Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. РОЛЬ ЛЬДООБРАЗОВАНИЯ В КРИОПОВРЕВДЕНИИ МЕТОК. 10
1.1. Некоторые методические подходы при замораживании биологических объектов . 27
ГЛАВА II. ХАРАКТЕР КРИСТАЛЛИЗАЦИИ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ КРИОПРОТЕКТОРОВ 34
ГЛАВА III. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 45
ГЛАВА ІV. РАЗРАБОТКА АППАРАТУРНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ МЕТОДА ЗАМОРАЖИВАНИЯ-СКАЛЫВАНИЯ . 58
ГЛАВА V. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ ГЛИЦЕРИНА И ПЭО-1500 ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ОХЛАЖДЕНИЯ 71
V.1 Характер кристаллизации водно-глицериновых растворов 74
V.2. Изучение характера кристаллизации ПЭО-1500. 91
ГЛАВА VІ. ВЛИЯНИЕ РЕЖИМОВ ЗАМОРАШВАНИЯ НА ХАРАКТЕР
КРИСТАЛЛИЗАЦИИ ВЗВЕСИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА 102
VІ.І. Изучение вне- и внутриклеточной кристаллизации в суспензии эритроцитов человека при различных условиях охлаждения в присутствии глицерина. 103
VІ.2. Влияние ПЭО-1500 на характер кристаллизации в суспензии эритроцитов при различных условиях
охлаждения 133
ГЛАВА VII. РЕКРИСТАЛЛИЗАЦИЯ ВНЕ- И ВНУТРИМЕГОЧНОГО ЛЬДА И ОБЕЗВОЖИВАНИЯ МЕТОК НА ЭТАПЕ ТЕМПЕРАТУРНОЙ ОСТАНОВКИ ПРИ ДВУХСТУПЕНЧАТОМ ЗАМОРАЖИВАНИЙ . 139
VII.І. Двухступенчатое замораживание эритроцитов . 139
VII.2. Двухступенчатое замораживание ядросодержащих клеток крови 147
VII.З. Двухступенчатое замораживание клеток культуры ткани 152
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 166
ВЫВОДЫ 172
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 174
- Некоторые методические подходы при замораживании биологических объектов
- ХАРАКТЕР КРИСТАЛЛИЗАЦИИ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ КРИОПРОТЕКТОРОВ
- МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
- РАЗРАБОТКА АППАРАТУРНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ МЕТОДА ЗАМОРАЖИВАНИЯ-СКАЛЫВАНИЯ
- Характер кристаллизации водно-глицериновых растворов
Некоторые методические подходы при замораживании биологических объектов
Поиску оптимальных режимов замораживания различных типов клеток и изучению их морфофункциональных характеристик на всех этапах низкотемпературной консервации посвящено значительное количество исследований, в частности: на дрожжевых клетках [147,152,157] , на эритроцитах [7,78,174,185,192] , на клетках костного мозга [49,130] , на лимфоцитах [74,112,200,214] , на лейкоцитах [25,39,189,199].
Применяемые в настоящее время методы низкотемпературного консервирования биологических объектов в значительной мере являются следствием эмпирических подходов [55] . Вопрос "как морозить" - быстро, медленно - чтобы получать максимальную морфо-функциональную сохранность клетки, будет стоять перед исследователем-криобиологом до тех пор, пока не будут выяснены общие и частные закономерности "поведения" биологических объектов при действии всей совокупности факторов повреждения, проявляющихся на этапах подготовки, замораживания, отогрева.
Простым способом предотвращения криоповреждений было бы мгновенное замораживание биообъекта со скоростью достаточной для образования аморфной структуры льда, а при последующем сверх -быстром отогреве исключалась бы и рекристаллизация. Достоинства сверхбыстрого (10 С/мин) охлаждения клеток до азотных температур либо на отдельных этапах замораживания, приводящего к аморфному замерзанию, дискутировались в литературе и имели много сторонников [72,87,150,194]. Казалось заманчивым остановить мгновенно все физико-химические процессы в живой клетке при замораживании до азотных и гелевых температур, а быстрый отогрев,полное отсутствие дегидратации и высоких концентраций электролитов позволили бы сохранить неизменными структурно-функциональные характеристики клеток.
Характер кристаллизации в водных растворах криопротекторов
Таким образом, значение скорости кристаллообразования является функцией переохлаждения и имеет максимум при некоторой определенной для каждого раствора температуре [10,45] .
Известно, что, увеличивая концентрацию растворенных веществ и скорость охлаждения системы, можно достичь частично или полностью верифицированного состояния образца, включающего в себя незавершенные кристаллические структуры и аморфные участки, а в растворах больших концентраций зародышеобразование может и не происходить, и они перейдут из жидкого состояния в аморфное [l4l] . Способностью к аморфному затвердеванию обладают высококонцентрированные растворы многих криопротекторов: 73$ глицерина, 72$ этиленгликоля, 77$ сахарозы при температурах -57С, -77С и -30С, соответственно [52,188] . В случае растворов средних и малых концентраций происходит отделение двух фаз: кристаллической и аморфной. Таким образом, в зависимости от состава замораживаемого раствора и скорости охлаждения образец может затвердеть аморфно, витрифицироваться или иметь в своем составе аморфную фазу, незавершенные или завершенные кристаллические структуры [52,143] .
Исследование процессов кристаллообразования указывает на зависимость степени неравновесности фазовых переходов в водных растворах от скорости охлаждения LI36J . С возрастанием скорости охлаждения фазовые переходы все более удаляются от равновесия, и тип образующейся структуры льда является функцией скорости охлаждения.
Изучению фазовых превращений водных растворов криопротек-торов, происходящих в области отрицательных температур, посвящено значительное число исследований с помощью методов криомик-роскопии L20,52,62,I36,I4l] , рентгеноструктурного анализа [20, 33,36,194] , электронной микроскопии [114,115,136,141,207] , дифференциальной сканирующей калориметрии L18,29,95,203] .
Согласно данным криомикроскопии при замораживании наблюдается следующая последовательность возникновения кристаллических структур: твердые компактные тела, дендриты, нерегулярные дендриты, сферулиты, "исчезающие сферулиты" [l37] .
Материал и методы исследования. Собственных исследований и их обсуждение
В качестве объектов исследования были выбраны эритроциты и ядросодержащие клетки донорской крови человека, в основном группы АШ), инкубированные в криопротекто-ре и без него, клетки культуры ткани (ПКБ- овечья почка), а также криопротекторы глицерин марки ХЧ и полиэтиленоксид молекулярной массы 1500, синтезированный на Казанском заводе оргсинтеза и очищенный по технологии, разработанной в ИПКиК АН УССР,
Для исследования характера кристаллизации в водных растворах криопротекторов нами были выбраны глицерин - криопротек-тор эндоцеллюлярного действия и полиэтиленоксид - криопротектор экзоцеллюлярного действия.
Глицерин является классическим криопротектором, широко используемым в практике низкотемпературного консервирования [52,63,154,202] . Его криопротекторное действие проявляется как при медленных, так и при быстрых скоростях охлаждения. Присутствие глицерина в замораживаемой среде приводит к заметному понижению температуры замерзания и модификации процесса кристаллообразования [43] . Одно из объяснений защитного действия глицерина основано на его способности образовывать с водой связи более прочные, чем связи в самой воде. то приводит к уменьшению количества свободной воды, способной к выходу из клетки и кристаллизации при фазовом переходе воды в лед [127] . Легко проникая внутрь клетки и действуя как растворитель, глицерин снижает осмотическое давление растворов [48] , в чем проявляется его буферное действие против концентрации других растворенных веществ.
Данные о физико-химических свойствах и биологическом действии растворов ГО0-І500 свидетельствуют о существенном отличии их от низкомолекулярного ряда криопротекторов. Так, методами рентгеноструктурного анализа и криомикроскопии было показано, что присутствие полиэтиленоксидов изменяет процесс кристаллизации воды, вызывая его замедление, и приводит к измельчению кристаллических структур [20,2l] . Определенный интерес представляют сообщения о поверхностно-активных свойствах поли-этиленгликолей по отношению к липидным слоям, оказывающих влияние на состояние клеточной мембраны [69] и характер взаимоотношения клетка - внеклеточная среда при низких температурах.
Полученная другими методами информация о характере кристаллообразования при различных режимах замораживания, о размерах и форме кристаллов в растворах выбранных криопротекторов различных концентраций может быть дополнена электронно-микроскопическими данными об этих характеристиках для случая кристаллизации в объеме, больших концентраций и скоростей охлаждения.
Разработка аппаратурного обеспечения метода замораживания-скалывания
Необходимо отметить, что техническое обеспечение метода замораживания-скалывания отстает от теоретических и практических требований. Основная масса электронно-микроскопических исследований, проводимых этим методом, выполнена либо на дорогостоящих установках фирмы" Ва ет:б ", либо на самодельных перео борудованных вакуумных постах [31,72,109] . Постоянное внимание в литературе к совершенствованию этих установок свидетельствует: во-первых, о большом и возрастающем интересе к методу, и, во-вторых, о потребности в серийном выпускаемых приборах, отвечающих самым высоким методическим требованиям [35,
Для решения поставленных в работе задач нами была изготовлена установка для метода замораживания-скалывания на базе отечественного вакуумного напылительного поста ВУП-2К, которая
При Незначительных КОНСТРУКТИВНЫХ ИЗМенеНИЯХ МОЖеТ бЫТЬ ИСПОЛЬ зована и в более современных напылительных установках ВУП-4К [59] .
Основные методические требования, предъявляемые исследователями к приборам, обеспечивающим замораживание образца, его , скалывание и последующее нанесение металло-угольной реплики,это: минимальное количество артефакторв, привносимых в исследуемый объект и высокая производительность и воспроизводимость этапов метода.
Для осуществления вышеуказанных требований необходимо обеспечить;
а. Возможность одновременного скалывания нескольких образцов и скалывание каждого образца несколько раз.
б. Высокую степень стабилизации температуры образца и скалывающего ножа.
в. Помещение и извлечение сколотых и напыленных образцов в камеру без нарушения вакуума в рабочем пространстве.
г. Напыление металло-угольной реплики с наименьшей тепловой нагрузкой на объект.
Конструкцию установки проектировали с учетом вышеуказанных требований.
Общий вид изготовленной нами установки представлен на рис.4,а, блок-схема показана на рис.4,б. В основе сделанных дополнений к вакуумному посту ВУП-2К лежат: изменение электрической схемы прибора, изготовление новой рабочей камеры, устройства для автоматического скалывания объекта и блока управления для него, введение блока контроля и стабилизации температуры, а также азотного контейнера типа УПЗМ с двумя электромагнитными клапанами типа КЭА-1002 производства СКТБ с ОП ИПКиК АН УССР для автоматической дозированной подачи азота.
Характер кристаллизации водно-глицериновых растворов
Добавление в водную среду глицерина приводило к качественному изменению характера кристаллизации воды. Помимо кристаллических структур мы наблюдали появление каналов эвтектики, в которых при замораживании концентрировалось растворенное вещество .
На репликах со сколов замороженных растворов растворенное вещество наблюдалось, обычно, в виде разветвленной непрерывной сети гладких каналов, разделяющих между собой кристаллические образования льда. Структура каналов существенным образом зависела от режима охлаждения и либо представляла гладкие области с четкой границей при медленном замораживании, либо содержала незначительные кристаллические образования, расположенные, как правило, вдоль границы с кристаллами, при быстром замораживании (рис.10,а,б). По мнению авторов работы [207] , каналы, образующиеся при быстром замораживании, содержат растворенное вещество не в эвтектической концентрации, а ниже - "гипоэвтектика". Причину такого несоответствия авторы видят в быстром затвердевании образца и возрастании вязкости, что мешает равновесному протеканию процесса замораживания.
Кристаллические структуры льда при быстром замораживании часто имели незначительные примеси растворенного вещества (рис. 10,6), что тоже может свидетельствовать о неравновесности процесса замораживания.
Анализ электронно-микроскопических картин кристаллизации растворов глицерина позволил выявить некоторые особенности при замораживании их с различными скоростями. (Результаты машинной обработки морфометрических данных кристаллических структур для различных условий охлаждения представлены в таблице I).
Медленное замораживание растворов глицерина 10% концентрации приводило к образованию больших кристаллических структур дендритного типа, размеры которых варьировали от II до 13 мк (табл.1). Кристаллы льда имели гладкую четкую границу и сложное строение. Они содержали в себе равномерно распределенные мелкокристаллические структуры размером 0,03-0,05 мк (рис.10,а). Образование таких структур, вероятнее всего, связано с рекристал-лизанионными перестройками в структуре льда на этапе замораживания [9,145] . Ширина каналов составляла в среднем 0,6-1,2 мк (табл.2).
