Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Некоторые аспекты системной склеро дермии 11
Глава 2. Медико-биологическая роль энзимов и метаболитов адениловой ветви пурино вого метаболизма 20
Глава 3. Клиническая характеристика больных 38
3.1. Больные системной склеродермией 38
3.2. Больные с бляшечной склеродермией 43
Глава4. Методы исследований 45
4.1. Выделение лимфоцитов, эритроцитов, их подсчет и приготовление лизатов клеток 45
4.2. Определение активности аденозиндезаминазы 48
4.3. Определение активности АМФ-дезаминазы 51
4.4. Определение активности адениндезаминазы 52
Глава 5. Активность энзимов в крови здоровых людей 55
Глава 6. Энзимные исследования у больных системной склеродермией 61
6.1. Активность энзимов в крови больных ССД с I степенью активности процесса 71
6.2. Активность энзимов в крови больных ССД с II степенью активности процесса 87
6.3. Активность энзимов в крови больных ССД с III степенью активности процесса 101
6.4. Энзимные исследования у больных очаговой (бляшечной) склеродермией 130
Обсуждение 136
Выводы 162
Практические рекомендации 165
Список литературы 166
Приложение 205
- Некоторые аспекты системной склеро дермии
- Больные с бляшечной склеродермией
- Определение активности АМФ-дезаминазы
- Активность энзимов в крови здоровых людей
Введение к работе
Актуальность проблемы
Системная склеродермия (ССД) является относительно редким заболеванием (первичная заболеваемость от 3,7 до 19,0 на 1 миллион населения в год), но, несмотря на это, с учетом ежегодной прибавки больных, болезнь приносит значительный материальный ущерб обществу, так как поражает людей, преимущественно женщин, в наиболее трудоспособном возрасте (30 — 45 лет), характеризуется тяжелым инвалидизирующим и прогрессирующим течением, значительно сокращающим продолжительность жизни, и поэтому борьба с этим заболеванием является довольно значимой и актуальной медико-социальной проблемой.
Трудности борьбы с ССД усугубляются разноречивыми гипотезами об этиологии этого заболевания, неясностью многих патогенетических механизмов ССД, многообразием терапевтических подходов и их недостаточной эффективностью, отсутствием методов профилактики.
Вследствие клинического полиморфизма дебюта заболевания под маской многих заболеваний, особенно кожных, больные часто наблюдаются врачами разных специальностей. Чаще всего под наблюдение врача-ревматолога больные попадают в том периоде, когда болезнь уже проявилась различными висцеритами и добиться регресса последствий эволюции болезни, практически, уже невозможно, и основной задачей врача на этом этапе становится замедление прогрессирования патологического процесса или его прерывание. Но это также является непростой задачей, так как течение ССД чаще всего хроническое, с трудноопределяемыми клиническими ремиссиями, а в арсенале врача довольно мало диагностических средств, позволяющих надежно разграничить периоды клинической ремиссии и минимальные субклинические проявления активности патологического процесса. Поэтому поиск новых клинических и параклинических методов, способствующих своевременному распознаванию вялотекущих форм активного «склеродермиче-
6 ского» процесса, даже у больных с заведомо известным диагнозом ССД, является актуальной задачей, так как своевременно назначенная адекватная терапия является гарантом быстрого купирования патологического процесса и достижения клинической ремиссии.
Учитывая, что ССД сопровождается выраженными метаболическими и иммунологическими нарушениями (8, 25, 42, 56, 57, 68, 75, 81), перспективным направлением в решении диагностических и патогенетических проблем, как нам представляется, является изучение пуринового метаболизма (ПМ) при ССД с помощью определения активности энзимов, катализирующих реакции метаболизма пуринов.
Известно, что пуриновые метаболиты принимают участие в синтезе нуклеиновых кислот, белка, в созревании, пролиферации и дифференциации иммунокомпетентных клеток, регуляции тонуса кровеносных сосудов, а так же во многих жизненно важных функциях организма (29, 31, 100, 119, 165), а энзимы, регулирующие реакции обмена пуринов, являются весьма чувствительными индикаторами изменений метаболических, воспалительных и иммунных процессов в организме.
В настоящее время имеется уже достаточно много данных о нарушениях ПМ и выраженных изменениях активности ферментов этого цикла при таких ревматических заболеваниях, как остеоартроз (ОА) (4, 43, 65, 66, 93), ревматоидный артрит (РА) (4, 6, 44, 66, 93), системная красная волчанка (СКВ) (67, 72, 73, 74, 85), но большинство этих работ посвящено исследованию активности энзимов в сыворотке крови и имеют диагностическое значение, не раскрывая роли этих ферментов в патогенезе заболевания.
Учитывая это, нами были проведены исследования активности некоторых энзимов аденилового пула ПМ: аденозиндезаминазы (АДА), АМФ-дезаминазы (АМФДА) и адениндезаминазы (АД) параллельно в трех биологических средах: лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных
сед.
Цель исследования
Повышение качества диагностики активности патологического процесса при ССД, характера течения и стадии болезни, объективизации контроля эффективности лечения больных ССД с использованием показателей активности АДА, АМФДА и АД в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови и выяснение особенностей пуринового метаболизма при ССД и бля-шечной склеродермии (БСД), способствующих раскрытию патогенетических механизмов и дифференциации этих заболевания.
Задачи исследования
Отработать методы выделения лимфоцитов и эритроцитов из венозной крови и методы определения активности АДА, АМФДА и АД в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови здоровых людей, установить референтные величины (условную норму) активности этих энзимов у здоровых, изучить зависимость энзимных показателей от пола и возраста.
Изучить активность АДА, АМФДА и АД в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ССД в процессе стационарного лечения в зависимости от степени активности процесса, характера течения, стадии болезни при поступлении в стационар, через 10-12 дней лечения и по окончании стационарного лечения.
Выявить энзимологические особенности крови больных ССД, способствующие уточнению степени активности патологического процесса, характера течения и стадии болезни.
Изучить корреляционные связи между активностями исследуемых энзимов в плазме, лимфоцитах и эритроцитах больных ССД с различной активностью патологического процесса, а также корреляционные связи между активностью энзимов в лизатах лимфоцитов и иммунологическими показателями: иммуноглобулинами, ЦИК и АНФ.
Определить наиболее оптимальный набор энзимных показателей крови больных ССД, способствующий выявлению минимальной активности патологического процесса.
Оценить возможность использования энзимных показателей крови в качестве дополнительных объективных критериев эффективности проводимой терапии больных ССД.
Оценить степень влияния на энзимные показатели крови больных ССД активности процесса, характера течения и стадии болезни.
Исследовать активность АДА, АМФДА и АД в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных БСД и сравнить энзимные профили крови больных ССД и БСД на предмет выявления энзимных различий между ними.
Научная новизна работы
Впервые в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ССД было проведено параллельное комплексное исследование активности трех энзимов адениловой ветви ПМ: АДА, АМФДА и АД в процессе стационарного лечения и показано, что изученные энзимные показатели в комплексе с клиническими данными способствуют уточнению степени активности патологического процесса, характера течения, стадии болезни и объективизации оценки эффективности проводимой терапии больных ССД. Показано, что изменения активности ферментов обусловлены клиническими особенностями заболевания. Впервые изучены корреляционные связи между активностями энзимов в плазме, лимфоцитах и эритроцитах, а также связи между лимфоцитарными энзимами и иммунными показателями и показаны их взаимосвязи. Выявлены существенные энзимные нарушения в лимфоцитах, способные оказать негативное влияние на иммунокомпетентные клетки и регуляцию иммунных процессов при ССД.
Практическая значимость
Исследования активности АДА, АМФДА и АД в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ССД в комплексе с клиническими данными могут быть использованы в клинической практике для выявления и уточнения степени активности патологического процесса, характера течения, стадии болезни, что способствует назначению индивидуализированной, адекватной терапии. В процессе лечения контроль динамики энзимных показателей способствует объективизации оценки эффективности проводимой терапии больных ССД, прогнозированию ее длительности.
Исследования активности АДА, АМФДА и АД в лизатах клеток и плазме крови в комплексе с клиническими данными способствуют дифференциации ССД и БСД.
Основные положения, выносимые на защиту
Показатели активности АДА, АМФДА и АД в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ССД могут быть успешно использованы в качестве дополнительных параклинических данных для ранней диагностики активности патологического процесса, уточнения степени активности, характера течения, стадии болезни, объективизации оценки эффективности проводимой терапии и дифференциации ССД и БСД.
Внедрение в практику
Методы определения активности АДА, АМФДА и АД в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови для выявления и уточнения степени активности патологического процесса при ССД внедрены в практику работы муниципального учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница № 25» г. Волгограда. С результатами энзимных исследований, возможностями энзимной диагностики ССД, их перспективой и значимостью систематически знакомятся студенты Волгоградского государственного ме-
10 дицинского университета, аспиранты, клинические ординаторы и практические врачи на лекциях, научно-практических и клинических конференциях.
Публикации и апробация работы
Основные положения диссертации опубликованы в 12 печатных работах. Материалы диссертации ежегодно докладывались на научно-практических конференциях Волгоградского государственного медицинского университета (2005-2007 г.г.).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 211 страницах компьютерного текста (шрифт гарнитуры Times New Roman кегля 14 пт с полуторным интервалом) и состоит из введения, части I — обзора литературы, представленного двумя главами, содержащими основные сведения об этиопатогенезе ССД, ее клинических особенностях, а также о медико-биологической роли пуринового метаболизма, некоторых физико-химических свойствах изучаемых ферментов и их исследовании в клинической практике; части II — материалов собственных исследований, состоящей из 4 глав, включающих клиническую характеристику больных, методы и результаты исследований, обсуждение полученных данных, выводы, практические рекомендации. Диссертация иллюстрирована 36 таблицами, 12 рисунками, 3 выписками из историй болезни. Библиографический указатель содержит 361 источников, из которых 110 отечественных и 251 зарубежных.
11 Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Некоторые аспекты системной склеро дермии
Псевдосклеродермия: метаболическая, наследственная (порфирия, фенилкетонурия, прогерия, амилоидоз, синдромы Вернера и Ротмунда, скле ромикседема и др.). ССД — прогрессирующее полисиндромное заболевание с характерными изменениями кожи, опорно-двигательного аппарата, внутренних органов (легких, сердца, пищеварительного тракта, почек) и распространенными ва-зоспастическими нарушениями по типу синдрома Рейно. В основе заболевания лежит поражение соединительной ткани с преобладанием фиброза и сосудистые патологические изменения по типу облитерирующей микроангио-патии.
Еще недавно известный английский ревматолог Е. Байотерс писал: "Системная склеродермия - загадка нашего поколения, драматичная и неожиданная при проявлении, уникальная и мистическая в своих клинических проявлениях, прогрессирующая и упорно сопротивляющаяся лечению, приводящая в отчаяние и пациентов и врачей ..." (136). За последние десятилетия произошел значительный прогресс в представлениях о ССД, которая на сегодня может быть охарактеризована как хорошо изученная с клинических позиций яркая и своеобразная нозологическая форма с выраженной гетерогенностью и уникальным патогенезом.
Этиология ССД сложна и недостаточно изучена. Предполагается муль-тифакториальный генез ССД, обусловленный взаимодействием неблагоприятных экзо- и эндогенных факторов с генетической предрасположенностью к заболеванию. Наряду с ранее обсуждавшейся ролью инфекции (вирусной и др.), охлаждения, вибрации, травм, стресса и эндокринных сдвигов, в последнее время особое внимание обращено на триггерное действие химических агентов (промышленных, бытовых, алиментарных) и отдельных лекарственных средств, наиболее демонстративное в случаях индуцированной склеродермии. Благодаря современным исследованиям расшифрованы и некоторые генетические механизмы предрасположенности (предетерминиро-ванности) к ССД, что ранее аргументировалось наличием семейных случаев ССД и близких заболеваний, увеличением иммунных и других сдвигов у здоровых родственников пробандов. Подтверждено наличие хромосомной нестабильности у больных ССД. Выявлено сочетание определенных антигенов и аллелей системы гистосовместимости (HLA) с ССД: HLA А9, В8, В35, DR1, DR3, DR5, DR11, DR52 и С4А, варьирующее в разных популяциях (23, 25, 76, 125).
Основу патогенеза ССД составляют нарушения иммунитета, фиброзо-образования и микроциркуляции, взаимодействующие на уровне клеточных (иммунокомпетентные клетки-фибробласты-эндотелий-клетки крови) и ре-цепторно-лигандных систем (молекулы адгезии, факторы роста, интерлейки-ны и др.). У больных ССД выявляется широкий спектр нарушений клеточного и гуморального иммунитета, включая обнаружение специфических анти-нуклеарных и антинуклеолярных аутоантител - антицентромерных, антито-поизомеразных или анти-СКЛ-70 и РНК-антител, а также антинейтрофиль-ных цитоплазматических, антиэндотелиальных антител к различным компонентам соединительной ткани и др. (79, 180, 200, 310, 344). Изменения метаболизма соединительной ткани с повышенным коллагено- и фиброзообразо-ванием определяют нозологическую специфику заболевания. Выявлена фе-нотипически устойчивая гиперактивность фибробластов, структурные и функциональные аномалии клеточных мембран и рецепции, что позволяет предполагать также системную мембранную патологию (201, 285). ССД является уникальной природной моделью генерализованного фиброза, изучение механизмов которого имеет общее клиническое значение. Важным звеном патогенеза ССД является нарушение микроциркуляции с пролиферацией и деструкцией эндотелия, утолщением стенки и сужением просвета микрососудов, вазоспазмом, агрегацией форменных элементов, стазом, деформацией и редукцией капиллярной сети (облитерирующая микроангиопатия) (25, 76, 211).
Клиническая картина ССД отличается полиморфностью и полисин-дромностью, характерным поражением кожи, обусловившим ее название, опорно-двигательного аппарата и внутренних органов (легкие, сердце, пищеварительный тракт, почки).
Поражение кожи, характерным образом меняющее внешний облик больного и отраженное в названии болезни, наблюдается у превалирующего большинства и является одним из ведущих диагностических признаков заболевания (но не единственным и не абсолютным, как считалось ранее, поскольку существуют преимущественно висцеральные формы ССД) (114, 124, 151,307).
Синдром Рейно является одним из частых и нередко первоначальных проявлений ССД. Вазоспастические нарушения распространяются на кисти, стопы, лицо, кончик языка. Возможна и висцеральная локализация (в легких, почках и др.).
Поражение опорно-двигательного аппарата отмечается в различной степени практически у всех больных и является одной из причин их инвали-дизации. Выделяют три основных варианта суставного синдрома: 1) поли-артралгии; 2) склеродермический полиартрит с преобладанием экссудативно-пролиферативных или фиброзно-индуративных изменений; 3) псевдоартрит с развитием контрактур, преимущественно за счет поражения периартикуляр-ных тканей и сухожильно-мышечного синдрома (127).
Вовлечение мышц проявляется в виде: 1) фиброзного интерстициаль-ного миозита с разрастанием соединительной ткани и атрофией собственно мышечных волокон; 2) истинного миозита с первичными дегенеративными и некротическими изменениями в мышечных волокнах и последующим склерозом (137).
Поражение пищеварительного тракта, особенно пищевода (эзофагит) и кишечника (склеродермический дуоденит, синдром нарушения всасывания), наблюдается в 60-70% случаев, имеет своеобразную клинико-рентгенологическую картину.
Поражение органов дыхания отмечается также примерно у 70% больных и характеризуется постепенным развитием фиброзирующего альвеолита и диффузного пневмосклероза (233, 332).
В основе поражения сердца лежат свойственные заболеванию процессы фиброзирования и склероза эндокарда, миокарда и перикарда, усугубляющиеся нарушением микроциркуляции (но без участия крупных сосудов) и приводящие к развитию некоронарогенного кардиосклероза с характерным увеличением сердца, нарушением ритма и проводимости (170, 287).
Больные с бляшечной склеродермией
Под наблюдением в амбулаторных условиях находились 15 больных БСД, которые составили контрольную группу. Выбор этой нозологической формы болезни в качестве группы сравнения с больными ССД был обусловлен как близостью клинической картины заболеваний, особенно на дебютных стадиях, так и схожестью отдельных патогенетических звеньев БСД и ССД. Доказано, что при БСД также как и при ССД нарушены процессы фиброоб-разования в коже, микроциркуляции и иммунного статуса.
Данные литературы свидетельствуют о весьма сходных гисто-морфологических изменениях кожи при БСД и ССД. Антиген HLA В8 одинаково часто встречается как при ССД, так и БСД.
При БСД и ССД выявлены однотипные биохимические изменения крови: повышены уровни трансформирующего фактора роста, гистамина, серо-тонина, содержание растворимых форм молекул клеточной адгезии, усилены процессы анаэробного гликолиза и катаболизма пуринов и пиримидинов, распада ДНК и РНК. То есть, патогенетические механизмы БСД и ССД довольно близки, и некоторые дерматологи эти два заболевания считают как стадии одной болезни.
До настоящего времени остается актуальной проблема возможности трансформации ограниченных форм склеродермии в ССД, и ее решение имеет важное значение в клинической практике. Если БСД является чисто дер-мато- логическим заболеванием и исключена ее возможность перехода в ССД, то ведение подобных больных является прерогативой дерматологов. Но если возможность все-таки существует, то к ведению больных БСД должны подключаться и ревматологи, имеющие специфический опыт лечения больных с системными заболеваниями. Наблюдения перехода БСД в ССД немногочисленны, но они имеются. Поэтому нами и были предприняты исследования активности энзимов пуринового метаболизма у больных БСД с целью выяснения различий и сходства их изменений при этих двух заболеваниях.
Из 15 наблюдавшихся больных БСД 3 (20%) мужчин и 12 (80%) женщин. Средний возраст мужчин - 38,7±0,88 (ст=1,53) лет, женщин - 42,6±0,73 ( т=2,54) лет, всей группы больных - 41,8±0,73(а=2,83) лет. Средняя продолжительность заболевания у мужчин - 3,0±0,29 (а=0,5) лет, у женщин -4,54±0,24 (а=0,84), у больных всей группы - 4,23±0,26 (ст=1,0) лет.
Наиболее часто поражались кожные покровы туловища (80%), конечностей (33,3%) и довольно редко - у 2 (13,3%) больных — кожные покровы лица. На конечностях чаще (80%) поражались проксимальные области. Расположение очагов было чаще асимметричным. Количество очагов на коже от 1 до 10-12, некоторые носили сливной характер.
Поражение кожи большинства очагов находилось в стадии эритемы и уплотнения (индурации). В 1/3 очагов наблюдалась стадия атрофии.
Из субъективных ощущений наиболее часто отмечались жалобы на чувство онемения, жжения, «ползание мурашек», зуд в очагах поражения кожи (86,7%), раздражительность (40%), головные боли (46,7%), боли в сердце (33,3%), артралгии (26,7%).
Клинико-иммуно-биохимические показатели мало отражали тяжесть клинического состояния больных. Наиболее информативными из них оказались иммуноглобулины G (26,7%), СРБ, гамма-глобулины, лейкоцитоз, СОЭ (20%), эозинофилы (13,3%). извлекалась в утренние часы из локтевой вены. Активность энзимов определялась в лизатах эритроцитов, лимфоцитов и плазме крови в день забора крови или на следующий день.
Вся стеклянная посуда, которая использовалась в работе, предварительно силиконировалась. Для этого чистые и сухие пипетки и пробирки заполняются на 5-10 минут 5% или 10% раствором дихлордиметилсилана или трихлорметилсилана в толуоле (раствор силикона). Затем они промываются дистиллированной водой, высушиваются 15-20 минут в перевернутом виде и помещаются в сушильный шкаф на 1-1,5 часа при температуре 140-160С до полного высыхания. Раствор силикона можно использовать повторно.
В силиконированную пробирку помещается 3,8% раствор цитрата натрия (из расчета 0,1 мл на 1 мл венозной крови). Перед забором крови содержимое пробирки взбалтывается с целью смачивания раствором стенок пробирки. В эту пробирку помещается 4-6 мл венозной крови, добавляется 4-6 мл 0,9% раствора хлористого натрия и все тщательно перемешивается.
Выделение лимфоцитов проводилось по методике Воушп (1968). Для разделения клеток крови использовался лимфосеп (Lympho separation medium) фирмы "JCN Biomedicals" с плотностью раствора 1,077-1,079 г/мл (130, 131). В центрифужную пробирку помещается 3 мл лимфосепа и по ее стенке осторожно наслаивается 5 мл крови с физраствором. Соотношение кровь:лимфосеп может колебаться от 1:2 до 1:4. Затем пробирки помещают в центрифугу и проводят центрифугирование при 2000 оборотах в минуту в течение 20 минут. За это время гранулоциты и эритроциты оседают на дно пробирки, над ними находится слой лимфосепа и еще выше — плазма. Между плазмой и лимфосепом должно четко контурироваться белесоватое кольцо — скопление лимфоцитов. После этого проводится трехкратное отмывание лимфоцитов.
Определение активности АМФ-дезаминазы
Принцип определения активности АМФДА основан на определении свободного аммиака (по азоту), образующегося в ходе катализируемой АМФДА реакции с помощью цветной фенол-нитропруссид-гипохлоритной реакции Бертло (97).
Перед исследованием две пробирки помечаются как "контроль" и "опыт". Затем последовательно добавляются по 1,35 мл фосфатного буфера, 0,2 мл MgCl2, 0,05 мл КС1. Содержимое пробирок перемешивают. После этого в опытную пробирку добавляют 0,2 мл раствора АМФ. Затем в контрольную и опытную пробирки поместить биоматериал (по 0,2 мл плазмы, или по 0,2 мл лизата лимфоцитов, или по 0,1 мл лизата эритроцитов). Перемешать и инкубировать все пробы на водяной бане в течение 30 минут при температуре 37С.
После инкубации во все пробирки добавить по 2 мл фенолового реагента и по 2 мл щелочного гипохлорита. Перемешать и повторно инкубировать на водяной бане при 37С в течение 30 минут для развития окраски. Далее содержимое пробирок центрифугируется при 1500 об./мин в течение 5 минут. Надосадочная жидкость в количестве 3 мл извлекается и помещается в стеклянные кюветы (L-1,0) спектрофотометра. При длине волны 600 нм снимаются показания абсорбции опытных проб против контрольных. Интенсивность окраски растворов прямо пропорциональна количеству образовавшегося аммиака, которое определяют по калибровочному графику, построенному по стандартным растворам сульфата аммония.
Построение калибровочной кривой проводится по тем же принципам и на тех же условиях, что для определения активности АМФДА. Единица активности АМФДА эквивалентна высвобождению в процессе реакции 1 мкг азота аммиака в течение 1 часа при температуре 37С и для перевода в ME полученные единицы по калибровочной кривой умножаются на 0,476. Активность АМФДА в плазме выражалась в нмоль/мл/мин. Эта единица эквивалентна ME, что соответствует мкмоль/л/мин. Активность энзима в эритроцитах - в нмоль/мл/мин (содержащий 1x10 клеток), в лимфоцитах — в нмоль/мл/мин (содержащий 1x10 клеток).
Активность АД определялась по количеству аммиака (азота), высвобождающегося в ходе катализируемой АД реакции, с использованием фенолги-похлоритного реагента, дающего цветную окраску со свободным азотом (301).
В пробирки, промаркированные как «контроль» и «опыт», поместить по 0,5 мл раствора аденина и выдержать 2-3 минуты в водяной бане при 37С. В опытную пробирку добавить биоматериал (0,2 мл лизата лимфоцитов, или 0,1 мл лизата эритроцитов, или 0,1 мл плазмы), смешать и продолжить инкубацию при 37С в течение 60 минут. После инкубации в контрольную пробирку добавить 2,5 мл фенолового реагента, биоматериал (0,2 мл лизата лимфоцитов, или 0,1 мл лизата эритроцитов, или 0,1 мл плазмы) и 2,5 мл щелочного гипохлорита, а в опытную — 2,5 мл фенолового реагента и 2,5 мл щелочного гипохлорита. Содержимое пробирок перемешать и поместить их в водяную баню при 37С на 15 минут для развития окраски. После этого из пробирок перенести в кюветы спектрофотометра по 3 мл раствора и при длине волны 640 нм измерить абсорбцию опытной пробы против контрольной. Активность АД рассчитывают по калибровочной кривой, построенной аналогично, что и для определения активности АДА и выражают в ME, для чего полученные данные по калибровочной кривой умножают на коэффициент 0,476. А потом переводят в нмоль/мл/мин для плазмы. Активность энзима в лимфоцитах выражают в нмоль/мл/мин, содержащий 1x10 клеток, а для эритроцитов на 1 мл, содержащий 1х109 клеток.
Наряду с энзимными исследованиями, у больных определялись: общий анализ крови и мочи, белок сыворотки, коагулограмма, общий билирубин, трансаминазы, тимоловая проба, мочевина, креатинин, сиаловые кислоты, С-реактивный белок (СРБ), иммуноглобулины A, G, М, антинуклеарный фактор (АНФ), циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). Использовались также инструментальные методы обследования (ЭКГ, УЗИ, рентгеновское исследование органов грудной клетки). По необходимости привлекались врачи узких специальностей для консультации.
Статистическая обработка данных проводилась на ПК с использованием программы "STATISTICA 6.0".
Активность энзимов в крови здоровых людей
Обследовано 30 практически здоровых людей, из которых 16 мужчин и 14 женщин. Средний возраст мужчин - 32,2±3,22(а=12,9), женщин -42,8±2,12 (5=7,9), всей группы - 37,1±2,18 (а=11,9). Показатели активности энзимов в плазме, лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови здоровых людей представлены в таблицах 8-10, которые анализировались в зависимости от пола и возраста. Существенных различий активности энзимов от этих факторов выявлено не было. Корреляционные связи между активностями энзимов в различных средах отражены в таблицах 11-13 В плазме (табл. 11) выявлены обратные корреляции между всеми энзимами, но между АМФДА и АД они были слабыми и не достоверными, а между другими энзимами - средней силы прочности. В лизатах лимфоцитов (табл. 12) связи также носили обратный характер, но достоверными умеренными были только между АМФДА и АДА. В лизатах эритроцитов (табл. 13) все связи носили обратный характер, но достоверные умеренные выявлены только для АДА — АД, остальные связи были слабыми.
Между активностью одних и тех же энзимов в различных средах (табл. 14) выявлены умеренные обратные связи между АДА плазмы и АДА эритроцитов, АДА плазмы и АДА лимфоцитов, прямые умеренные связи между АДА эритроцитов и АДА лимфоцитов. Остальные связи были слабыми и разнонаправленными. Ниже (табл. 15) представлены условные границы нормы величин активности энзимов (референтные пределы) у здоровых людей в трех биологических средах, вычисленных по формуле: М±2а, при доверительной вероятности 95%. Активность энзимов выражалась в нмоль/мин/мл. Причем, в 1 мл лизатов лимфоцитов до лизиса содержалось 1x10 клеток, а в лизатах эритроцитов — 1 х 109 клеток. Под наблюдением в условиях стационара находились 54 больных ССД. Исследования активности энзимов в трех биологических средах проводились трижды в процессе лечения: при поступлении в стационар, через 10-12 дней лечения и перед выпиской из стационара, в стадии начинающейся клинической ремиссии.
При поступлении на лечение, по сравнению со здоровыми, в плазме (табл. 16) выявлено повышение активности АМФДА (t=0,2.p 0,05), АД (t=3,l.p 0,01) и тенденция к повышению активности АДА (t=0,2.p 0,05); в лизатах эритроцитов (табл. 17) - повышение активности АДА (t=4,1 .р 0,001), АД (t=2,4.p 0,05) и тенденция к повышению активности АМФДА (t=l,4.p 0,05); в лизатах лимфоцитов (табл. 18) - снижение активности АДА (t=21,3.p 0,001), АД (t=10,4.p 0,001) и повышение активности АМФДА (t=10,9.p 0,001). Через 10-12 дней лечения, наряду с некоторым улучшением клинического состояния больных, по сравнению с начальным этапом, в плазме крови (табл. 16) наметилась тенденция к повышению активности АДА, снижению активности АМФДА и АД (все р 0,05); в лизатах эритроцитов (табл. 17) — тенденция к снижению активности АДА и АМФДА (р 0,05); в лизатах лимфоцитов (табл. 18) повысились ранее сниженные активности АДА (t=4,0.p 0,001), АД (t=2,8.p 0,01) и снизилась активность АМФДА (t=29,7.p 0,001).
По окончании курса стационарного лечения, по сравнению с исходным фоном, наблюдалась положительная динамика большинства изученных энзимных показателей: в плазме (табл. 16) повысилась активность АДА (t=3,7. р 0,001), снизилась активность АМФДА (t=4,0. р 0,001) и АД (1=5,3. р 0,001); в лизатах эритроцитов (табл. 17) достоверно снизилась только активность АДА (t=3,2. р 0,01) и определилась тенденция к снижению активности АМФДА и АД (р 0,05); в лизатах лимфоцитов (табл. 18) повысились ранее сниженные активности АДА (t=l6,6. р 0,001), АД (t=12,0.p 0,001) и снизилась активность АМФДА (t=12,2. р 0,001). Сравнение энзимных показателей больных ССД перед выпиской из стационара с аналогичными показателями здоровых лиц выявило отсутствие существенных энзимных различий в плазме крови (все р 0,05), по активности АМФДА (t=0,4. р 0,05) и АД (t=l,7. р 0,05) в эритроцитах, но остались сниженными активности АДА (t=9.2. р 0,001) и АД (t=3,8. р 0,001) в лимфоцитах и повышенными активности АДА в эритроцитах (t=4,3. р 0,001) и АМФДА в лимфоцитах (t=4,4. р 0,001). Нами также были изучены энзимологические профили крови у больных ССД с различными вариантами течения заболевания. У больных ССД с хроническим течением заболевания, по сравнению со здоровыми, в плазме крови (табл. 16) выше активности АДА (t=3,l. р 0,01) и АД (t=2,3. р 0,05) и несколько ниже активность АМФДА (t=0,5. р 0,05); в лизатах эритроцитов (табл. 17) выше активность АДА (t=10,0. р 0,001) и незначительно ниже активности АМФДА (t=l,0. р 0,05) и АД (t=l,7. р 0,005); в лизатах лимфоцитов (табл. 18) ниже активности АДА (t=15,8. р 0,001), АД (1=4,9 р 0,001) и выше активность АМФДА (t=7,7. р 0,001). Через 10-12 дней лечения, по сравнению с исходным фоном, в плазме крови (табл. 16) существенной положительной динамики энзимных показателей не наблюдалось: несколько снизилась активность АДА (1=0,7. р 0,05), АМФДА (t=0. р 0,05) и АД (t=l,l. р 0,05); в эритроцитах (табл. 17) также существенных энзимных различий не отмечалось: незначительно снизилась активность АДА (t=l,9. р 0,05) и увеличились активности АМФДА (t=0,3. р 0,05) и АД (t=0,6. р 0,05); в лизатах лимфоцитов (табл. 18) все энзимные показатели претерпели существенную положительную динамику: повысились активности АДА (t= 2,2. р 0,05), АД (t=2,l. р 0,05) и снизилась активность АМФДА (t=2,l. р 0,05).
![Клинико-патогенетическое значение исследования активности ксантиноксидазы, ксантиндегидрогеназы, пуриннуклеозидфосфорилазы и 5'-нуклеотидазы в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ревматоидным артритом [Электронный ресурс]](/i/i/4391/194221.png "Клинико-патогенетическое значение исследования активности ксантиноксидазы, ксантиндегидрогеназы, пуриннуклеозидфосфорилазы и 5'-нуклеотидазы в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ревматоидным артритом [Электронный ресурс] Агафонова Наталья Львовна")
