарушению липид-болковых и белок-белковых взаимодействий. При изучении влияния ионов на белки и липиды плазматических и митохоидриальных мембран установлено., что на поверхности белков и липидов есть места связывания анионов и катионов, взаимодействие с которыми осуществляется при высоких концентрациях солей ( ІЇаСС , \{1 Быше о,8 М). Анионы СГ особенно эффективно связываются с липидами. Катионы связываются менее эффективно, чем анионы. Это обусловлено, как считают авторы, тем, что размеры катионов достаточно велики, а места связывания экранированы Гзз] . показал, что двухвалентные катионы (Щг , Со2 і S 2+ ) повышают температуру фазовых пореходов липидов [165 ] . Chapman. изучая влияние анионов на состояние искусственных мембран, показал, что они изменяют текучесть лецитиново-го бислоя за счет увеличения подвижности полярных цепей, при этом снижается температура фазовых переходов липидов. Эффект влияния ионов на лкпиды возрастает в ряду.Одновалентные катионы на подвижность липнів существенного влияния не оковывали.
Влияние замораживания-оттаивания на цитохромоксидазу
Электрофорез в полиакриламидном геле показал, что как до, так и после замораживания ЦХО дает на электрофореграмме одну идентичною полосу, соответствующую м.в. 200000. Этот результат показывает, что низкотемпературное воздействие на фермент не приводит к его распаду на субъедшшцы.
Измерение количества фосфора на I мг белка до и после замо-равивашш-опаивания (табл.3.4) показано его снинение, что позволяет считать, что уменьшение уровня светорассеяния связано с уменьшением числа фосфолиштдов, входящих в состав липопротеино вых комплексов.
Потеря липидов мокет быть обусловлена процессами перекис-ного окисления липидов, которые могут развиваться при замораживании-оттаивании за счет сближения липидов с геы-содержащими белками, поскольку железо является хорошим катализатором пере-кисного окисления [ 12] . Поэтому были проведены эксперименты для определения продукта переписного окисления - малонового альдегида в растворах ЦХО. Результаты показали, что продукты перекислого окисления в растворах ЦХО после замораживания-оттаивания отсутствуют.
Из табп.3.4 видно, что количество фосфолипидов в комплексе зависит от солевого состава среды замораживания, поэтому возможно, что уменьшение количества пипидов до определенного уровня может приводить к кинформационным изменениям, сопровождающимся потерей активности фермента. В связи с зтиы был проведен эксперимент с многократным заморахшваннем ЦХО в К -фосфатном буфере (табл.3.5, рис.3.За,0).
Результаты эксперимента показали, что только 4-кратное замораживание приводит к снижению активности фермента, в то же время при таком не уровне потери фосфолипидов в трис-Ш буфере снижение активности было заметно больше (табл.3.4). Таким образом, снижение активности ЦХО после замораживания-оттаивания зависит от солевого состава среды и обусловлено как потерей части липидов, так и изменением структуры самого белка. Поэтому в работе были более подробно исследованы спектры поглощения ЦХО. Для сравнения спектров поглощения образцов с достаточно большим уровнем светорассеяния удооно использовать 1-е производные спектров погиощенин[191.
Первые производные спектров поглощения ЦХО в области Соре приведены на рис.3.10, из которого видно, что после замораживания-оттаивания максимум спектра поглощения сдвигается в коротко-волновую область, изменяется форма 1-ой производной. К сожале-нию форма и интенсивность индивидуальных спектров полгпощенип гемов а и а3 неизвестна. Приближенный расчет спектров поглощения с учетом того, что темы а и ъ дают равный вклад в поглощение в области Соре и моделирование смещения полос поглощения отдельных гемов позволили предположить следующее. Изменение спектров поглощения после замораживания фермента в растворах, не содержащих ионы Ct" , по-видимому, обусловлено сдвигом поглощения гема о. в коротковолновую область, что монет быть связано с увеличением доступности гема а растворителю. Изменение спектров поглощения после замораживания в средах, содержащих ионы Ct , вероятнее всего связано со смещением поглощения гема а в коротковолновую область, а гема G$ - в длинноволновую. Последнее может быть обусловлено тем, что гем Q5 имеет свободное координационное место для связывания отрицательных ионов небольшого размера, что сопровождается смещением спектра поглощения в длинноволновую область [151] . Такое влияние анионов Ct , по-видимому, проявляется только при высоких концентрациях последних, как это наблюдалось при изучении ыедь-оодержащей суОъединицы ЦХО [45] . Подобные результаты были получены при исследовании митохондриальных и плазматических мембран [ЗЗ] , в процессе которых было показано, что ионы СГ при концентрациях выше 0,8М могут связываться с белками и липидами. Это явление связывают с ослаблением гидрофобных взаимодействий в концентрированных растворах солей из-за изменения свойств растворов, что может приводить к увеличению доступности ионов к местам связывания в белках и лилидах, которые в обычных условиях экранированы.
Изучение ЦХО методом ТПДС показало наличие температурных пертурбационных дифференциальных спектров в УФ-области и в обяасти полосы Соре. Поспе замораживания-оттаивания ЦХО в фосфатных буферах увеличивается только интенсивность ТПДС в области Соре. В тех же случаях, когда в среде замораживания присутствовали ионы LV изменяется вид ТПДС (рис.3.56), что подтверждает предположения, .высказанные на основе данных, полеченных при изучении разностных спектров ЦХО после замораживания-оттаивания.
Влияние криопротекторов.на-структурно-функциональное состояние цвдхромоксидазы
Появление дифференциальных спектров ЦХО в области полосы Соре после замораживания-оттаивания позволяет считать, что после низкотемпературного воздействия изменяется информация белка в области активного центра. Дифференциальные спектры после замо-ракивания-оттаивания в фосфатных буферах имеют более простую структуру, чем после замораживания-оттаивания в фосфатных буферах в присутствии хлоридов или в трис- НСё. буфере. Структура спектров в последних двух случаях одинакова. Структура и положение максимумов дифференциальных спектров позволяет предположить, что снижение активности фермента в присутствии ионов происходит в результате изменения конфорыации белка в области гемов Q я От, , а не только гема (X , что наблюдается в его отсутствие.
Так как гем О ъ доступен небольшим отрицательно заряженным ионам [117] , ион CV может свободно проникать к нему и вызывать необратимые конформациоиные изменения белка в этой области при высоких концентрациях, что подтверждается видом СПДС, полученных Б присутствии хлоридов. То, что причиной повреждения фермента может быть концентрирование ионов в области гема подтверждают данные о снижении активности ЦХО после ваморавива-ния в присутствии холата натрия, когда часть молекул ЦХО находится з форме мономера [17 ] , в котором гем О з доступен более крупным молекулам и но только зарякешшм [78] .
Наименьшей функциональной единицей фермента является димер [174] . Б диыере, в процессе функционирования фермента наблюдается взаимосвязанная работа 4 гемов [200] . Конкретный механизм их взаимодействия неизвестен, однако, установлено, что рН и ионные детергенты оказывают значительное влияние на это взаимодействие [l74,2Gl] , при этом изменяются спектральные характеристики ЦХО [201] Как известно, в белках с четвертичной структурой замораживание-оттаивание нарушает межмолекулярное взаимодействие f40, 143 ] . Такое не явление могло наблюдаться и в случае ЦХО, однако, изучение электрофореграмм ЦХО после замораживания-оттаивания показало, что они идентичны с электрофореграмыами нативного фермента, т.е. не происходит ни отщепления субъединиц, ни распада динаров ЩО после низкотемпературного воздействия на мономеры. Поэтому логичнее предположить, что при повреждении фермента происходит изменение конформации внутри белковой глобулы, нарушающее взаимодействие мезду двумя гемами, приводящее к снижению ферментативной активности ЦХО.
Наблюдаемые изменения в спектрах поглощения после замораживания-оттаивания в средах с различным солевым составом позволяют предположить, что в тех случаях, когда средой замораживания являлись фосфатные буферы, изменение спектров в области полосы Соре связано со смещением максимума поглощения гема Q в коротковолновую область, что может быть связано с увеличением доступности гема растворителю. Б экспериментах, в которых в среде заморекива нля присутствовали анионы дифференциальный спектр в области полосы Соре обусловлен смещением максимума поглощения гема Q в коротковолновую область, а гема Q - в длинноволновую. Последнее мокет быть связано со взаимодействием ионов Ct со свободным координационным местом связывания гема 03 . Такое влияние на активный центр фермента может быть обусловлено сочетанкым действием концентрированных растворов солей и низкой температуры. Б поддержании нативной структуры цитохромоксидазы и ее активного центра большую роль играют гидрофобные взаимодействия, которые ослабляются с понижением температуры и могут вызвать изменение конформа-ции фермента. Кроме того, при вымерзании воды концентрированные растворы солей могут вызвать дополнительное их нарушение вследствие изменения свойств растворов [122,173 ] . Это влияние проявляется при высоких концентрациях анионов и приводит к ослаблению гидрофобных связей, что мокет приводить и увеличению доступности ионов к местам их связывания в белках и липидах, которые в обычных условиях экранированы 33 ] . К.А.Иаркосяи с соавт. 45 показали, что анионы tl , F\ ЫОь и Йъ способных взаимодействовать с медью циюхромоксидазы только при высоких концентрациях. По-видимому, подобное явление наблюдалось и в данной работе.
Данные, полученные методом температурной пертурбационной дифференциальной спектрофотометрии (ТПДС) достаточно хорошо согласуются с высказанными предполонениями. После замораживания-оттаивания в фосфатных буферах увеличивается только интенсивность температурных пертурбационных дифференциальных спектров, в то время как после заморанизания в средах, содержащих анионы изменяется структура спектра. Изучение температурных зависимостей интенсивности ТПДС позволило получить данные о температурных конформационных переходах.
Заморакивание-оттаивание изменяет устойчивость ЦХО к нагреву: плавление ее в этом случае начинается при Солее низких температурах, что свидетельствует об изменении структуры белка [бі3 » уменьшении его стабильности. Отмечено такке, что после замораживания-оттаивания сдвигается в область более низких температур и предденатурационный информационный переход, который, как показал KUWCIO с соавг [152] обусловлен конформациоины-ми изменениями белковой части и но зависит от количества и свойств связанных с белком лииидов. Аналогичные изменения структурных параметров ЦКО были отпечены и в ыодеяьных экспериментах после необратимого конформационного перехода, вызванного действием солей.
Таким образом, заморакивание-оттаивание ЦХО при определенных условиях может приводить к уменьшению количества связанных с белком липидов и не связанных с этим фактом необратимым изменениям структуры белковой части комплекса, вызывающим потерю ферментативной активности ЦКО.
Замораживание-оттаивание цитохромоксидазы в присутствии криопротекторов
Замораживание-оттаивание ДХО в присутствии этиленгликоля, глицерина, сахарозы, 1,2-лроландиола и ЇЇЗГ-4-00 показало, что все изученные вещества предотвращают отщепление липидов от липопро-теинового комплекса. Замораживание ЦХО в растворах, содержащих соли, в присутствии глицерина, сахарозы, 1,2-лропандиола и ПЭГ-400 не приводит к изменению конформации белковой части комплекса и потере ферментативной активности, в то время как этиленгли-коль в этих условиях оказался неэффективным как криолротектор.
Концентрация криопротекторов, при которых отмечался защитный эффект были кем больше, чем большая концентрация оолей использовалась в среде замораживания.
Полученные результаты позволяют предположить, что вриопро-текторы стабилизируют связи между пипидами и белками, предотвращая их наруиение. По-видимому, это происходит за счет сорбции молекул криопротекторов на поверхности лилопротеинового комплекса. Зависимость криозащитного действия криопротекторов от концентрации солей в растворе обусловлена,по-видимому, свойствами криопротекторов образовывать комплексы с ионами [159] и этим предотвращать их повреждающее действие на структуру белка. Отсутствие криозащитного эффекта у этиленгликоля может быть обусловлено тем, что его молекула обладает наименьшими размерами из всех изученных и наибольшей доступностью к гемам. Поэтому его способность образовывать комплексы о ионами, в частности о ионами [I59J монет способствовать проникновению в недоступные для них области белковой глобулы. Таким образом, в тої,: случае, когда криоповреждошш ллпопротеиноэого комплекса обусловлено действием концентрированных растворов солеи, криопротекторы должны не только стабилизировать структуру лилолротеиновых комплексов и образовывать Комплексы с ионами, но и размеры, которые не позволяли бы ни проникать во внутренние полости белковой части комплекса в том случае, когда ігриоловрендение локализуется в этих областях. 1. Установлено, что заиоракивание-оттаивание изолированной цитохромоксидазы приводит к необратимому изменению конформации белка Б области активного центра и потере связанных с белком липидов. Эти изменения сопровождаются инактивацией фермента. 2. Установлено, что криолабильность цитохромоксидазы в значительной степени определяется составом среды, з которой суспендирован фермент. Наиболее выражено криоловреждсние фермента в растворах, содержащих анионы СІ 3. Основными факторами криоповрекдения фермента являются эвшектичесние растворы, о чем свидетельствует: большая устойчивость цитохромоксидазы к быстрому заморакиванию, чем к медленному, и выраженный поврекдающии эффект охлаждения фермента до температур -20 -30С и экспозиции в концентрированных растворах солей. 4. Установлено, что хлориды hlo , К. и Li ъ концентрациях выше 1,511! вызывают необратимые информационные изменения цитохромоксидазы в области активного центра, сопровождающиеся потерей ферментативной активности. Инактивация фермента увеличивается при увеличении экспозиции фермента в растворах содей. Йнакти-вирующее действие солей замедляется при покинений температуры. 5. Методом температурной пертурбационной дифференциальной спентрофотометрии показано, что с ростом концентрации криопро-текгоров предденатурациоиный конформационный переход сдвигается в область высоких температур, а при достижении определенной для каждого криопротектора концентрации не наблюдается.
