Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные аспекты иммунопатогенеза системной склеродермии, роль активных форм кислорода и антиоксидантной системы ... 14
1.1 Физиологическая и патофизиологическая роль активных форм кислорода 14
1.2 Глутатионпероксидаза, её структура и функции 27
1.3 Современные представления об иммунопатогенезе системной склеродермии, роль активных форм кислорода и антиоксидантной системы 44
Глава 2. Клиническая характеристика обследованных больных и здоровых лиц 54
2.1. Больные системной склеродермией 54
2.2. Здоровые лица 65
Глава 3. Материалы и методы 66
3.1. Получение образцов исследуемого материала 66
3.2. Иммунологические методы исследования 66
3.2.1. Характеристика антигена 66
3.2.2. Иммобилизация фермента 66
3.2.3. Определение антител к глутатионпероксидазе иммуноферментным методом с использованием гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами 68
3.3. Определение активности глутатионпероксидазы 68
3.4. Общеклинические и иммунологические методы исследования .69
3.5. Статистическая обработка полученных результатов 71
Глава 4. Активность глутатионпероксидазы и уровень антител к ней у здоровых лиц 72
Глава 5. Активность глутатионпероксидазы и уровень антител к ней у больных системной склеродермией 73
5.1. Активность глутатионпероксидазы и уровень антител к ней у больных системной склеродермией с различной степенью активности заболевания 74
5.2. Активность глутатионпероксидазы и уровень антител к ней у больных системной склеродермией с различным характером течения заболевания 80
5.3. Активность глутатионпероксидазы и уровень антител к ней у больных системной склеродермией с различной стадией заболевания 82
5.4. Активность глутатионпероксидазы и уровень антител к ней у больных системной склеродермией с различными клиническими проявлениями 85
5.5. Влияние терапии на активность глутатионпероксидазы и антител к ней у больных системной склеродермией 90
Глава 6. Диагностическое значение активности глутатионпероксидазы и антител к ней при системной склеродермии 93
Глава 7. Обсуждение результатов 95
Выводы 110
Практические рекомендации 111
Список литературы 112
- Современные представления об иммунопатогенезе системной склеродермии, роль активных форм кислорода и антиоксидантной системы
- Иммунологические методы исследования
- Определение антител к глутатионпероксидазе иммуноферментным методом с использованием гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами
- Активность глутатионпероксидазы и уровень антител к ней у здоровых лиц
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Системная склеродермия (ССД) является полисиндромным воспалительным заболеванием, клинические проявления которого варьируют в диапазоне от мягко протекающего недуга с преимущественным поражением кожи, опорнодвигательного аппарата и сосудистой патологии по типу облитерирующей микроангиопатии до тяжелого инвалидизирующего поражения с развитием полиорганной недостаточности [17,23,25,26,81].
ССД является относительно редкой патологией с первичной заболеваемостью 2,7 — 12 случаев на 1 000 000 населения в год, тем не менее, трудно переоценить ее социально-экономическое значение.
Преимущественное поражение лиц трудоспособного периода жизни, высокий процент инвалидизации обуславливают большие экономические потери, включающие высокую стоимость диагностики и лечения, выключение больных из сферы производства, затраты на социальное обеспечение работающих пациентов и инвалидов [32,33,45,69,84,196,218].
За последние десятилетия произошел значительный прогресс в представлениях о ССД: исследованы патогенетические механизмы, детально изучены клиника и эволюция заболевания, разработаны основы диагностики и классификация, создана программа патогенетической терапии с дифференцированным использованием антифиброзных, иммуномодулирующих и сосудистых средств [23,24,26,71,81,141,174,237].
Несмотря на достигнутые успехи, прогноз при системной склеродермии остается зачастую неблагоприятным: согласно статистике,
40% больных с острым и подострым течением погибает в течение первых 5 лет заболевания, 70% — в течение 10 лет [3,25,51,196]. Исходя из этого, актуальными задачами для клиницистов являются своевременная постановка диагноза, назначение адекватной терапии и объективная оценка ее эффективности. Только выполнение всех трех задач дают возможность модифицировать болезнь и повлиять на ее исход.
В числе основных задач, инициированных в 2000-2010 гг. под эгидой ВОЗ Всемирной декады по заболеваниям, поражающим двигательный аппарат человека (Bone and jont decade), были названы дальнейшее изучение патогенетических механизмов ревматических заболеваний, совершенствование и внедрение в практику новых методов ранней диагностики и лечения с учетом не только клинической, но и экономической эффективности и целесообразности [69,84].
Как показали новейшие разработки в иммунодиагностике ревматических заболеваний, иммуноферментные методы анализа (ИФА) с использованием магнитоуправляемых сорбентов на основе антигенов нуклеиновой, липидной и белковой природы в полной мере отвечают указанным требованиям. Неоспоримые преимущества метода заключаются, в первую очередь, в повышении стабильности иммобилизированного биополимера, что делает его устойчивым к различным химическим и физическим воздействиям. Помимо этого, иммобилизация биологически активных веществ в поверхностном слое гранулы создает высокую концентрацию антигена именно в реакционноактивной зоне, тем самым повышая чувствительность твердофазных методов анализа. Включение магнитного материала в гранулы дает возможность ускорить и упростить манипуляции на всех этапах исследования, улучшая качественные характеристики определений и увеличивая число обрабатываемых проб. И, наконец, повторное использование сорбента после регенерации ведет к значительному экономическому эффекту [21,31,39].
Гранулированные препараты с магнитными свойствами уже были использованы для усовершенствования иммунодиагностики ССД и выявления антител к кардиолипину, каталазе, фибронектину и другим биополимерам. Как показали исследования, преимущества метода ИФА с применением иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов (ИГАП) делают его не только экономичным и легко применимым в практической медицине, но и позволяют решить вопросы ранней диагностики ревматических заболеваний благодаря высокой чувствительности и специфичности [59,60,74,88,95].
В настоящее время продолжается поиск маркеров системного склероза, позволяющих дифференцировать его с другими диффузными болезнями соединительной ткани, ревматоидным артритом, псевдосклеродермическими и паранеопластическими синдромами, а также прогнозировать клиническую форму и течение заболевания. В этом свете представляют интерес результаты исследования роли активных форм кислорода в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Предполагается, что основное значение свободных радикалов при данной патологии связано с их способностью повреждать белки, липиды, ДНК, придавая им свойства аутоантигенов и провоцируя выработку антител.
Достигается это значительным усилением выработки активных форм кислорода (перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др.), которые приводят к деполимеризации гиалуроновой кислоты, окисляют белки, вызывают перекисное окисление липидов, стимулируют высвобождение протеолитических ферментов и вазоактивных аминов. Считают, что именно активные формы кислорода (АФК) ответственны за процессы инактивирования и трансформации ферментов, угнетения функциональной активности иммунокомпетентных клеток [37,38,57,158,188].
Естественным препятствием патологическому воздействию АФК . на собственные ткани является мощная антиоксидантная система организма (АОС), включающая в себя ферментные и неферментные звенья. Основными энзимными компонентами АОС считают глутатионпероксидазу, супероксиддисмутазу, глутатионредуктазу, каталазу и церулоплазмин. Они способны нейтрализовать высокоактивные супероксидные анионы, перекись водорода, гидроперекиси жирных кислот, предотвращая накопление особо токсичных вторичных продуктов перекисного окисления липидов [37,38,88,112,124,134,148,158].
В клинической практике использование прямых определений АФК, гидроперекисей и других продуктов свободнорадикальных реакций в биологических жидкостях затруднено из-за технических сложностей. Однако об интенсивности свободнорадикальных процессов можно судить по состоянию и напряженности реакций антиоксидантнои защиты. Согласно данным ряда авторов, при ревматической патологии наблюдается накопление вторичных токсических продуктов свободнорадикальных реакций вследствие дисбаланса между продукцией и утилизацией АФК. В качестве одной из причин функциональной недостаточности энзимов-антиоксидантов при аутоиммунных заболеваниях считают образование антител к ним [12,37,38,40,74,88,95].
Из всей группы ферментов АОС наименее изученным объектом иммунного ответа при ССД является глутатионпероксидаза (111). В связи с этим представляется актуальным исследовать закономерности антителообразования к глутатионпероксидазе при системной склеродермии, используя иммобилизированную форму фермента. Высокая чувствительность модифицированной методики ИФА дает возможность усовершенствовать способы диагностики системного склероза, выяснить отдельные механизмы патогенеза данного заболевания и обозначить перспективы патогенетической терапии.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящего исследования являлось усовершенствование иммунологической диагностики и оценки эффективности лечения системной склеродермии с помощью иммобилизированной формы глутатионпероксидазы.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
1.Получить иммобилизированную форму глутатионпероксидазы, изучить ее физико-химические свойства;
2.Адаптировать иммуноферментный метод анализа с использованием иммобилизированной глутатионпероксидазы к изучению образования антител к этому ферменту;
3.Изучить активность глутатионпероксидазы и содержание антител к этому ферменту у больных системной склеродермией и здоровых лиц. Исследовать данные показатели и корреляционные связи между ними у больных ССД в зависимости от активности, стадии, длительности, характера течения заболевания и висцеральных поражений;
4.Изучить динамику антителообразования к глутатионпероксидазе в процессе стационарного лечения.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые для диагностики ССД созданы и применены в варианте иммуноферментного метода анализа иммобилизированные препараты глутатионпероксидазы. В ходе работы в сыворотках крови больных ССД обнаружены антитела к глутатионпероксидазе. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных антител в сыворотке крове здоровых лиц. Выявлена достоверная корреляция между содержанием антител к ГП и активностью патологического процесса. Установлено, что поражение сердечно-сосудистой системы и легких при ССД сопровождается максимальными значениями исследуемых антител. Выявлены обратные корреляционные связи между активностью ГП и антителами к ней. Определена способность исследованных показателей к изменению под влиянием проводимой терапии, что обеспечивает возможность оценки ее эффективности.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к ГП на основе иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами. Выявление антител к ГП в предложенной методике ИФА может быть использовано в качестве дополнительного теста для диагностики ССД, оценки активности патологического процесса и прогнозирования клинического варианта заболевания. Обнаружение антител к ГП на начальных сроках заболевания позволяет использовать их определение для ранней диагностики ССД. Динамика изученных показателей дает возможность судить об эффективности проводимой терапии.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ На защиту выносится положение о возможности определения антител к ГП с помощью методов иммуноферментного анализа на основе иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами у больных ССД. Исследование антител к ГП может быть использовано в качестве дополнительных тестов для диагностики ССД, выделения клинических вариантов заболевания и уточнения степени активности патологического процесса. Динамика этих показателей может служить для оценки эффективности проводимой терапии.
ПУБЛИКАЦИИ Основные положения диссертации изложены в 6 печатных работах, из которых 4 - в центральной и 2 - в местной печати. Материалы диссертации были представлены на ежегодной научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ (2008 г.), II Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007 г.), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008 г.).
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ Методы определения антител к ГП с помощью иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрены в МУЗ ГКБ №25 г.Волгограда.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I — обзора литературы, в которой изложены современные аспекты иммунопатогенеза системной склеродермии, участии в ее развитии активных форм кислорода и антиоксидантной системы; части II — собственных исследований, состоящей из 6 глав, содержащих клиническую характеристику больных, методики исследования, полученные результаты, их обсуждение, выводы, практические рекомендации и приложения. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 7 рисунками, приведено 2 выписки из историй болезни.
Указатель литературы содержит 253 источника, в том числе 95 - отечественных и 158 - зарубежных.
Современные представления об иммунопатогенезе системной склеродермии, роль активных форм кислорода и антиоксидантной системы
Системная склеродермия - прогрессирующее полисиндромное заболевание с характерными изменениями кожи, опорно-двигательного аппарата, внутренних органов (легких, сердца, пищеварительного тракта, почек) и распространенными вазоспастическими нарушениями в форме синдрома Рейно. В основе заболевания лежит поражение соединительной ткани с преобладанием фиброза и сосудистая патология по типу облитерирующей микроангиопатии [ 17,23,47,77,81,130,135,156,196,212].
ССД, или системный прогрессирующий склероз, как самостоятельная нозологическая единица была выделена во второй половине XX века, сменив «дерматологический» этап учения о склеродерме (более 300 лет) «терапевтическим». С этого времени началось интенсивное изучение заболевания с интернистских позиций. В последующем прогресс в изучении ССД и близких состояний с выделением различных клинических форм, процесс дифференцировки и уточнение сущности нозологии наряду с появлением все новых форм индуцированной склеродермии привели к понятию о склеродермической группе болезней [23].
Женщины болеют ССД в среднем в 7 раз чаще, чем мужчины; у детей и у взрослых старше 45 лет преобладание женского пола менее выражено. Заболевание чаше диагностируется в возрасте 30—50 лет, однако, его начальные проявления нередко относятся к более раннему периоду, что позволило выделить также ювенильную форму системного склероза [14,51,81].
Этиология ССД сложна и недостаточно изучена. Предполагается мультифакториальный генез ССД, обусловленный взаимодействием неблагоприятных экзо- и эндогенных факторов с генетической предрасположенностью к заболеванию. Наряду с ранее обсуждавшейся ролью инфекции, охлаждения, вибрации, травм, стресса и эндокринных сдвигов в последнее время особое внимание обращено на триггерное действие химических агентов (кремниевая пыль, силикон, органические растворители, хлорвинилы) и отдельных лекарственных средств (блеомицин), наиболее демонстративное в случаях индуцированной склеродермии [14,23,51,67,81].
Благодаря современным исследованиям расшифрованы и некоторые генетические механизмы предрасположенности к ССД, что ранее аргументировалось наличием семейных случаев ССД и близких заболеваний, увеличением иммунных и других сдвигов у здоровых родственников пробандов. Подтверждено наличие хромосомной нестабильности у больных ССД. Выявлено сочетание определенных антигенов и аллелей системы гистосовместимости (HLA) с ССД: HLA-A9, B8, В 27, В35, В 40, DR1, DR3, DR5, DR11, DR52a и С4А, варьирующее в разных популяциях, что, по современным данным, может быть связано с хромосомным дефектом теломер [24,51,67,144].
Вирусная концепция ССД в настоящее время остается недостаточно обоснованной [23]. Однако не исключается, что выявляемые при заболевании иммунные и микроциркуляторные нарушения, а также хромосомная нестабильность могут быть обусловлены воздействием вирусного или вирусиндуцированного агента. Предполагается, что в роли индукторов патологического процесса могут выступать ретровирусы и герпесвирусы со свойственной им склонностью к персистенции и образованию латентных и эндогенных форм, активирующихся под воздействием различных факторов (химических, биологических и др.) [23,24,80].
Новая теория микрохимеризма о роли фетальных прародительских клеток в генезе ССД рассматривает развитие аутоиммунных болезней с позиций трансплантационной биопсии. Толчком к созданию теории стал факт частого развития заболевания в послеродовый период. Было показано, что в этих случаях наблюдается персистенция фетальных клеток в организме матери с развитием патологической реакции [141,178]. Установлено также, что появление генотипа клеток-химер происходит в условиях латентной инфекции вирусом Эпштейна-Барр посредством усиления дифференцировки В-лимфоцитов, содержащих фрагменты LMPlb и LMP2A вирусного генома [41].
Основу патогенеза ССД составляют нарушения иммунитета, фиброзообразования и микроциркуляции, взаимодействующие на уровне основных клеточных (иммунокомпетентные клетки, фибробласты, эндотелий, клетки крови) и рецепторно-лигандных систем (молекулы адгезии, факторы роста, интерлейкины и др.) [1,23,25,26,77,111,143,167,168,174,229]. У больных ССД выявляется широкий спектр разнообразных нарушений клеточного и гуморального иммунитета, включая признаки Т клеточной активации и диерегуляции в системе ТЫ- и Тп2-клеток, повышение экспрессии отдельных иммунорегуляторных и фиброгенных цитокинов, дефекты антителозависимой клеточной цитотоксичности и лимфоцитарного ответа на митогены, сопряженные с гипергаммаглобулинемией, тканевой лимфо-плазмоцитарной инфильтрацией, появлением антинуклеарных антител и циркулирующих иммунных комплексов. Это проявляется обнаружением специфических антинуклеарных и антинуклеолярных аутоантител - антицентромерных (АЦА), антитопоизомеразных (АТА) или aHTH-Scl-70- и РНК-антител, а также антинейтрофильных цитоплазматических (АНЦА), антиэндотелиальных, антител к различным компонентам соединительной ткани и др. [14,24,50,59,67,77,110,111,123].
Иммунологические методы исследования
Для проведения биохимических и иммунологических исследований образцов крови, ее забор осуществляли при пункции вены в утренние часы натощак. Кровь забиралась в объеме 3 - 5 мл и помещалась в стеклянные пробирки. После формирования и ретракции сгустка в термостате при t = 37±1С в течение 60±5 мин, стеклянной палочкой отделяли сгусток от стенок пробирки и подвергали центрифугированию при 3000 об/мин в течение 15 мин (лабораторная центрифуга ЦЛК-1). Затем отбирали сыворотку и помещали в аликвотах по 0,5 мл в пластиковые микроцетрифужные пробирки Eppendorf, которые хранили до момента анализа при t = -24С. Повторного размораживания и замораживания образцов не допускалось.
В качестве антигена использовали препарат глутатионпероксидазы производства НПО "РЕАХИМ" серия 186-68 с активностью 380 ЕД/мг и концентрацией белка 94,5 мг/мл.
Для получения иммобилизированной формы фермента использовали раствор с концентрацией 1,4 мг/мл по белку. Иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля (Гонтарь И.П. и соавт., 2002 г.) [21]. Полученные магнитосорбенты имели правильную сферическую форму с размером частиц от 10 до 100 мкм.
Антитела к ГП определяли методом непрямого иммуноферментного анализа, основанного на использовании меченных ферментом специфических иммуноглобулиновых препаратов, позволяющих по интенсивности окраски субстрата судить о количестве антител в сыворотке.
Анализ проводился в полистироловых планшетах Immulon 2 (Dynatech Labs, Германия). Неспецифическое связывание блокировали инкубацией 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) на карбонат-бикарбонатном буферном растворе с рН=9,6. Следующим этапом в лунки планшета вносили по 10 мкл 10% взвеси ИГАП, выполняющего роль специфического антигена. Исследуемую сыворотку разводили 1:200 в 0,01М фосфатном буферном растворе с рН=7,4, содержавшим 1% БСА и вносили в дубликатах по 200 мкл в лунки микротитрационного планшета, параллельно ставили контроль на субстрат и конъюгат. Планшеты инкубировали в течение 120±2 мин в термостате при 37±1С на магнитной мешалке, после чего выполняли трехкратную отмывку ЗФР с 0,05% Твин-20. Связавшиеся антитела выявляли с помощью моноклональных диагностических антител против иммуноглобулинов человека, конъюгированных со щелочной фосфатазой производства ЗАО «Биосан» (Новосибирск, Россия). Данные антитела использовали в рабочем разведении 1:5000, которое определяли в предварительных опытах, и вносили по 100 мкл в каждую лунку. После 60-минутной инкубации содержимое лунок удаляли и трехкратно промывали ЗФР с 0,05% Твин-20 в течение 3 минут.
В качестве хромогена использовали раствор нитрофенилового-пара эфира фосфорной кислоты динатриевой соли (ч.д.а., Германия) в концентрации 1 мг/мл в субстратном буфере (1М диэтаноламин, 0,5 мМ MgCl2, рН=9,8), который вносили по 100 мкл в каждую лунку, используя многоканальную пипетку. Развивалось окрашивание, интенсивность которого возрастала с увеличением количества антител.
Результаты учитывали на многоканальном микропланшетном спектрофотометре при длине волны 405 нм. Полученные значения выражали в единицах оптической плотности (ЕОП). Окончательный результат определяли путем вычитания от среднего значения измеренных оптических плотностей исследуемого образца среднего значения фона, измеренного в лунках, содержащих аналогичный объем 0,01М фосфатного буферного раствора (рН=7,4) с 1% БСА. Наличие антител считалось положительным при превышении значений оптической плотности на 2 стандартных отклонения от средних значений контрольной группы.
Определение антител к глутатионпероксидазе иммуноферментным методом с использованием гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами
Для определения активности ГП в плазме крови мы применяли метод Flohe L., Ganzler W.A, 1984 [149]. При расчете активности фермента использовали рекомендации B.C. Асатиани [7]. ГП катализирует реакцию инактивации перекиси водорода и гидроперекисей липидов (ROOH) в присутствии восстановленного глутатиона (GSH) с образованием воды и окисленного глутатиона (GSSG): По активности фермента представляется возможным судить о способности антирадикальной защиты на уровне образования гидроперекисей липидов, образующихся в реакциях ПОЛ. Принцип определения ГП активности основан на способности окисления GSH в окисленную форму GSSG с помощью глутатионредуктазы (ГР). 1 мкМ ГР соответствует 12 мкМ GSH. Необходимые реагенты: ЭДТА, ГР, GSH, ГПТБ. Инкубационная смесь: 1 мМ ЭДТА;0,2 ЕД/мл ГР; 0,85 мМ GSH; 0,5 мМ ГПТБ; 500 мМ фосфатного буфера, рН 7,4; 0,2 мл плазмы крови. Конечный объем 3 мл. Температура инкубации 37С, продолжительность инкубации 10 минут. Ход определения: В пробирку добавляется инкубационная смесь без биологического материала.
После инкубации и добавления 0,2 мл плазмы на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 340 нм в кварцевых кюветах Ь=1,0см ежеминутно в течение 3 минут ведется измерение экстинкции против контроля (3 мл 500 мМ фосфатного буфера рН 7,4). Расчет активности фермента проводится по формуле: где 3 - объем инкубационной смеси (мл), 60 - время реакции (мин), 6,22 коэффициент экстинкции ГР при 340 нм (см /мкМ), 0,2 - объем плазмы в опытной пробе (мл). Единица активности ГП - это количество фермента, которое при t = + 37С за 1 час окисляет 1 мкМ GSH и она выражается в ЕД/мл. Иммуноглобулины классов A, G и М определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини [44], циркулирующие иммунные комплексы - методом преципитации с полиэтиленгликолем 6000 по Haskova в модификации Б.А. Лемперта [56]. Антинуклеарный фактор определяли по Кунсу [44] с использованием в качестве субстрата криостатных срезов печени грызунов в качественном варианте с выделением типа и интенсивности свечения. Для выявления С-реактивного белка использовали метод иммунопреципитации в капиллярах [55].
Для определения антител к нативной ДНК был использован непрямой твердофазный иммуноферментный анализ [34]. Общеклинические лабораторные исследования выполнялись по методикам, принятым в МУЗ «Городская клиническая больница №25» г. Волгограда и описанным ранее [55]. У больных проводился общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы, тромбоцитов (по показаниям - ретикулоцитов), общий анализ мочи с количественным определением протеинурии и микроскопическим исследованием, биохимические анализы крови (определение билирубина, аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз, тимоловой пробы, общего белка, холестерина, мочевины и креатинина сыворотки). По показаниям проводилось исследование коагулограммы. Обработка полученных результатов проводилась с использованием программных пакетов «STATGRAPHICS 3,0», «Excel 5,0», «STATISTICА 6,0», а также по оригинальным программам с использованием формул, приведенных в соответствующих руководствах [10,35,92].
Активность глутатионпероксидазы и уровень антител к ней у здоровых лиц
Для определения активности ГП в плазме крови здоровых лиц мы применяли метод Flohe L. и Gunzler W.A., 1994 г. Уровень антител к ГП в сыворотке крови исследовали методом ИФА с использованием ИГАП (Гонтарь И.П. и соавт., 2002 г.).
Среднее значение активности ГП в контрольной группе составило 0,150±0,083 ЕД/мл, а амплитуда колебаний - 0,087 - ОД98 ЕД/мл. Как видно из представленных в таблице 9 данных, не выявлено определенных зависимостей между активностью изучаемого фермента у здоровых лиц в различные возрастные периоды. Не обнаружено и значительных различий изученных показателей в зависимости от пола (р 0,05).
Средняя концентрация антител к ГП в сыворотках крови здоровых лиц составила 0,045±0,003е.о.п. Уровень нормальных показателей определяли как сумму среднего и двух среднеквадратических отклонения (Х + 2а). Исходя из этого, значения экстинции 0,0785 в ELISA-тесте с использованием ИГАП были приняты за верхнюю границу нормы.
У 47 больных ССД, обследованных нами, активность ГП в плазме крови при поступлении на стационарное лечение колебалась от 0,034 до 0,195 ЕД/мл и составила в среднем 0,082±0,006 ЕД/мл, т.е. была достоверно ниже аналогичного показателя у здоровых лиц (р 0,05). При этом достоверного различия между активностью ГП в плазме крови больных ССД разного возраста и пола выявлено не было (р 0,05).
Содержание сывороточных антител к ГП у больных ССД варьировало в пределах от 0,056 до 0,139 е.о.п. Медиана значения составила 0,097е.о.п., что достоверно превышало данный показатель в контрольной группе (р 0,001). Антитела к ГП выявлены у 17 больных (36,1%). Уровень исследуемых антител не зависел от возраста и пола пациентов. Отмечалась достоверная корреляционная связь между содержанием AT к ГП и такими показателями активности патологического процесса, как уровень циркулирующих иммунных комплексов (г=0,38, р 0,04) и альфа2-глобулиновой фракции (г=0,27, р 0,05).
У больных с наличием антител к ГП отмечено заметное снижение активности ГП (0,049±0,005 ЕД/мл, р 0,01), в то время как при их отсутствии оно было статистически незначимым (0,128±0,006 ЕД/мл, р 0,05). Для выяснения возможного влияния антителообразования к ГП на активность изучаемого фермента был выполнен анализ данных показателей раздельно для групп больных с наличием антител к ГП и без наличия антител в зависимости от активности склеродермического процесса, длительности, стадии и характера течения заболевания.
Нами была проанализирована активность ГП и содержание антител к ней у больных с различной степенью активности ССД. Для этого исследуемая группа больных была разделена на 2 подгруппы: первая (24 человека) — с I (минимальной) степенью активности, вторая (23 человека) - с II (умеренной) и III (максимальной) степенями активности патологического процесса.
При поступлении в стационар в группе больных ССД отмечалось уменьшение активности ГП в плазме крови по сравнению со здоровыми лицами (табл. 10).
У больных с низкой активностью ССД снижение данного показателя было незначительным (р 0,05), в то время как при умеренной и высокой активности заболевания различия между опытной и контрольной группами были статистически достоверными (р 0,02). Сравнительный анализ показателей активности ГП у пациентов рассматриваемых клинических подгрупп также выявил статистически достоверную разницу между ними (р 0,05).
Концентрация антител к ГП у больных с различной степенью активности ССД при поступлении на стационарное лечение была достоверно выше уровня аналогичного показателя у доноров (р 0,05). Имела место отчетливая тенденция к росту содержания аутоантител с повышением активности патологического процесса (табл. 9), что обусловило статистически достоверную разницу между подгруппами больных с минимальной и умеренно-максимальной степенью активности заболевания (р 0,05).
При раздельном анализе показателей ферментативной активности удалось установить, что в группе больных ССД без антител к ГП не отмечалось статистически значимого снижения активность ГП при поступлении в стационар (р 0,05). При наличии же антител к ГП снижение энзимной активности во всех группах было достаточно убедительным (р 0,05) и наиболее выражено для максимальной активности ССД (р 0,001) (рис.4).
Измерение активности ГП у больных с низкой активностью ССД перед выпиской из стационара показало, что на фоне общего клинико-лабораторного улучшения отмечается положительная динамика изучаемого показателя крови, в частности, некоторое повышение активности ГП (р 0,05). Сравнивая показатели крови больных с низкой активностью ССД при выписке из стационара с аналогичными показателями здоровых лиц, выявлено, что активность плазменной ГП в обеих группах практически не имеет достоверных различий. У больных с умеренной и высокой активностью заболевания в завершение курса лечения выявлено статистически значимое повышение активности ГП по сравнению с исходным уровнем (р 0,05).
В процессе лечения происходило достоверное снижение уровня аутоантител к ГП у пациентов с различными степенями активности патологического процесса (р 0,05). В группе больных ССД с низкой активностью патологического процесса данный показатель нормализовался, а у больных с умеренной и высокой активностью ССД лишь наметилась тенденция к их нормализации (табл. 9).
У больных ССД без антител к ГП через 3-4 недели от начала лечения отмечалось повышение активности фермента по сравнению с исходными значениями, однако выявленная разница не была статистически достоверной (р 0,05). При наличии антител к ГП динамика показателей в процессе лечения была статистически значимой (р 0,05), однако по сравнению с группой доноров отмечалось снижение активности ГП, обратно пропорциональное уровню исследуемых аутоантител. В качестве иллюстрации приводим выписку из истории болезни №4962.
Больная М-ва Н.А., 55 лет. Находилась на стационарном лечении в ревматологическом отделении МУЗ ГБ № 1 г.Волжского с 14.03.08 по 24.04.08г. Клинический диагноз: системная склеродермия, подострое течение, активность III, с поражением кожи (диффузный индуративный отек, склеродактилия), суставов (полиартрит, ФНС 2 - 3), мышц (полимиозит), легких (правосторонний адгезивный плеврит), синдромом Рейно.
Жалобы при поступлении: на выраженную слабость, повышение температуры тела до 37,6С; похудание на 12 кг в течение 6 месяцев, отечность коленных суставов, кистей, боли и слабость в мышцах верхнего плечевого пояса и нижних конечностей; отечность лица, зябкость в кистях и стопах, онемение кончика языка.
Анамнез заболевания: больной себя считает около полугода, когда впервые возникли боли в коленных суставах и кистях, в мышцах верхних и нижних конечностей, субфебрилитет, стала терять вес. Ухудшение - около 1,5 месяцев: появился плотный отек лица, груди, конечностей, нарушение функции суставов. При амбулаторном обследовании выявлено повышение СОЭ до 40 мм/ч, РФ 1: 8. С диагнозом: системная склеродермия госпитализирована в ревматологическое отделение МУЗ «ГБ № 1 им. С.З. Фишера».
Объективный статус при поступлении: общее состояние средней тяжести. Т — 36,8С. Походка щадящая. В подмышечных областях, под молочными железами кожа гиперемирована с цианотичным оттенком. Пальмарная эритема. Плотный, «стекловидный» отек лица, шеи, кистей, голеней и стоп. Склеродактилия. Кисти в кулаки не сжимает. Умеренно выраженная экссудация в коленных суставах. Объем движений ограничен (сгибание до 70%). Болезненность при пальпации мышц плечевого пояса. Отведение в плечевых суставах ограничено до 90 из-за мышечной слабости. Периферические лимфоузлы не увеличены.
![Клинико-диагностическое значение определения антител к фибронектину у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента [Электронный ресурс]](/i/i/4424/196012.png "Клинико-диагностическое значение определения антител к фибронектину у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента [Электронный ресурс] Кочнева Любовь Ивановна")
