Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Биологическая роль окиси углерода обзор литературы 15
1.1. Физические и химические свойства окиси углерода 15
1.2. Механизмы образования эндогенной окиси углерода в организме 18
1.3. Физиологическая роль окиси углерода 21
1.4. Механизмы утилизации окиси углерода в организме 23
1.5. Механизмы транспорта окиси углерода 23
1.6. Аналитические методы для исследований эндогенного СО в выдыхаемом воздухе 46
1.7. Экспериментальные исследования выделения эндогенного СО в норме и при патологиях 55
1.8. Резюме по первой главе 58
ГЛАВА 2. Основные закономерности и модель выделения эндогенного со с выдыхаемым воздухом 62
2.1. Общие закономерности выделения эндогенного СО 62
2.2. Перенос СО из крови в выдыхаемый воздух 63
2.3. Перенос СО из клеточных и тканевых систем буферирования на гемоглобин 65
2.4. Основные соотношения для динамики выведения СО 68
2.5. Оценка динамических параметров 70
2.6 Резюме по второй главе 80
ГЛАВА 3. Методы и приборы для исследований выделения эндогенной окиси углерода с с выдыхаемым воздухом
3.1. Объекты и методы исследования 82
3.2. Лазерный анализатор окиси углерода в выдыхаемом воздухе - 85
3.3. Анализаторы С02 и Ог 91
3.4. Измерение скорости потока газа в выдыхаемом воздухе с 91 помощью ультразвукового 4.5. Заключение
Литература
- Механизмы образования эндогенной окиси углерода в организме
- Аналитические методы для исследований эндогенного СО в выдыхаемом воздухе
- Перенос СО из крови в выдыхаемый воздух
- Лазерный анализатор окиси углерода в выдыхаемом воздухе
Введение к работе
Основные направления и актуальность исследований
Диссертация посвящена разработке методов определения содержания эндогенной моноокиси углерода (СО) в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, основанных на высокочувствительном лазерном спектральном анализе, исследованиям с помощью этих методов основных закономерностей выделения эндогенного СО живыми организмами и разработке на этой основе новых неинвазивных диагностических подходов, которые могут быть применены в физиологических и клинических исследованиях.
Актуальность определения содержания СО в выдыхаемом воздухе, а также разработок аналитических устройств, предназначенных для подобных измерений, обусловлена тем, что моноокись углерода является одним из эндогенных газообразных соединений, играющих значительную роль в жизнедеятельности организма. Особенности процессов ее образования в организме и транспорта от тканей и органов в выдыхаемый воздух в настоящий момент недостаточно хорошо изучены, а разработка подходов к использованию СО в качестве молекулы-биомаркера требует тщательных предварительных исследований. Для этих целей должны использоваться новые методы высокочувствительного, достаточно точного и селективного инструментального анализа содержания СО в выдыхаемом воздухе, которые стали доступными лишь в последнее время.
В организме эндогенное СО образуется в результате ферментативно-управляемого катаболизма (разложения) гем-содержащих соединений [1-3]. Основная его продукция обусловлена гемолизом эритроцитарного гема в ходе эритропоэза, направленного на устранение стареющих клеток крови. Кроме того, некоторая доля эндогенного СО образуется при деградации миоглобина, нейроглобина, цитоглобиа, цитохромов и ряда металлсодержащих ферментов, таких как каталаза, пероксидаза, триптофанпирролаза, гуанилатциклаза, N0-синтаза и других. Также возможно образование относительно малого количе-
ства СО негемовой природы за счет перекисного окисления липидов, фотоокисления, а также активности ксенобиотиков и некоторых бактерий [3]. Результаты недавних биохимических исследований показывают, что СО в организме является не только конечным продуктом метаболических превращений упомянутых выше соединений, но и сигнальной молекулой (т.н. вторичным мессенджером), участвующей в механизме преобразования сигналов, регуляции клеточного метаболизма и в передаче информации [4,5].
Во избежание избыточного накопления, СО интенсивно выводится из организма. Для этих целей, помимо диффузии, транспорта в растворенном состоянии и конвективного газообмена, используется специальный механизм обратимого связывания этих молекул гем-содержащими белковыми структурами (гемоглобин, миоглобин, цитоглобин, нейроглобин, цитохром-аЗ), кратковременного буферирования на них и транспорта по градиенту концентраций 02 -от клеток и тканей в легкие [2,6-9]. Для выведения СО используется та же цепочка механизмов, с помощью которой осуществляется транспорт кислорода из легких и обеспечение дыхания клеток, только действующая в обратном направлении. В клетках СО может быть связано цитоглобином, нейроглобином [7-9] или цитохромами-аЗ (в митохондриях клеток). В мышечных тканях СО накапливается на миоглобине, а в крови - на гемоглобине. За счет потока кислорода, проникающего с кровью в ткани и клетки, между этими системами буферирования СО происходит постоянный обмен, так что молекулы СО постепенно продвигаются в направлении от клеток к легким. В легких СО диффундирует из крови в воздушное пространство легких и затем за счет вентиляции при дыхании выводится в атмосферу. На заключительном этапе пребывания эндогенного СО в крови, т.е. в альвеолярных капиллярах, темп его выделения в воздушное пространство легких находится в непосредственной зависимости от перфузии и эффективности доставки кислорода к альвеолярной мембране легких [3]. Эта эффективность может меняться за счет вариации как газодинамических, так и диффузионных характеристик используемых дыхательных смесей.
Необходимо выделить несколько наиболее важных процессов, в которых эндогенное СО участвует в организме [1,3-5]. Во-первых, СО является вторичным мессенджером для неиромедиаторов и гормонов, поскольку активизирует работу фермента гуанилат-циклазы, участвующей в образовании циклического гуанизинмонофосфата. Последним определяется уровень кальция в клетке, от которого в конечном счете зависит активность протеин-киназ и некоторых биохимических процессов. Кроме того, СО участвует в механизме регуляции тонуса кровеносных сосудов и возможно влияет на внутриклеточные механизмы формирования долговременной памяти. Во-вторых, СО разделяет с Ог общую систему транспорта и буферирования, что позволяет использовать его как маркер при исследовании механизмов и самого транспорта кислорода. В-третьих, существуют предположения, что СО выделяется при воспалительных процессах и поэтому может быть использовано как маркер работы антиокси-дантной системы. Наконец, в-четвертых, основная функция молекул СО определяется их ролью в регуляции обновления клеток крови, т.е. СО может служить индикатором и маркером катаболизма.
Таким образом, для использования эндогенного СО в качестве биомаркера физиологических процессов существенным является то, что интенсивность выделения СО с выдыхаемым воздухом зависит от скорости продукции СО в организме, биохимических параметров среды в клетках и тканях организма и химического состава вдыхаемой газовой среды.
Благодаря этому использование высокочувствительного, высокоточного и селективного мониторинга эндогенного СО в выдыхаемом воздухе может быть актуально и перспективно для исследований:
интенсивности метаболических и индуцированных процессов, связанных с образованием СО;
диффузионных и конвективных процессов переноса кислорода в легких;
эффективности процессов переноса кислорода кровью от легких к тканям, включая перфузию и тканевую микроциркуляцию;
интенсивности основного обмена, образования и накопления кислых продуктов в условиях тканевой гипоксии.
Следует особо отметить, что одним из важных и перспективных аспектов данного подхода, основанного на анализе химического состава выдыхаемого воздуха, является возможность неинвазивных исследований некоторых важных параметров организма и базирующейся на них диагностики нормальных и патологических процессов.
Сложность анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе обусловлена несколькими факторами. Во-первых, чувствительность газового анализа СО должна быть на уровне 10 мкг/м3. Во-вторых, поскольку выдыхаемый воздух является сложной газовой смесью, требуется высокая селективность анализа. Применяемый метод должен обеспечить измерение следовых концентраций СО в присутствии азота, кислорода, паров воды, СОг и других компонентов выдыхаемого воздуха. В-третьих, измерения СО желательно проводить в масштабе времени близком к реальному, не применяя накопления, обогащения и фильтрации газовой пробы. В-четвертых, применяемый метод должен обеспечивать возможность для долговременного и непрерывного мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе с тем, чтобы можно было исследовать достаточно медленные физиологические процессы.
Один из возможных подходов к решению данной проблемы состоит в использовании лазерных технологий спектрального анализа, в частности, методов диодной лазерной спектроскопии, которая является признанным лидером в области высокочувствительного и высокоселективного газового анализа. Именно этот подход был применен и развит нами в данной работе.
Цели и задачи исследований
Целью диссертации являлось исследование основных закономерностей выделения эндогенного СО с дыханием у человека и животных с помощью методов высокочувствительного лазерного анализа и разработка на этой основе новых методов неинвазивной биомедицинской диагностики.
В задачи исследования входили:
Проведение разработки методов и средств высокочувствительного анализа и мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, основанных на использовании перестраиваемых диодных лазеров.
Разработка методов и алгоритмов анализа данных мониторинга па
раметров дыхания, кровообращения и выделения эндогенного СО.
Исследование закономерностей выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом в норме, при изменении состава вдыхаемой газовой смеси (вариации содержания СО в атмосфере, гипероксия, гипоксия, гиперкапния) и при выполнении различных физиологических тестов, таких как физическая нагрузка, гипервентиляция, задержка дыхания.
Исследование содержания СО в выдыхаемом воздухе при некоторых заболеваниях.
Оценка возможностей использования анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе в целях биомедицинской диагностики.
Научная новизна
Впервые методы высокочувствительного лазерного анализа были применены для определения и долговременного мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, что позволило исследовать основные закономерности выделения этого вещества с дыханием и продемонстрировать диагностическую значимость лазерного анализа СО в
биомедицинских приложениях.
Впервые получены следующие результаты:
Разработан автоматический диагностический комплекс для измерения параметров газообмена, включающий в себя лазерный анализатор СО, анализаторы Ог и С02, ультразвуковой измеритель потока газа. Основные технические параметры комплекса: Анализатор СО: время анализа - 5 с; чувствительность -5 мкг/м3; точность определения концентрации СО - 3 %; объем аналитической кюветы - 1 л; селективность анализа -100 %; время непрерывного мониторинга - не ограничено. Анализатор Ог: время анализа - 100 мс; чувствительность -от 0.1 %; точность - 1 % от полной шкалы измерений. Анализатор СОг: время анализа - 100 мс; чувствительность - от 0.01 %; точность 0.2% всей шкалы измерения. Ультразвуковой измеритель потока газа: диапазон измерений -0.006-20 л/с; точность измерений ~1 %; инерционность - 2-Ю"3 с; сопротивление дыханию - не выше 50 Па; измерения в кислородно-азотно-аргоновой и кислородно-гелиевой средах в диапазоне давлений от 0.1 до 25 МПА при парциальном давлении кислорода от 0.01 до 0.1 МПА и произвольном процентном соотношении азотной и аргоновой составляющих газовой смеси.
Разработаны методы регистрации выделения эндогенного СО в различных экспериментальных условиях на человеке и животных: метод отбора пробы в изолированную емкость для определения среднего количества СО, выделяемого за один выдох, в том числе, при использовании маневра с задержкой дыхания; метода мониторинга концентрации СО в усредненном выдыхаемом воздухе для исследований выделения СО в покое, при дыхании искусственными дыхательными газовыми смесями и при выполнении физиологических тестов; метод мониторинга концентрации СО в альвеолярном воздухе; метод определения скорости выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом; метод исследования выделений СО с выдыхаемым воздухом в условиях гипербарии.
Установлены основные закономерности выделения эндогенного СО в норме и в покое. Определена средняя концентрация СО в выдыхаемом воздухе и альвеолярном воздухе, а также скорость выделения СО с выдыхаемым воздухом в
норме. Обнаружено наличие циркадного ритма в скорости выделения СО с
выдыхаемым воздухом. Продемонстрировано влияние загрязнений атмосферного воздуха экзогенным СО на содержание моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе. Определена динамика выделения СО с выдыхаемым воздухом у курильщиков.
Установлены закономерности и измерены основные параметры динамики выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом у людей и лабораторных животных при дыхании гипероксическими и гипоксическими дыхательными газовыми смесями, а также у лабораторных животных при сочетанном влиянии гипероксии и гиперкапнии и при дыхании газовыми смесями с добавлением аргона.
Определены основные закономерности и измерены основные параметры динамики выделения эндогенного СО при проведении различных физиологических тестов: физической нагрузки различной мощности и длительности, гипервентиляции различной глубины и задержек дыхания различной длительности. Для физической нагрузки продемонстрировано наличие корреляции изменений скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом с рН артериализован-ной крови и с концентрацией лактата в капиллярной крови. Для гипервентиляции обнаружено наличие корреляции изменений скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом с рН артериализованной крови.
Определены средние уровни выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом при ряде заболеваний органов дыхания. В частности продемонстрировано снижение концентрации СО в выдыхаемом воздухе при хроническом обструк-тивном бронхите, фиброзах легких, анемии и бронхиальной астме. В случае идеопатической интерстициальной пневмонии обнаружено уменьшение скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом, коррелирующее с уменьшением диффузионной способности легочной мембраны. Было продемонстрировано значительное увеличение выделения СО над нормой при поражениях печени.
Практическая ценность работы
Разработаны инструментальные методы и средства для автоматизированного мониторинга содержания СО и других параметров дыхания у человека и лабораторных животных.
Сформулированы требования к условиям проведения анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе для целей биомедицинской диагностики.
Продемонстрирована возможность неинвазивного определения ряда важных физиологических параметров (скорости катаболизма гем-содержащих белков в организме, уровня гемоглобина, вариаций эффективности транспорта кислорода к тканям, вариаций кислотно-основного состояния в организме) с помощью анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе.
Показана возможность и эффективность предлагаемого подхода в исследованиях по спортивной и гипербарической физиологии. В частности, установлена связь динамики выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом и лактатом крови при физических нагрузках. Так же разработанные методы могут быть использованы для изучения воздействия на организм индифферентных газов, таких как гелий, аргон и криптон, а также для контроля терапевтического воздействия на организм гипероксических и гипоксических газовых смесей.
Разработанные методы могут быть использованы для целей неинвазив-ной биомедицинской диагностике.
ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Применение методов диодной лазерной спектроскопии эффективно для высоко-чувствительного и высокоселективного анализа и долговременного мониторинга содержания эндогенной моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных в реальном времени.
2. Динамика выделения эндогенной моноокиси углерода с выдыхаемым воздухом является показателем физиологического состояния организма при проведении различных функциональных проб и воздействии измененных факторов газовой среды. Отклонения скорости выделения эндогенного СО от нормы могут использоваться для неинвазивной биомедицинской диагностики.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих международных, всесоюзных, всероссийских и региональных научных конференциях, симпозиумах и семинарах: Международной конференции SPIE "Биомедицинская оптика" (Лиль, Франция, 1994; Барселона, Испания, 1995; Сан-Хосе, США, 1995; Сан-Хосе, США, 1996), Международной конференции SPIE "Передовые технологии для мониторинга окружающей среды" (Денвер, США, 1996), Международной конференции SPIE "Биомедицинские датчики, визуализация и слежение" (Сан-Хосе, США, 1997), V Конференции по биологии при высоких давлениях (С.-Петербург, 1997), 7-ой Всероссийской школе по физиологии дыхания (Бологое, 1998), 11 Международной конференции по авиакосмической медицине и биологии (Москва, 1998), Международной конференции по заболеваниям органов дыхания и астме, (Сан-Диего, США, 1999), II Российской школе для практических врачей "Свободные радикалы и болезни легких" (Рязань, 1999), Конференции "Возможности и перспективы использования индифферентных газов в водолазной практике, биологии и медицине" (Москва, 1999), 11 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Берлин, Германия, 2001), 12 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Стокгольм, Швеция, 2002), 13 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Вена, Австрия, 2003), 14 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Глазго, Великобри-таня, 2004).
Кроме того материалы диссертации были представлены на семинарах ИОФАН им. A.M. Прохорова, семинарах ФИАН им. П.Н. Лебедева, ГНЦ РФ
ИМБП РАН, Института пульмонологии РАМН, Московской медицинской академии, Берлинского технического университета, Берлинского университета им. Гумбольдта, Калифорнийского университета в Санта-Барбаре, Медико-биологического департамента Космического центра им. Дж.Кеннеди, НАСА, Семинаре по лазерной медицине Российской Лазерной Ассоциации и Общемосковском семинаре по проблемам физиологии дыхания и пульмонологии.
Диссертация была апробирована на заседании секции «Экологическая медицина и барофизиология» Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН от 13.04.2005 г.
Публикации
Основные результаты исследований по теме диссертации опубликованы в 17-ти статьях и тезисах докладов на конференциях.
Структура диссертации
Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения, приложения и списка литературы, изложена на 194-ти страницах печатного текста, включает 51 рисунок, 8 таблиц и список литературы из 171 наименований.
Механизмы образования эндогенной окиси углерода в организме
Основным источником образования СО в организме является катаболизм гем-содержащих структур [2], таких как гемоглобин, миоглобин, нейроглобин, цитоглобин, цитохромы, каталаза, пероксидаза, NO-синтаза, триптофанпирро-лаза, гуанилатциклаза. Эндогенная продукция СО при деградации гема была впервые обнаружена Sjostrand [22]. Образование биливердина и молекулы СО при катаболизме происходит за счет ферментативного расщепления порфири-нового кольца гема, рис.1. Этот процесс идет с участием гем-оксигеназы (ГО), цитохрома Р450 редуктазы, NADPH и кислорода [1,23], и приводит к продукции эквимолярных количеств СО и билирубина [24]. Установлено, что перечисленные ферментные системы являются микросомальными [25]. Гемоксиге-наза катализирует реакции, приводящие к разрыву тетрапиррольного кольца с образованием окиси углерода и биливердина. Биливердинредуктаза катализирует превращение биливердина в билирубин [2]. Эти ферменты локализованы в клетках, где идет деградация геминовых структур.
Считается, что процесс превращения гема в биливердин с выделением СО проходит следующие стадии. При функционировании микросомальной цепи транспорта электронов на ее начальном участке осуществляется окисление НАДФ-Н ферментной системой, включающей в себя флавопротеид. Флаво-протеид обладает значительной аутооксидабельностью и при работе цепи именно на этом участке локализуется образование перекиси водорода [26]. Гидроксилирование гема осуществляется ферментативным путем при действии перекиси водорода или активных радикалов. В результате этого образуется а-гидрооксигем. Далее процесс идет спонтанно. Происходит разрыв порфири-нового кольца, приводящий к образованию комплекса биливердин-окись углерода [27]. Этим объясняется прямая корреляция эндогенного уровня СО и содержания билирубина [24,28]. Гем Оксигеназа БИЛИВЕРДИН NADPH Биливердин Редуктаза NADP БИЛИРУБИН ГЕМ
Перечисленные ферменты, катализирующие это окислительное превращение гема, обладают высокой чувствительностью к моноокиси углерода, которая таким образом является естественным регулятором скорости катаболизма геминовых структур. В норме скорость распада последних регулируется по принципу обратной связи и подерживается на относительно постоянном уровне, при этом обеспечивается примерно одинаковый уровень продукции СО в организме [22,29].
В первую очередь гем для гемолиза черпается из: свободного недавно синтезированного гема в тканях его синтезирующих [30,31]; избыточного гема, образовавшегося за счет снижения спроса на него при оксидативных стрессах; гема, избыточно проникающего в клетку при увеличении проницаемости клеточных мембран в результате действия свободных радикалов [32,33]; гема гемопротеинов, разрушенных свободными радикалами [34,35].
Деградация гема гемоксигеназой является основным среди гемовых источников образования СО и составляет 85 % [3]. От 80 % до 90 % гема для этой реакции поставляется стареющими эритроцитами или в результате нарушений эритропоэза. Обновление эритроцитов крови, как известно, происходит в селезенке, костном мозге и печени [6]. За сутки в норме обновляется около 0.8 % всех эритроцитов (-2-Ю11 эритроцитов в сутки), в результате чего разрушается -5.8-1019 молекул гемоглобина. Поскольку в гемоглобине содержится четыре гема, гемолиз одной молекулы гемоглобина приводит к образованию 4-х молекул СО. Это обуславливает образование около 440 мкмоль СО в сутки. Обновление миоглобина, содержащего в отличие от гемоглобина один, а не четыре гема, может дать еще около 30 мкмоль СО в сутки.
Скорость катаболизма таких гем-содержащих структур, таких как миог лобин, нейроглобин, цитоглобин, каталаза, NO-синтетаза, гунилатциклаза, пе роксидаза и цитохромы, и их общее количество в организме точно не извест ны, а следовательно, не ясен их вклад в выделение СО организмом. Он может быть оценен на основании сравнения расчетных и имеющихся эксперимен тальных данных по образованию и выделению СО. Опубликованные к на стоящему времени данные об усредненной за одно дыхание концентрации эн догенного СО, полученные с помощью различных методов регистрации СО в воздухе, позволяют считать, что ее величина для здорового взрослого человека составляет около 1.0 мг/м3. При средней минутной вентиляции легких 8 л/мин это соответствует выделению эндогенного СО с дыханием на уровне 470 мкмоль/сутки. Какая-то часть образующегося в организме СО, по оценкам до 10 % [3], может также выделяться за счет кожного дыхания или с выводимыми организмом жидкостями. Сравнение с оценками скорости выделения СО только за счет катаболизма эритроцитов и миоглобина, которые в сумме дают око ло 460 мкмоль/сутки, показывает, что распад всех остальных гем-содержащих структур (нейроглобина, цитоглобина, цитохромов и содержащих гем ферментов) может давать лишь незначительную долю выделяемого СО, в норме 10-15 %, от его общего количества [36,37]. Существуют также другие источники образования эндогенного СО, несвязанные с разложением гема. В частности, выделение СО может происходить при перекисном окислении липидов [38,39], окислении в присутствии света ряда фотосенсибилизаторов (рибофлавина и искусственных фотосенсибилизаторов) [40], а также за счет деятельности некоторых аэробных бактерий [41]. Однако пока отсутствуют полученные в экспериментах in-vivo результаты, подтверждающие появления эндогенного СО из таких источников его образования в выдыхаемом воздухе.
Аналитические методы для исследований эндогенного СО в выдыхаемом воздухе
Детектирование эндогенного СО в выдыхаемом воздухе в режиме непрерывного и долговременного мониторинга является достаточно сложной аналитической задачей. Это связано с относительно низкой его концентрацией в выдыхаемом воздухе в норме и, напротив, высоким содержанием соединений, мешающих анализу. Используемые для этих целей инструментальные подходы должны обеспечивать возможность детектирования СО в диапазоне концентраций 10 мкг/м3 - 50 мг/м3 при постоянной времени анализа 1-10 с. Предпочтителен прямой анализ без предварительного концентрирования или обогащения выдыхаемого воздуха. Метод должен обладать высокой селективностью и/или быть нечувствительным к содержанию в анализируемой пробе доминирующих атмосферных компонентов типа N2, Ог, НгО и СОг, а также ряда микропримесей таких как, например, Н2, СН4 и Аг.
Арсенал аналитических методов и инструментальных средств, пригодных для решения задачи детектирования эндогенного СО в выдыхаемом воздухе достаточно ограничен. Среди физико-химических методов, которые в той или иной степени могут быть использованы для газового анализа СО могут быть названы следующие: методы химического анализа, масс-спектрометрия, совмещенная с хроматографическим разделением (МС-ГХ), электрохимические сенсоры (ЭХ) и ИК-спектроскопия (ИКС). Последняя включает Фурье-спектроскопию (ФС), оптоакустическую спектроскопию (ОАС), лазерную спектроскопию (ЛС) и фотометрию с применением корреляционных и обычных спектральных фильтров.
Присутствие СО в организме можно также обнаружить, определяя уровень карбоксигемоглобина в крови. Однако, в норме содержание карбоксиге-моглобина в крови составляет менее 0.3 %, в то время как точность биохимических методов анализа крови составляет 0.1 %. Таким образом, данный подход сложно применить для исследований эндогенного СО в организме, он может быть приемлем лишь в случаях резкого повышения содержания СО в организме, например, при отравлении угарным газом или исследовании курильщиков. Кроме того, данный подход является инвазивным и не способен обеспечить мониторинга исследуемых процессов, так как требует отбора проб крови. В связи с этим, далее ограничимся рассмотрением существующих методов газового анализа, которые могли бы быть использованы в исследованиях эндогенного СО в выдыхаемом воздухе, и оценкой их реальных возможностей.
Химические методы детектирования СО основаны на дожигании моноокиси углерода до С02 и дальнейшем определении методами так называемой «мокрой химии» количества образовавшегося в результате этого С02 или потребленного 02. Очевидно, что такой подход не может давать требуемой чувствительности, точности и селективности измерений. Для проведения анализа требуется большое количество исследуемой газовой смеси и чрезвычайно утонченные лабораторные методы химических исследований.
Масс спектрометрия с хроматографическим разделением (МС-ГХ) является наиболее часто применяемым в настоящее время методом качественного и количественного анализа химического состава выдыхаемого воздуха. Газо-хроматографическое разделение пробы применяется, чтобы отделить следы исследуемых веществ от мешающих N2, 02, С02 и Н20. Масс-спектрометр выполняет роль высокочувствительного и высокоточного детектора [84]. Предварительное разделение существенно поднимает точность и селективность детектирования. Обработка регистрируемых масс-спектров производится с помощью компьютеров, что позволяет провести идентификацию сотен веществ, входящих в такую сложную газовую смесь, как выдыхаемый воздух. Кроме того, с помощью ЭВМ осуществляется количественный анализ регистрируемых соединений, контроль за разрешающей способностью хроматографической системы, учитываются «ложные ионы» и возможная интерференция МС-пиков. При использовании специальных методов пробоподготовки достижима чувствительность на уровне 1 ppb. Для простого анализа достаточен небольшой объем выдыхаемого воздуха порядка 10 мл. Этот метод преимущественно применяется для исследований достаточно сложных летучих органических веществ.
Перенос СО из крови в выдыхаемый воздух
При рассмотрении основных закономерностей и моделировании выделения эндогенного СО с выдыхаемым вздухом необходимо принимать во внимание процессы, происходящие в следующих звеньях механизма буферирования и транспорта моноокиси углерода: источники эндогенного СО, внутриклеточные буферные системы (цитохромы, цитоглобины, нейроглобины (Gb)), миог-лобин мышечных тканей (Mb), гемоглобин в артериальной и венозной крови, НЬ, среда, окружающая эти буферные системы, а также газовая среда в альвеолах легких и во вдыхаемом воздухе. Взаимодействие между этими звеньями происходит за счет процессов дыхания, кровообращения и диффузии газов. Степень заполнения буферных систем является функцией интенсивности продукции СО в организме и характеристик окружающей среды, в частности, напряжения СО, Ог, СОг, а также кислотно-основного состояния (рН). При постоянстве характеристик внешней среды (концентраций Ог, СОг и СО во выдыхаемом воздухе) и метаболических процессов в организме, благодаря пульсации кровотока напряжение 02 и СОг в средах организма осциллирует вблизи некоторых стационарных значений. Это влечет за собой периодические изменения количества СО, которое сохраняется на буферных системах, а также того, которое физически растворено в среде. Эти процессы обуславливают возможность для перехода эндогенного СО с буфера на буфер и, в конце концов, для его транспорта в выдыхаемый воздух. Вариации внешних условий или интенсивности метаблических процессов влекут за собой изменения стационарных значений характеристик внутренних сред организма и, следовательно, стационарных уровней содержания СО на буферных системах. Последнее будет проявлятся в изменении скорости выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом.
Модель, описывающая самые общие закономерности транспорта и выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом и представленная в [134], детально изложена в Приложении. Она является развитием модели выделения эндогенного СО с дыханием, разработанной в свое время Кобурном [135]. Основным отличием является то, что наряду с гемоглобином учитывается вклад и других систем, которые буферируют СО — миоглобина, цитоглобинов и ней-роглобинов. В данном разделе ограничимся общим ее описанием, обсуждением основных выводов, вытекающих из модельного рассмотрения и оценкой параметров основных эффектов, предсказываемых моделью. Они будут использованы в дальнейшем при обсуждении полученных экспериментальных результатов.
Перенос эндогенного СО из крови в выдыхаемый воздух осуществляется за счет действия нескольких механизмов.
Во-первых, в легкие поступает венозная кровь, в которой около четверти связей на гемоглобине свободно, т.к. в тканях происходит высвобождение кислорода. Образовавшиеся вакансии в тканевых капиллярах частично занимаются молекулами СО, диффундирующими из тканей и клеток со скоростью F b . Так как скорость потребления кислорода более чем на 4 порядка величины превышает продукцию СО в организме, то доля СО, присоединенного в тканях, существенно меньше, чем количество вакансий на гемоглобине в венозной крови. В этих условиях практически все СО в венозной крови находится в связанном состоянии. Во-вторых, после прохождения легочных капилляров кровь максимально насыщена кислородом. За счет конкуренции за связи на гемоглобине, которая отражается соотношением (1), все присоединенное в тканях СО вытесняется здесь в кровь. В артериальной крови устанавливается определенное соотношение между концентрациями оксигемоглобина [ньо2] Art и карбоксигемогло- бина \HbCO\Art, определяемое напряжениями кислорода РЛп и моноокиси углерода РАп в среде и относительным сродством СО к гемоглобину AHb . В-третьих, поступившее в кровь СО за счет градиента концентраций диффундирует в альвеолярное пространство легких. Важными параметрами для этого процесса являются коэффициент диффузии через легочную мембра СО ну Di и парциальные давления СО по обе стороны мембраны РАг1 и P h . Наконец, в четвертых, за счет вентиляции легких, происходящей со скоростью V(t), при дыхании происходит выделение СО из легких в атмосферу.
Детальное рассмотрение этих процессов в совокупности, проведенное в Приложении, позволяет получить следующее дифференциальное уравнение, устанавливающее связь между перечисленными выше величинами (П15): (НЬ\ A . R Art(0 = Fit «-Т )+ P (/Lf"(0 , I T0t пи ЛГІ V , ПО ч У K(t} V ft (4) где: (Hb) Tot " бщее количество гемовых связей на гемоглобине, Л - число Аво гадро, Ум - молярный объем, Рв - барометрическое давление, S - коэффициент разбавления альвеолярного воздуха.
Наиболее существенным в этом уравнении является то, что переменной в нем является отношение напряжений СО и 02 в артериальной крови. Если бы поток эндогенного СО на гемоглобин в тканевых капиллярах зависел бы только от скорости продукции СО в организме, то этого уравнения было бы достаточно для описания основных закономерностей выделения СО с выдыхаемым воздухом, которые определялись бы в основном состоянием гемоглобинного буфера СО. Этот подход был развит в работах Кобурна [135].
Лазерный анализатор окиси углерода в выдыхаемом воздухе
Таким образом в рамках анной работы была осуществлена разработка методов высокочувствительного анализа и мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, основанных на использовании перестраиваемых диодных лазеров. Был создан автоматизированный комплекс для мониторинга состава выдыхаемого воздуха и параметров дыхания и кровообращения исследований, предназначенного для исследований в области физиологии дыхания. Он включает в себя лазерный анализатор СО, анализаторы 02 и СОг, ультразвуковой измеритель потока газа. Комплекс имеет следующие основные технические параметры. Анализатор СО: время анализа - 5 с; чувствительность - 5 мкг/м3; точность определения концентрации СО - 3 %; объем аналитической кюветы - 1 л; селективность анализа -100%; время непрерывного мониторинга - не ограничено. Анализатор Ог: время анализа - 100 мс; чувствительность - от 0.1 %; точность - 1 % от полной шкалы измерений. Анализатор СОг: время анализа - 100 мс; чувствительность - от 0.01 %; точность 0.2 % всей шкалы измерения. Ультразвуковой измери тель потока газа: диапазон измерений - 0.006-20 л/с; точность измерений 1 %; инерционность - 2-Ю"3 с; сопротивление дыханию - не выше 50 Па; измерения в кислородно-азотно-аргоновой и кислородно-гелиевой средах в диапазоне давлений от 0.1 до 25 МПА при парциальном давлении кислорода от 0.01 до 0.1 МПА и произвольном процентном соотношении азотной и аргоновой составляющих газовой смеси.
Разработаны методы и алгоритмы обработки данных, получаемых в результате мониторинга параметров дыхания, кровообращения и выделения эндогенного СО. В частности, разработаны методы регистрации выделения эндогенного СО в различных экспериментальных условиях на человеке и животных: метод отбора пробы в изолированную емкость для определения среднего количества СО, выделяемого за один выдох, в том числе, при использовании маневра с задержкой дыхания; метода мониторинга концентрации СО в усредненном выдыхаемом воздухе для исследований выделения СО в покое, при дыхании искусственными дыхательными газовыми смесями и при выполнении физиологических тестов; метод мониторинга концентрации СО в альвеоляр ном воздухе; метод определения скорости выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом; метод исследования выделений СО с выдыхаемым воздухом в условиях гипербарии.
Описанные приборы и методы были использованы для исследования основных закономерностей выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом у людей и лабораторных животных.
В данном разделе дается обзор результатов нескольких циклов исследований, цель которых состояла в изучении основных закономерностей выделения СО с выдыхаемым воздухом с помощью описанных выше методов лазерного газоанализа. Фрагментарно эти данные были уже ранее представлены в целом ряде публикаций [134,147-156]. В ходе этих исследований были впервые получены систематические данные, демонстрирующие специфику и динамику выделения эндогенного СО из организма в различных условиях и позволяющие провести сопоставление с модельным описанием изучаемых процессов. Полученные результаты и практический опыт, накопленный в ходе данных исследований, имеют также и существенное методическое значение, поскольку позволяют составить достаточно полное представление о возможностях развиваемого инструментального подхода в применениях к анализу газообразных биомаркеров в выдыхаемом воздухе. В частности, была проведена оценка основных аналитических параметров метода, таких как чувствительность, селективность и быстродействие детектирования, воспроизводимость и достоверность получаемых данных, устойчивость и надежность системы, возможная продолжительность непрерывного анализа, чувствительность получаемых результатов к изменению внешних факторов. Были опробованы различные способы отбора проб выдыхаемого воздуха, включая анализ в режиме мониторинга и при дистанционном отборе проб, отбор проб в контейнеры, сочетание с дыханием искусственными дыхательными смесями, отбор проб из воздушной среды барокомплексов в экспериментах по гипербарической физиологии, совмещение с аппаратом искусственного дыхания в условиях экстренной терапии. Разработанные методы были испытаны в применении к различным объектам и условиям анализа. В частности, они были использованы для исследований человека, лабораторных животных и растений.
