Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Некоторые аспекты пуринового метаболизма в биологии и медицине 11
Глава 2. Клиническая характеристика больных 26
2.1. Больные системной красной волчанкой 26
2.2. Больные дискоидной красной волчанкой (контрольная группа) 32
Глава 3. Методы исследований 35
3.1. Выделение лимфоцитов, эритроцитов и приготовление лизатов клеток крови 35
3.2. Определение активности ксантиноксидазы в лизатах клеток и плазме крови 38
3.3. Определение активности ксантиндегидрогеназы в лизатах клеток и плазме крови 41
3.4. Определение активности нуклеотидазы в лизатах клеток и плазме крови 42
Глава 4. Активность энзимов в крови здоровых людей 47
Глава 5. Энзимные показатели крови у больных системной и дискоидной красной вол чанкой 52
5.1. Больные системной красной волчанкой 52
5.1.1. Энзимные показатели крови больных СКВ при I
степени активности процесса 64
5.1.2. Энзимные показатели крови больных СКВ при II степени активности процесса 80
5.1.3. Энзимные показатели крови больных СКВ при III степени активности процесса 94
5.1.4. Активность энзимов в зависимости от поражения сердца и почек 108
5.2. Энзимные показатели крови у больных дискоидной красной волчанкой 128
Обсуждение 136
Выводы 161
Практические рекомендации 164
Список литературы 165
Приложение 205
- Некоторые аспекты пуринового метаболизма в биологии и медицине
- Больные дискоидной красной волчанкой (контрольная группа)
- Определение активности ксантиндегидрогеназы в лизатах клеток и плазме крови
- Активность энзимов в крови здоровых людей
Введение к работе
Системная красная волчанка (СКВ) является типичным представителем диффузных болезней соединительной ткани, которым свойственна системность поражений, выраженные аутоиммунные, иммунокомплексные, воспалительные процессы, метаболические нарушения. Несмотря на относительно небольшую распространенность СКВ (до 500 больных на 1 млн. населения), по сравнению с другими ревматическими заболеваниями, она характеризуется выраженным неуклоннопрогрессирующим течением, ранней и стойкой инвалидизацией и значительной летальностью, и поэтому борьба с этим заболеванием является одной из актуальных задач современной медицины.
Четко обозначенная клиническая картина СКВ не представляет трудности для диагностики. Но дебют заболевания нередко протекает под «масками» заболеваний почек, гипертонической болезни, пневмонии, артритов и других заболеваний. Поэтому на ранних стадиях болезни велик риск гиподи-агностики СКВ. Заболевание характеризуется выраженным клиническим полиморфизмом, и поэтому достаточно сложны не только первичная диагностика СКВ, но и определение степени активности процесса у больных с заведомо известным диагнозом, разграничение фаз клинической ремиссии и обострения заболевания, что затрудняет своевременное назначение адекватной терапии.
До настоящего времени в лечебном арсенале врачей не имеется средств, способных полностью остановить развитие патологического процесса при СКВ. Используемые препараты, такие как глюкокортикоиды, имму-номодуляторы, способны лишь замедлить прогрессирование заболевания, но не решают проблемы излечения подобных больных. Это во многом связано с недостаточностью знаний патогенеза СКВ и, вследствие этого, невозможностью создания лечебных препаратов, оперируя которыми можно было бы радикально воздействовать на наиболее важные патогенетические звенья и полностью остановить прогрессирование патологического процесса.
Большинство существующих теорий патогенеза СКВ базируется на нарушениях иммунного гомеостаза, отдельных звеньев гуморального и клеточного иммунитета (2, 38, 69, 71).
Тем не менее, признание первичности иммунологического дефекта в патогенезе СКВ не всегда объяснимо и доказуемо, так как иммунные патологические реакции развиваются на уже предварительно измененные компоненты соединительной ткани, причины метаморфоз которых чаще всего неясны. Известно, что характер дифференцировки стволовых лимфоидных клеток определяется микроокружением, которое создается соединительнотканными клетками, и если последние изменены, повреждены, то они могут влиять негативно на иммунологическую реактивность (51).
В то же время известно достаточно много работ, свидетельствующих о многочисленных нарушениях метаболизма при СКВ (8, 13, 32, 52, 68).
Учитывая, что по данным литературы при СКВ выявлены нарушения нуклеинового метаболизма, проявляющиеся как изменениями пуриновых нуклеотидов, так и гиперпродукцией антител к нуклеиновым кислотам (НК) (63, 70, 83), логично предположить возможные нарушения метаболизма пуринов как предшественников или составных элементов НК. Достаточно хорошо известно, что некоторые метаболиты пуринового цикла (аденозин, гуа-нозин) и энзимы, регулирующие их содержание, оказывают существенное влияние на созревание, пролиферацию и дифференцирование лимфоцитов и их функциональные свойства (90, 117, 136, 143, 151).
Исходя из этого, нам представляется весьма перспективным направление по изучению активности энзимов пуринового метаболизма (ПМ) в клетках крови больных СКВ как в плане диагностики активности патологического процесса, так и раскрытия отдельных патогенетических механизмов СКВ, обусловленных нарушениями ПМ в иммунокомпетентных клетках крови и, возможно, меняющих их иммунные свойства.
С учетом этих факторов нами и были проведены исследования активности некоторых энзимов ПМ: ксантиноксидазы (КО), ксантиндегидрогеназы
7 (КДГ), 5'-нуклеотидазы (5'-НТ) в трех биологических средах (лизаты лимфоцитов, эритроцитов и плазма крови) у больных СКВ. А, учитывая, что СКВ по своим клиническим проявлениям весьма близка к дискоидной красной волчанке (ДКВ), нами были проведены и сравнительные исследования активности этих же энзимов и у больных ДКВ, что может способствовать дифференциальной диагностике СКВ и ДКВ.
Цель исследования
Повышение качества диагностики активности патологического процесса при СКВ, дифференциальной диагностики СКВ и ДКВ, объективизации контроля эффективности проводимой терапии с использованием показателей активности КО, КДГ и 5'-НТ в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови. Выявление особенностей пуринового метаболизма при СКВ и ДКВ, способствующих выяснению патогенетических различий этих заболеваний.
Задачи исследования
Изучить активность КО, КДГ и 5'-НТ в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови здоровых людей, установить референтные пределы для активности этих энзимов у здоровых и изучить зависимость активности КО, КДГ и 5'-НТ в трех биологических средах от пола и возраста.
Изучить активность КО, КДГ, 5'-НТ, содержание мочевой кислоты (МК) у больных СКВ в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови в процессе лечения: при поступлении на лечение, через 10-12 дней и перед выпиской из стационара.
Изучить особенности энзимного профиля крови у больных СКВ в зависимости от степени активности патологического процесса, характера течения, поражения почек и сердца.
Изучить корреляционные связи между активностями КО, КДГ, 5'-НТ у больных СКВ в трех биологических средах.
Выявить энзимологические особенности крови больных СКВ и ДКВ, способствующие их дифференциации.
Оценить возможность использования изученных энзимных показателей крови в качестве дополнительных критериев эффективности проводимой терапии больных СКВ.
Научная новизна работы
Впервые у больных СКВ в трех биологических средах (лизаты лимфоцитов, эритроцитов и плазма крови) проведено параллельное исследование активности трех энзимов ПМ: КО, КДГ и 5'-НТ, а также содержания МК в зависимости от степени активности патологического процесса, характера течения, эффективности проводимой терапии, наличия органных поражений и показано, что изученные энзимные показатели способствуют уточнению степени активности патологического процесса, характера течения заболевания, объективизации оценки эффективности проводимой терапии. Также впервые были проведены сравнительные исследования активности КО, КДГ и 5'-НТ в трех биологических средах у больных СКВ и ДКВ и выявлены энзимологические особенности крови при этих двух заболеваниях. Изучены корреляционные связи между активностью энзимов в трех биологических средах в зависимости от активности патологического процесса у больных СКВ. Выдвинута гипотеза о возможности первичности нарушений ПМ и вторичности иммунных нарушений в патогенезе СКВ.
Практическая ценность работы
Проведенные исследования показали, что определение активности КО, КДГ и 5'-НТ в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных СКВ в комплексе с клиническими данными может оказать существенную помощь в выявлении минимальной активации патологического процесса, разграничении фаз клинической ремиссии и обострения заболевания, уточнении степени активности патологического процесса, объективизации оцен-
9 ки эффективности проводимой терапии больных СКВ. Исследования активности КО, КДГ и 5'-НТ в трех биологических средах способствуют дифференциации СКВ и ДКВ.
Основные положения, выносимые на защиту
Показатели активности КО, КДГ и 5'-НТ в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови у больных СКВ могут быть использованы в качестве дополнительных вспомогательных тестов для ранней диагностики обострения заболевания, уточнения степени активности патологического процесса, характера течения, объективизации оценки эффективности проводимой терапии, дифференциальной диагностики СКВ и ДКВ.
Внедрение в практику
Методы определения активности КО, КДГ и 5'-НТ в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови внедрены в работу муниципального учреждения здравоохранения "Городская клиническая больница № 25" г. Волгограда. С результатами энзимных исследований и возможностями энзимной диагностики при ревматических заболеваниях систематически знакомятся практические врачи, на курсах усовершенствования, научно-практических конференциях, студенты старших курсов Волгоградского государственного медицинского университета.
Публикации и апробация работы
По теме диссертации опубликовано 4 печатных работ. Материалы диссертации докладывались на научных сессиях и конференциях НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и Волгоградской государственной медицинской академии (2007-2008 гг.). Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании ученого совета НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и кафедры госпитальной терапии Волгоградского государственного медицинского университета 12 февраля 2009 г.
10 Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 210 страницах компьютерного текста и состоит из введения; части I - обзора литературы, представленного одной главой, в которой изложены обобщенные сведения о значении ПМ и отдельных его энзимов в биологии и медицине; части II — собственных исследований, состоящей из 4 глав, содержащих клиническую характеристику больных, методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, выводы и практические рекомендации.
Диссертация иллюстрирована 49 таблицами, 11 рисунками, 4 выписками из историй болезни. Библиографический указатель содержит 359 источников, из которых 99 отечественных и 260 зарубежных.
11 Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ПУРИНОВОГО МЕТАБОЛИЗМА В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ
Пуриновый метаболизм представляет собой совокупность процессов синтеза и катаболизма пуриновых нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ, ИМФ, ГМФ, ГДФ), нуклеозидов (аденозин, гуанозин, ксантозин, инозин) и оснований (аденин, гуанин, ксантин).
О важности пуриновых нуклеотидов известно достаточно много: они оказывают выраженное влияние на проницаемость клеточных мембран, свертываемость крови, секрецию простагландинов, принимают участие в окислительно-восстановительных реакциях, входят в состав коферментов НАД, НАДФ, ФАД (19, 20, 21, 72, 93). Кроме того, они участвуют в синтезе нуклеиновых кислот, регуляции кровообращения, энергетических процессов (49, 56,81,97).
Не менее значима и роль пуриновых нуклеозидов, из которых наиболее известен аденозин, образующийся из АМФ под воздействием 5'-НТ. Особо выделяется роль аденозина в регуляции иммунных процессов. Его низкие концентрации в лимфоцитах тормозят созревание, пролиферацию и дифференциацию клеток, угнетают супрессорную функцию Т-лимфоцитов, а высокие концентрации подавляют активность естественных киллеров (65, 66, 92, 94, 221, 310, 319, 342). Аденозин способствует синтезу АТФ, оказывает антиаритмическое и гипотензивное действие, участвует в регуляции сосудистого тонуса, свертываемости крови (25, 26, 28, 256). Известно о нейромедиатор-ной роли аденозина, его участии в продукции опухолевого некротизирующе-го фактора, в передаче внеклеточных сигналов в клетку (48, 80, 91, 100, 146, 182). Аденозин используется также для синтеза некоторых антивирусных препаратов (аденинарабинозид, аденинмоноцистеин), ему присущи антиги-поксическое и антиадренергическое свойства (24, 37).
Важную биологическую роль играет также гуанозин, являющийся межуточным субстратом ПМ. С увеличением содержания гуанозина и неорганического фосфора в клетке нарастает синтез гуаниновых нуклеотидов: ГМФ, ГДФ и ГТФ (159). Гуанозин обладает выраженным кардиотоническим и антигипоксическим действием (27, 29, 145, 242, 243), участвует в регуляции взаимодействия гормонов с рецепторами клеток и синтезе белка (290).
Известно о положительном влиянии гуанозина при острой кровопоте-ре, использовании его в качестве консерванта крови (79).
Структурные аналоги гуанозина, гуаниновые нуклеотиды используются в фармацевтике для синтеза антивирусных препаратов (ацикловир, зови-ракс, рибовирин, виразол), угнетающих синтез ДНК вирусов (37, 79, 339). Производные гуанозина (8-бромгуанозин, 8-меркаптогуанозин) обладают выраженными иммуномодулирующими свойствами, а комбинация гуанозина с ГМФ используется в лечении злокачественных опухолей (90, 166, 295).
Недостаточно изучена роль пуриновых оснований: аденина, гуанина, ксантина, но их наличие в структуре ДНК свидетельствует о их несомненной важности (57). Известно, что повышенные концентрации аденина подавляют трансплантационный иммунитет (37), а синтетические аналоги пуриновых оснований (6-меркаптопурин, азатиоприн, теобромин) успешно используются в клинической практике (10).
Как синтез, так и катаболизм пуриновых производных представляет собой многоступенчатый каскад энзимных реакций с множественными межуточными соединениями, контролирующими нуклеиновый обмен по типу обратной связи (рис. 1).
В физиологических условиях процессы синтеза и катаболизма пуринов находятся в динамическом равновесии, и их соотношение всегда поддерживается в необходимых пропорциях, но при патологических состояниях эти соотношения могут нарушаться, что может быть использовано в медицине с диагностическими целями, а коррекция нарушенных звеньев ПМ может оказаться мощным патогенетическим средством лечения многих заболеваний.
ГТФ ГДФ
Рибозо-5-фосфат + АТФ
ФРПФ-синтетаза ФРПФ + глутамин
ФРПФ-АТ
5-фосфорибозиламин
АТФ АДФ
5'-НТ
Гуанозин ПНФ Гуанин
Гуаназа
5'-НТ
Инозин
Гипоксантин
Ксантиноксидаза
-> Ксантин
АМФ^~ | 5'-НТ Аденозин АФРТ
Аденин—'
Ксантиноксидаза
Мочевая кислота
Рис. 1. Биосинтез пуриновых нуклеотидов в организме человека.
АДА — аденозиндезаминаза, АФРТ — аденинфосфорибозилтрансфераза, 5'-НТ — 5'-нуклеотидаза, ПНФ — пуриннуклеозидфосфорилаза, ФРПФ — фосфорибозил-пирофосфат
' 14 Ниже представлены обобщенные сведения о биологической роли, физико-химических свойствах некоторых ферментов ПМ, активность которых была изучена нами в трех биологических средах у больных СКВ.
Ксантиноксидаза (ЕС 1.2.3.2., ксантин-кислород-оксидоредуктаза) — фермент, катализирующий окисление ксантина, гипоксантина до МК на заключительном этапе ПМ (247, 297).
Своеобразием этого фермента является наличие двух форм: 1. НАД+ -зависимая дегидрогеназа (ЕС 1.2.1.37., Д-форма, ксантиндегидрогеназа, КДГ), окисляющая ксантин или гипоксантин до МК с образованием восстановленной формы НАД (НАДН) и 2. НАД^- независимая форма (ЕС 1.2.3.2., О-форма или КО), также окисляющая ксантин или гипоксантин с образованием МК с одновременным восстановлением молекулярного кислорода и продукцией супероксидных радикалов и хлорноватистой кислоты, являющихся мощными оксидантами, инициирующими перекисное окисление ли-пидов с повреждением клеточных мембран (40, 125, 154, 172, 298).
В физиологических условиях во многих тканях человека преобладает КДГ, но при патологии чаще всего происходит трансформация Д-формы в О-форму (КДГ в КО). Подобное наблюдается при ряде воспалительных процессов (99, 169, 248, 269, 292), рентгеновском облучении (47), гипоксических состояниях (335), избытке в тканях протеолитических энзимов (103, 119).
Гипербарическая оксигенация тканей, дитиотрейтол способствуют трансформации КО в КДГ, что может быть использовано в клинической практике (119, 334).
Молекулярная масса КО около 300 000 Да (133, 304). Молекула энзима состоит из двух субъединиц с равной молекулярной массой (246). В качестве простетических компонентов молекула фермента содержит два атома молибдена (44, 205, 338), 8 атомов кислотолабильной серы (82, 100), 8 атомов не-геминового железа (190, 246), ванадий (313), концевые остатки гистидина, цистеина, аргинина (114, 177), две молекулы ФАД (317).
15 КО обладает широкой субстратной специфичностью и может окислять, помимо ксантина и гипоксантина, различные производные пуринов, пирими-динов, птеридинов, разнообразные альдегиды, восстанавливая при этом не только кислород, но и многие другие акцепторы электронов: тетразолиевые соли, метиленовый синий, производные индофенола (41, 302).
КО является генетически обусловленным ферментом, и нарушения в его генетическом коде могут повлечь за собой некоторые патологические ситуации (123, 141,197,207).
КО широко представлена в растительном и животном мире. Активность энзима обнаружена в бактериях (351), моллюсках (157), у животных и человека (131, 280, 291). Органное распределение энзима изучено недостаточно. Известно, что у животных наибольшая активность КО определяется в печени и кишечнике (179, 210).
Активность энзима выявлена в женском молоке (131), поджелудочной и щитовидной железах (150, 239), головном мозге (277), желудке и селезенке (262), коже (185), сперматозоидах (101, 315). По вопросу содержания КО в скелетных и сердечной мышцах данные литературы противоречивы, что связано, вероятно, с чувствительностью применяемых авторами методик исследований (196, 261). Высокая активность КО у человека и животных выявлена в эндотелии кровеносных сосудов (193, 206, 212) и сетчатке глаза (168).
Энзим катализирует заключительный этап пуринового цикла, по его активности можно судить об интенсивности и направленности метаболических процессов (294, 322). Так как в процессе катализа КО продуцирует супероксидные и другие свободные радикалы, энзим может способствовать развитию и поддержанию воспалительных процессов, интенсификации пере-кисного окисления липидов (46, 124, 214, 289), а по показателю активности КО (О-форма) можно судить об интенсивности воспалительного процесса в организме (55, 254).
Негативное действие КО, как продуцента свободных радикалов, проявляется в ингибиции ключевых энзимов анаэробного гликолиза (пируватде-гидрогеназы, гексокиназы), энергетического метаболизма (креатинкиназы), антиоксидантных энзимов (супероксидисмутазы, глутатионпероксидазы, глу-татионредуктазы) (229, 253, 278, 312).
Высокая активность КО способствует усилению агрегации тромбоцитов, повышению свертываемости крови, возникновению тромбоэмболиче-ских процессов (126, 148, 155, 208, 235), оказывает в эксперименте антисте-роидогенный и антигонадотропный эффекты (181).
В то же время за счет продукции кислородных радикалов КО оказывает и положительное влияние на организм, подавляя рост и размножение микробов, вирусов и опухолевых клеток (316, 355).
Активность КО в тканях и плазме крови меняется в течение суток и подвержена влиянию многих факторов. Некоторые эндогенные и экзогенные вещества являются ингибиторами КО: производные фенолов (137, 139), ме-тилксантины (222), бифосфаты (308), флавоноиды (138), соли меди, цинка, ртути, никеля, кобальта, вольфрама (149, 260, 270, 318), вазоактивные инте-стинальные полипептиды (240). Мочевая кислота в физиологических концентрациях также ингибирует частично КО (260, 261).
Данные об ингибиторах КО, помимо теоретического значения, имеют важное практическое значение для медицины, так как на основе химической структуры ингибиторов КО представляется возможность синтеза соединений близких по структуре естественным субстратам и ингибиторам КО, которые могут ошибочно использоваться в качестве субстратов энзима. При этом будет происходить блокада активного или аллостерического центра фермента, он станет или малоактивным, или полностью блокированным. Классическим примером этому являются синтетические аналоги пшоксантина: аллопури-нол (135, 343) и 6-меркаптопурин (116, 224), используемые в клинической практике в качестве ингибиторов КО в лечении подагры.
В настоящее время известно достаточно много лекарственных препаратов, снижающих активность КО и генез супероксидных радикалов. Большинство из них по своей химической структуре близки к аналогам ксантина и ги-поксантина. К ним относятся кофеин и производные ксантина (137, 222), седуксен (14), верапамил (311), мербарон (264), азатиоприн (307), мофебутазон (305), тенидап (140), каптоприл (147), никотиновая кислота (102), D-пеницилламин (301).
Механизмы ингибиции КО вышеперечисленными препаратами во многом непонятны. Известно, что нет| универсальных ингибиторов, способных нейтрализовать активность КО, выделенной из различных источников. Так, имеются ингибиторы для КО, функционирующей в скелетных мышцах, но они не действуют на КО, локализующуюся в ткани мозга.
В экспериментальных моделях ишемии-реперфузии тканей за счет супероксидных радикалов, генерируемых КО, наблюдалось поражение желудочно-кишечного тракта (200, 204, 271, 330), печени (121, 234), почек (272, 341, 357), кожи (283), легких (258, 345). Предварительное введение животным аллопуринола или предотвращало повреждение органов и тканей, или значительно уменьшало степень повреждения (235). Исходя из этого, логично предположить, что аллопуринол является истинным ингибитором КО и, таким образом, препятствует генерации свободных радикалов. В то же время подобный феномен имел место и при ишемии-реперфузии миокарда, хотя в ряде работ показано отсутствие КО и его субстратов (ксантин и гипоксантин) в миокарде, что исключает генез супероксидных радикалов за счет КО-реакции (194, 202, 286, 299). Подобную ситуацию можно объяснить ге-незом свободных радикалов не за счет КО-системы, а из других источников, и, следовательно, аллопуринол в данной ситуации не ингибирует активность КО в миокарде (вследствие ее отсутствия), а лишь участвует в нейтрализации супероксидных радикалов, как аскорбиновая кислота, окись азота (211, 217, 232, 236, 238, 333).
Весьма разноречивы мнения исследователей по поводу влияния на активность КО гидрокортизона и дексаметазона (244, 266). Имеются интересные данные о взаимосвязях индометацина с КО, широко используемого в ревматологии в качестве анальгетика и антипиретика, и на который возлагались большие надежды в прерывании и обратном развитии патологического процесса в суставах, что не подтвердилось в клинической практике. Вероятно, что индометацин, помимо своих положительных свойств в лечении суставов, активирует полиморфноядерные лейкоциты, способствует активации КО, что приводит к избыточной генерации свободных радикалов и хрониза-ции воспаления (331).
В то же время такие препараты как верапамил, седуксен, аскорбиновая кислота, каптоприл, кофеин, производные никотиновой кислоты, тенидап являются мощными ингибиторами КО или нейтрализаторами супероксидных радикалов (14, 147, 156). Включение их в комплекс лечения ревматических больных имеет хорошие перспективы, но подобный подход предполагает знание врача об исходном уровне активности КО у конкретного больного, так как известно, что при низкой активности КО в крови больного назначение азатиоприна или 6-меркаптопурина (ингибиторов КО) быстро приводит к развитию лейкопении и токсикозу, что не бывает при высокой активности КО (116, 224). Аналогичная ситуация при низкой активности КО наблюдается и при назначении азатиоприна (307).
Об активаторах КО имеются довольно скудные сведения. Известно, что введение крысам каининовой кислоты (118), интерферона или его индукторов (183), обработка тритоном Х-100 (241) повышают активность КО.
Существует достаточно много методик по определению активности КО и КДГ в различных биологических средах. В зависимости от цели исследования и имеющегося оборудования используются радиохимические (187, 263), полярографические (321), хемилюминесцентные (268), потенциометрические (284), иммунохимические (ПО, 300), хроматографические (354) методики определения активности КО и КДГ. Все они обладают достаточно высокой
19 чувствительностью и воспроизводимостью, но требуют сложной и дорогостоящей аппаратуры, специальной подготовки исполнителей и вследствие этого редко применяются в клинической практике.
Наибольшей популярностью в практической медицине пользуются фотоколориметрические и спектрофотометрические методики определения активности КО и КДГ. Одни из них основаны на определении конечного продукта КО-реакции: МК, другие — на регистрации изменений экстинкций растворов в процессе окисления субстратов (22, 170, 218, 277). Известны методики, позволяющие определять раздельно оксидазную и дегидрогеназную активность КО (150, 329).
Исходя из того, что наибольшее содержание КО обнаружено в кишечнике и печени, наибольшее количество работ по определению активности КО в клинической практике посвящено болезням печени и желудочно-кишечного тракта.
Выявлено значительное повышение активности КО в сыворотке крови при остром вирусном гепатите (128, 348), менее значительное — при хроническом гепатите, циррозе печени, хроническом холецистите (22, 126). У больных идиопатическим гемохроматозом в ткани печени активность КО или очень низкая, или вообще не определяется (250). При карциноме печени — высокая активность КО в ткани печени и низкая активность энзима в плазме крови (354). Высокая активность КО определяется в сыворотке крови при остром панкреатите (14), алкогольном токсикозе (152, 257), ожоговой болезни (203, 282), отеке легких (104), гиповолемическом шоке (105), сепсисе (180), в лимфоцитах больных иммунодефицитом (45), аденоматозном полипозе (320). Очень высокая активность КО выявлена в атеросклеротических бляшках кровеносных сосудов (285).
В последние 10-12 лет появились работы по исследованию активности КО, преимущественно в сыворотке крови, при некоторых ревматических заболеваниях.
20 Многие работы свидетельствуют о повышении активности КО в сыворотке (плазме) крови больных ревматоидным артритом (РА) с высокой активностью процесса (4, 5, 6, 58, 85, 88), остеоартрозом (ОА) с синовитом (36, 67, 86), системной склеродермией (ССД) (59, 75, 78), СКВ (35, 75, 76, 77, 78), люмбоишалгией (74), хронической ревматической болезнью сердца в период обострения (3, 15, 61), подагрическим артритом (ПА) (9, 85, 134), остеохондрозом позвоночника (73), в биоптатах кожи больных псориатическим артритом (228).
Лишь единичные работы посвящены исследованиям активности КО и КДГ в клетках периферической крови, в которых показано повышение активности КО в эритроцитах и снижение активности КДГ у больных ССД в лимфоцитах (62), а у больных РА повышение активности КО в эритроцитах и снижение активности КДГ в лимфоцитах (1).
Высокая активность КО наблюдается при многих воспалительных заболеваниях и КО-тест можно считать острофазовым показателем, не уступающим в ряде случаев показателям СОЭ и СРБ.
5'-нуклеотидаза (ЕС 3.1.3.5, 5'-рибонуклеотид-фосфогидролаза, 5'-НТ) — фермент ПМ, катализирующий реакцию:
5'-НТ
5'-рибонуклеотид + НгО > рибонуклеозид + ортофосфат
5'-НТ относится к классу гидролаз, расщепляющих сложные эфирные связи фосфомоноэстеров (165, 325). Молекула энзима представлена одной полипептидной цепью, состоящей из 589 аминокислотных остатков (356). Молекулярная масса фермента колеблется от 60 000 до 120 000 Да, что зависит от источника, из которого был выделен фермент (112, 130). 5'-НТ имеет димерную структуру с наличием субъединиц и генетически обусловленных изоферментов (113, 186, 192).
Фермент в качестве субстратов может использовать более 10 нуклеоти-дов (266). Оптимальность субстрата для 5'-НТ зависит от источника выделения фермента. Если же 5'-НТ выделена из синовиальной жидкости, то сродство энзима к субстратам по степени уменьшения будет выглядеть следующим образом: ЦМФ>УМФ>д-АМФ=д-ЦМФ=АМФ>ИМФ (353). Если же фермент выделен из плаценты человека и его сродство к 5'-АМФ принять за 100%, то сродство к другим субстратам представлено следующим образом: ЦМФ — 122%, ГМФ — 68%, ПМФ — 63%, КМФ — 28% (167).
Активность 5'-НТ во многом зависит от рН среды: для энзима мембран лимфоцитов оптимум рН — 7,5 (260), сердца крысы — рН 9,5 (267), синовиальной жидкости — рН 7,5-9,5 (353).
Ионы двухвалентных металлов в концентрации до 3-4 мкмоль активируют 5'-НТ, а свыше 5 мкмоль — ингибируют фермент (269, 353). Активируют энзим ионы магния, цинка, марганца (199, 335), глюкокортикоиды (292), некоторые цитокины (231), паратиреоидный гормон (314), простаглан-дины Е-2 (91, 142). По поводу влияния АТФ на активность цитозольной 5'-НТ имеются разноречивые мнения (198, 267, 270).
Ингибиторами 5'-НТ считаются инсулин (230), гамма-интерферрон (143), АДФ (266, 353), этанол (188), фенобарбитал (143), холестерин (346), никель (106), неорганический фосфор (269, 273), ксантиновые производные (173).
При электрофорезе сыворотки крови в агаровом геле получено две изоформы 5'-НТ (144, 213), на ацетатцеллюлозе — три фракции с 5'-НТ активностью (275), в полиакриламидном геле получены также три фракции, обладающие 5'-НТ активностью: одна большая и две маленькие фракции (266).
Различают две формы 5'-НТ: цитозольную (эндо-5'-НТ) и мембрано-связанную (экто-5'-НТ), локализующуюся на внешней клеточной плазматической мембране (106, 160, 251). Обе формы имеют одинаковое сродство к
22 5'-АМФ и 5'-ГМФ (198, 245). В синовиальной жидкости две трети 5'-НТ находятся в цитозольной форме, а одна треть — в виде экто-5'-НТ (353). В плазме крови преобладает экто-5'-НТ (23).
Активность 5'-НТ обнаружена в печени (220, 308, 345), мозге (111, 163, 237), сердце (226, 259, 274), простате (312), селезенке и тимусе (158), костях (184), суставном хряще (338), синовии (175), эндотелии кровеносных и лимфатических сосудов (50, 219, 248), ретикулоэндотелиальнои ткани (326).
Сведения о количественном содержании 5'-НТ в различных органах и тканях весьма противоречивы (178, 219). Это связано как с видовым различием животных, так и с методическими подходами. Известно, что 5'-НТ, выделенная из различных тканей, имеет свои специфические особенности, и для определения ее активности требуются различные условия: вид буфера, субстраты, активаторы и т.д. (267, 352). Так, если определять активность 5'-НТ в экстрактах тканей из различных органов в одной и той же инкубационной среде, получить интенсивное представление об органном распределении энзима не удастся.
Учитывая специфику тканевых 5'-НТ, у человека выявлено следующее распределение активности энзима в процентном соотношении: гипофиз — 21,2%, щитовидная железа — 4,8%, простата — 80%, печень — 0,9%, почки — 1,5%, мозг — 1,3% (127). Активность 5'-НТ у человека в В-лимфоцитах выше, чем в Т-лимфоцитах, а в незрелых клетках ниже, чем в зрелых (132, 174).
Имеются сведения о содержании 5'-НТ в тканях крыс: сердце — 100%, печень — 61%, почки — 65%, легкие — 84%, мозг — 34%), скелетные мышцы — 20% (18). В сердце крыс активность 5'-НТ в 5 раз выше, чем у человека (332). В тканях птиц максимальная активность 5'-НТ выявляется в селезенке (308). Наибольшее содержание 5'-НТ определяется в ядре клетки (226, 337, 340).
Наиболее изучена роль 5'-НТ в реакции по превращению АМФ в аденозин, который оказывает разнообразные воздействия многие функции организма. За счет регуляции аденозина в крови 5'-НТ влияет на тонус кровеносных сосудов и содержание кислорода в тканях (225, 254, 303). Установлена роль 5'-НТ в регуляции свертываемости крови, катаболизме белка, нейроме-диаторной деятельности (122, 171, 296). Предотвращение избытка аденозина достигается уменьшением концентрации АМФ ниже константы Михаэлиса для 5'-НТ. Энзим способствует поступлению нуклеотидов в клетку, участвует в регуляции энергетического заряда клетки, созревании лимфоцитов, иммунном статусе (108, 115, 143, 256, 334).
Определение активности 5'-НТ с субстратом АМФ затруднено наличием в биологических средах щелочной фосфатазы (ЩФ), которая также использует АМФ в качестве субстрата, что заставляют искать различные методические подходы для нивелирования влияния ЩФ (107, 120, 351).
Методы определения активности 5'-НТ можно условно разделить на три группы:
По определению продуктов дефосфорилирования АМФ.
По содержанию неорганического фосфора при реакции с солями молибдена.
По содержания аммиака, высвобождающегося после дезаминирова-ния аденозина.
Методики первой группы просты в исполнении, но имеются сложности в подборе оптимальных концентраций субстрата (153, 218).
Методики второй группы основаны на окрашивании неорганического фосфора при взаимодействии с молибдатом аммония и регистрации интенсивности этой окраски (306, 349).
Методики третьей группы базируются на определении свободного аммиака, образующегося в ходе катализируемой реакции. Для этого требуется введение в инкубационную среду дополнительного фермента — аденозинде-заминазы (АДА) (120, 287). Подобные методики очень чувствительные и по-
24 зволяют определять активность 5'-НТ в 20 мкл сыворотки с точностью до 0,0005 МЕ/мин (281).
Имеются методики по определению активности 5'-НТ с введением в инкубационную смесь двух ферментов: АДА и гуаниндезаминазы (109), а также четырех ферментов: КО, каталазы, нуклеозидфосфорилазы, и альде-гиддегидрогеназы (195). Указанные методики точны, чувствительны, надежны, но коммерческая стоимость чистых ферментов не позволяет широко использовать их в клинической практике.
Весьма чувствительными и точными являются радиоизотопные методы и методы ядерно-резонансной спектроскопии (227, 253, 351), хроматографи-ческие (276, 323, 336), но все они дорогостоящие и мало используются в клинической практике. Известны также флюорометрические и иммунологические методы определения активности 5'-НТ (209, 347).
Выбор методики зависит от целей исследования, наличия оборудования и количества проводимых исследований.
Определение активности 5'-НТ в сыворотке крови достаточно широко используется в клинической практике.
Известно о повышении активности 5'-НТ при острых диффузных поражениях печени (54, 164, 176, 252), хроническом панкреатите (191), остром лейкозе (189, 279), инфаркте миокарда (17, 66, 96, 255, 358), опухолях молочной железы (11, 12, 344), гломерулонефрите (233), о снижении активности 5'-НТ при иммунодефицитных состояниях (249, 265, 309), ожоговой болезни (31) и силикозе (288).
До настоящего времени методы определения активности 5'-НТ не нашли широкого использования в ревматологической практике.
Имеется ряд работ, свидетельствующих о повышении сывороточной активности 5'-НТ у больных РА (5, 6, 85, 161), но результаты исследований противоречивы и во многом зависели от клинических особенностей заболевания. Значительное повышение активности 5'-НТ выявлено в синовиальной
25 жидкости больных РА (162, 327) и снижение активности энзима в лимфоцитах крови (1, 30, 34).
Повышение активности 5'-НТ в сыворотке крови обнаружено при обострении ПА (60, 84, 89) и ОА с синовитом (84, 87, 98, 352).
Имеются данные о повышении активности 5'-НТ (цитохимический метод) в лимфоцитах и нейтрофилах у больных анкилозирующим спондилоартритом, реактивными артритами (30).
Единичные работы свидетельствуют о повышении активности 5'-НТ в сыворотке крови больных СКВ (16, 35, 76) и о снижении активности энзима в лимфоцитах крови (гистохимический метод), что объясняется наличием антител к 5'-НТ (16, 30, 33, 34, 359). Сообщается о снижении активности 5'-НТ (биохимический и цитохимический методы) в лимфоцитах больных ССД и о повышении активности энзима в плазме и эритроцитах (30, 42, 43, 359).
Таким образом, данные литературы свидетельствуют о существенных колебаниях активности КО, КДГ и 5'-НТ при многих внутренних заболеваниях, в том числе и ревматических. Тем не менее, комплексных исследований активности КО, КДГ и 5'-НТ в трех биологических средах: лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови при СКВ не проводилось. А, учитывая, что в патогенезе СКВ ведущее значение имеют иммунологические процессы, в которых принимают участие энзимы ПМ, нам представляется, что подобное комплексное исследование активности энзимов будет способствовать не только улучшению диагностики заболевания, но и выяснению патогенетических механизмов СКВ с биохимических и иммунологических позиций, а также объективизации контроля эффективности проводимой терапии.
Часть П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 2. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ
2.1. Больные системной красной волчанкой
Под наблюдением в условиях стационара находились 54 больных СКВ, из которых 49 (90,7%) женщин и 5 (9,3%) мужчин. В исследование включались больные, добровольно согласившиеся на участие и предоставившие информированное согласие. Были соблюдены принципы конфиденциальности, уважения автономии личности.
Возраст больных находился в пределах 22-60 лет. Средний возраст больных мужчин — 44,4±2,7 (а=6,0), женщин — 39,2±1,3 (а=8,78), всей группы больных — 39,9±1,2 (а=8,87) лет. Преобладали больные в возрасте 31-40 лет (44,4%) и 41-50 лет (29,6%), что отражено в таблице 1.
Таблица 1
Пол и возраст больных СКВ
Средняя продолжительность заболевания составила 7,19±0,54 (а=3,97) лет, минимальная — 1 год, максимальная — 15 лет. Преобладали больные с длительностью заболевания до 5 лет (38,9%) и 6-10 лет (35,2%). Тем не менее, прослойка больных с продолжительностью болезни более 10 лет так же была довольно значительной (25,9%).
Диагностика заболевания проводилась на основании всестороннего клинического обследования больных с использованием инструментальных (УЗИ органов грудной и брюшной полостей, ЭКГ, ЭхоКГ, рентгеновское ис-
27 следование грудной клетки, суставов, РЭГ, ФГС), лабораторных (общий анализ крови и мочи, билирубин, тимоловая проба, мочевина и креатинин крови, коагулограмма, общий белок и его фракции, СРБ, серомукоиды, иммуноглобулины А, М, G, ЦИК, РФ, АНФ, антитела к н-ДНК, энзимные исследования и др.) методов, диагностических критериев Американской ревматологической ассоциации (АРА), международного реферативного центра ВОЗ, в соответствии с рабочей классификацией СКВ, принятой в нашей стране (39, 53, 69, 70, 95, 201, 215, 216, 328). По необходимости для консультации привлекались офтальмолог, невролог, гастроэнтеролог, отоларинголог, дерматолог, ангиохирург и др. Большинство больных неоднократно проходили лечение в ревматологическом отделении ГКБ № 25 г. Волгограда.
Градация больных по степени активности патологического процесса и характеру течения заболевания проводилась на основании клинических и лабораторных показателей, предложенных сотрудниками НИИ ревматологии (г. Москва), в соответствии с отечественной классификацией СКВ, а также с использованием шкал индексов SLAM (Systemik Lupus Activity Measure), рекомендованных АРА (69, 70, 201, 215, 216, 328).
Оценки степени активности по отечественным критериям и шкале SLAM совпали, и у 15 (27,8%) больных констатирована I степень, у 30 (55,6%) — II степень и у 9 (16,7%) больных — III степень активности патологического процесса. Мы также попробовали оценить степень активности по шкале SLEDAI (Sistemik Lupus Erythematosus Disease Activity Index), исходя из которой (табл. 2) I степень активности процесса определялась у 14 (25,9%) больных, II степень — у 26 (48,1%) и III степень — у 14 (25,9%) больных СКВ. Мы считаем, что оценка степени активности патологического процесса более точна по отечественным диагностическим критериям и шкале SLAM, так как они ориентированы на клинические и лабораторные показатели, отражающие интенсивность воспалительного процесса. А по шкале SLEDAI большое значение придается патологии психического статуса, почек, глаз, которая оценивается весьма высокими баллами. И если у больного имеются
28 снижение психомоторной активности, головные боли, нарушение зрения, патология в мочевом осадке, то по баллам это будет соответствовать самой высокой активности патологического процесса, что по нашему мнению не всегда соответствует действительности. Ведь не исключено, что патология мочевого осадка, нарушение зрения, нарушение некоторых функций мозга обусловлены органическими поражениями соответствующих органов и систем под влиянием активного «волчаночного» процесса, но их клинические и лабораторные проявления могут частично остаться и после купирования активности процесса. Исходя из этого, мы в определении степени активности патологического процесса при СКВ не ориентировались на шкалу SLEDAI.
Таблица 2
Степень активности процесса у больных СКВ по различным критериям
Использование же шкалы SLAM целесообразно в клинической практике не только из-за диагностической ценности, но и в оценке эффективности проводимой терапии больных СКВ, учитывая баллы в процессе лечения.
Хроническое течение заболевания установлено у 17 (31,5%) больных, подострое — у 32 (59,3%) и острое течение — у 5 (9,3%) больных. Взаимосвязи характера течения и активности патологического процесса представлены в таблице 3.
Как видно из представленных данных, хроническое течение чаще наблюдалось при минимальной активности процесса (70,6%), подострое — при II степени (78,1%) и острое течение заболевания — только при III степени (100%).
Таблица З
Взаимосвязи активности процесса и характера течения СКВ
Определенный интерес представляло изучение взаимосвязей между характером течения заболевания и его продолжительностью, что нашло отражение в таблице 4.
Таблица 4 Длительность болезни и характер течения
Как видно из таблицы, хроническое течение заболевания наиболее часто наблюдалось при длительности болезни свыше 10 лет (41,2%), но достаточно часто и при продолжительности заболевания не более 5 лет (29,4%) и при продолжительности заболевания 6-10 лет (29,4%). Средняя продолжительность заболевания с хроническим течением составила 9,53±0,96 (о=3,97) лет. Минимальная — 4 года, максимальная — 15 лет.
Подострое течение наблюдалось практически в равной мере при длительности болезни 6-10 лет (40,6%) и не более 5 лет (37,5%) и значительно реже — свыше 10 лет (21,9%). Средняя продолжительность болезни при по-достром течении — 6,69±0,6 (а=3,36) лет, минимальная — 2 года, максимальная — 13 лет.
Острое течение преобладало при длительности болезни не более 5 лет (80%) и только в 20% случаев — при продолжительности 6-10 лет. При длительности заболевания свыше 10 лет острого течения ни у одного больного не наблюдалось. Средняя продолжительность при остром течении — 2,4±0,93 (а=2,07) лет, минимальная — 1 год, максимальная — 6 лет.
При длительности болезни не более 5 лет преобладало подострое течение (57,1%), 6-Ю лет — также подострое (68,4%) и при продолжительности свыше 10 лет в равной степени наблюдалось хроническое (50%) и подострое (50%) течение заболевания.
Нами также были изучены наиболее часто наблюдаемые клинические и параклинические проявления СКВ, что представлено в таблице 5.
Представленные данные свидетельствуют о том, что наиболее часто отмечались поражения кожи (94,4%) в виде дискоидных очагов, эритемы, фотосенсибилизации, крапивницы и суставов (94,4%): артралгии, артриты.
Поражение почек наблюдалось более чем у половины больных (51,9%), проявившееся нефритическим, нефротическим и пиелонефритическим синдромами. С такой же частотой (51,9%) отмечалось и поражение сердца с преимущественным поражением перикарда и реже — эндокарда и миокарда. Поражение легких наблюдалось в 42,6% случаев в виде плеврита, пневмони-та с одышкой при физической нагрузке, болями в грудной клетке, сухим кашлем. Нейропсихические расстройства отмечались в 51,9% случаев, представленные в виде вегетодистоний, полиневрита, парестезии, галлюцинаций, эпилептиформных припадков, головных болей, преходящих нарушений мозгового кровообращения.
Из параклинических показателей наиболее часто выявлялись антитела к н-ДНК (70,4%), ЦИК (70,4%), СРБ (72,2%), СОЭ (77,8%), лейкопения (51,9%), анемия (48,1%), выраженность изменений которых прямо зависела от степени активности патологического процесса.
Таблица 5
Основные клинико-лабораторные показатели и синдромы
у больных СКВ
На основании анамнестических данных в дебюте болезни ведущее место занимал суставной синдром (64,8%), поражение кожи (51,9%), немотивированная общая слабость, субфебрилитет (53,7%).
У большинства больных (85,2%) отмечались комбинированные поражения различных органов и систем. У 48 (87%) больных имелась группа инвалидности по основному заболеванию.
Всем больным проводилась комплексная гормонально-медикаментозная терапия. Доза глюкокортикоидов (в пересчете на преднизо-лон) варьировала от 15 до 90 мг в сутки и зависела от степени активности процесса и наличия висцеритов. Болезньмодифицирующие средства (цикло-фосфамид, азатиоприн, метотрексат) использовались у 32 (59,3%) больных, пульс-терапия — у 8 (14,8%) больных, плазмаферез - у 9 (16,7%) больных. Нестероидные противовоспалительные препараты и различные симптоматические средства использовались у большинства больных.
2.2. Больные дискоидной красной волчанкой (контрольная группа)
Под наблюдением находились 24 больных ДКВ, из которых 9 (37,5%) мужчин и 15 (62,5%) женщин. Средний возраст больных составил 39,4±2,2 лет. Средняя продолжительность болезни — 4,8±0,9 лет.
Клинические проявления ДКВ были представлены ограниченными очагами на коже, которые в своем развитии проходили несколько стадий. Первичным симптомом была эритема с четкими границами, сначала отечная, затем инфильтрированная с легким ливидным оттенком. Очаги склонны к сливанию с образованием бляшек, покрытых чешуйками, при удалении которых видны роговые шипики, которые внедряются в устье фолликулов или сальных желез (симптом дамского каблука, являющийся патогномоничным признаком ДКВ). Также весьма специфическим признаком ДКВ является симптом Бенье-Мещерского: боль при удалении чешуек с очагов (83). Наиболее характерными симптомами для ДКВ были: 1. Эритема. 2. Инфильтрация очага. 3. Фолликулярный гиперкератоз. 4. Рубцовая атрофия.
По периферии дискоидных бляшек часто присутствовали телеангиэкта-зии, зоны пигментации и депигментации. Очаги поражения кожи чаще наблюдались на щеках и спинке носа (33,3%), изолированно на спинке носа (25%), волосистой части головы (12,5%), лобной части (8,3%). Имели место очаги также в области шеи, ушных раковин, слизитых полостей рта, под глазами.
Размеры очагов: от 1 до 5-6 см в диаметре. Преобладание в очагах эритемы, инфильтрации свидетельствовало об обострении процесса, а наличие атрофии, пигментации — о затухании процесса. У всех наблюдаемых нами больных имели место как свежие очаги кожных поражений, так и очаги с атрофией и пигментацией.
Жалобы больных в большинстве случаев носили невротический характер. В 75% случаев отмечался зуд кожи, следы расчесов (20,8%), в 12,5% — артралгии в суставах кистей.
По данным амбулаторных карт в 16,6% случаев определялся хронический гастрит с пониженной секрецией, в 20,8% — артериальная гипертензия, но установить их прямую связь с прогрессированием ДКВ не удалось.
Появление болей в суставах часто сопровождалось обострением кожного процесса. Лабораторные исследования у больных ДКВ выявили сниже-
34 ниє гемоглобина менее 13 г/л в 12,5% случаев, СОЭ выше 15 мм/час — в 8,3%, гамма-глобулины > 20% — в 8,3%, СРБ (+ и более), ЦИК > 4 ед. — в 8,3%) случаев. АНФ у всех больных отрицательный. Иммуноглобулины А > 2,2 г/л — в 8,3%, М > 1,2 г/л — в 4,2% и G > 12 г/л — в 12,5% случаев. Содержание антител к н-ДНК у всех больных было на уровне нормы. Лечение больных ДКВ проводилось опытными врачами-дерматологами в кожвендис-пансере и областной клинической больнице №1. Кровь для анализа у больных бралась однократно в первые 2-3 дня после обращения к врачу.
Некоторые аспекты пуринового метаболизма в биологии и медицине
Пуриновый метаболизм представляет собой совокупность процессов синтеза и катаболизма пуриновых нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ, ИМФ, ГМФ, ГДФ), нуклеозидов (аденозин, гуанозин, ксантозин, инозин) и оснований (аденин, гуанин, ксантин).
О важности пуриновых нуклеотидов известно достаточно много: они оказывают выраженное влияние на проницаемость клеточных мембран, свертываемость крови, секрецию простагландинов, принимают участие в окислительно-восстановительных реакциях, входят в состав коферментов НАД, НАДФ, ФАД (19, 20, 21, 72, 93). Кроме того, они участвуют в синтезе нуклеиновых кислот, регуляции кровообращения, энергетических процессов (49, 56,81,97).
Не менее значима и роль пуриновых нуклеозидов, из которых наиболее известен аденозин, образующийся из АМФ под воздействием 5 -НТ. Особо выделяется роль аденозина в регуляции иммунных процессов. Его низкие концентрации в лимфоцитах тормозят созревание, пролиферацию и дифференциацию клеток, угнетают супрессорную функцию Т-лимфоцитов, а высокие концентрации подавляют активность естественных киллеров (65, 66, 92, 94, 221, 310, 319, 342). Аденозин способствует синтезу АТФ, оказывает антиаритмическое и гипотензивное действие, участвует в регуляции сосудистого тонуса, свертываемости крови (25, 26, 28, 256). Известно о нейромедиатор-ной роли аденозина, его участии в продукции опухолевого некротизирующе-го фактора, в передаче внеклеточных сигналов в клетку (48, 80, 91, 100, 146, 182). Аденозин используется также для синтеза некоторых антивирусных препаратов (аденинарабинозид, аденинмоноцистеин), ему присущи антиги-поксическое и антиадренергическое свойства (24, 37).
Важную биологическую роль играет также гуанозин, являющийся межуточным субстратом ПМ. С увеличением содержания гуанозина и неорганического фосфора в клетке нарастает синтез гуаниновых нуклеотидов: ГМФ, ГДФ и ГТФ (159). Гуанозин обладает выраженным кардиотоническим и антигипоксическим действием (27, 29, 145, 242, 243), участвует в регуляции взаимодействия гормонов с рецепторами клеток и синтезе белка (290).
Известно о положительном влиянии гуанозина при острой кровопоте-ре, использовании его в качестве консерванта крови (79).
Структурные аналоги гуанозина, гуаниновые нуклеотиды используются в фармацевтике для синтеза антивирусных препаратов (ацикловир, зови-ракс, рибовирин, виразол), угнетающих синтез ДНК вирусов (37, 79, 339). Производные гуанозина (8-бромгуанозин, 8-меркаптогуанозин) обладают выраженными иммуномодулирующими свойствами, а комбинация гуанозина с ГМФ используется в лечении злокачественных опухолей (90, 166, 295).
Недостаточно изучена роль пуриновых оснований: аденина, гуанина, ксантина, но их наличие в структуре ДНК свидетельствует о их несомненной важности (57). Известно, что повышенные концентрации аденина подавляют трансплантационный иммунитет (37), а синтетические аналоги пуриновых оснований (6-меркаптопурин, азатиоприн, теобромин) успешно используются в клинической практике (10).
Как синтез, так и катаболизм пуриновых производных представляет собой многоступенчатый каскад энзимных реакций с множественными межуточными соединениями, контролирующими нуклеиновый обмен по типу обратной связи (рис. 1).
В физиологических условиях процессы синтеза и катаболизма пуринов находятся в динамическом равновесии, и их соотношение всегда поддерживается в необходимых пропорциях, но при патологических состояниях эти соотношения могут нарушаться, что может быть использовано в медицине с диагностическими целями, а коррекция нарушенных звеньев ПМ может оказаться мощным патогенетическим средством лечения многих заболеваний. АДА — аденозиндезаминаза, АФРТ — аденинфосфорибозилтрансфераза, 5 -НТ — 5 -нуклеотидаза, ПНФ — пуриннуклеозидфосфорилаза, ФРПФ — фосфорибозил-пирофосфат
Ниже представлены обобщенные сведения о биологической роли, физико-химических свойствах некоторых ферментов ПМ, активность которых была изучена нами в трех биологических средах у больных СКВ.
Ксантиноксидаза (ЕС 1.2.3.2., ксантин-кислород-оксидоредуктаза) — фермент, катализирующий окисление ксантина, гипоксантина до МК на заключительном этапе ПМ (247, 297).
Своеобразием этого фермента является наличие двух форм: 1. НАД+ -зависимая дегидрогеназа (ЕС 1.2.1.37., Д-форма, ксантиндегидрогеназа, КДГ), окисляющая ксантин или гипоксантин до МК с образованием восстановленной формы НАД (НАДН) и 2. НАД - независимая форма (ЕС 1.2.3.2., О-форма или КО), также окисляющая ксантин или гипоксантин с образованием МК с одновременным восстановлением молекулярного кислорода и продукцией супероксидных радикалов и хлорноватистой кислоты, являющихся мощными оксидантами, инициирующими перекисное окисление ли-пидов с повреждением клеточных мембран (40, 125, 154, 172, 298).
В физиологических условиях во многих тканях человека преобладает КДГ, но при патологии чаще всего происходит трансформация Д-формы в О-форму (КДГ в КО). Подобное наблюдается при ряде воспалительных процессов (99, 169, 248, 269, 292), рентгеновском облучении (47), гипоксических состояниях (335), избытке в тканях протеолитических энзимов (103, 119).
Гипербарическая оксигенация тканей, дитиотрейтол способствуют трансформации КО в КДГ, что может быть использовано в клинической практике (119, 334).
Молекулярная масса КО около 300 000 Да (133, 304). Молекула энзима состоит из двух субъединиц с равной молекулярной массой (246). В качестве простетических компонентов молекула фермента содержит два атома молибдена (44, 205, 338), 8 атомов кислотолабильной серы (82, 100), 8 атомов не-геминового железа (190, 246), ванадий (313), концевые остатки гистидина, цистеина, аргинина (114, 177), две молекулы ФАД (317).
Больные дискоидной красной волчанкой (контрольная группа)
Под наблюдением находились 24 больных ДКВ, из которых 9 (37,5%) мужчин и 15 (62,5%) женщин. Средний возраст больных составил 39,4±2,2 лет. Средняя продолжительность болезни — 4,8±0,9 лет.
Клинические проявления ДКВ были представлены ограниченными очагами на коже, которые в своем развитии проходили несколько стадий. Первичным симптомом была эритема с четкими границами, сначала отечная, затем инфильтрированная с легким ливидным оттенком. Очаги склонны к сливанию с образованием бляшек, покрытых чешуйками, при удалении которых видны роговые шипики, которые внедряются в устье фолликулов или сальных желез (симптом дамского каблука, являющийся патогномоничным признаком ДКВ). Также весьма специфическим признаком ДКВ является симптом Бенье-Мещерского: боль при удалении чешуек с очагов (83). Наиболее характерными симптомами для ДКВ были: 1. Эритема. 2. Инфильтрация очага. 3. Фолликулярный гиперкератоз. 4. Рубцовая атрофия.
По периферии дискоидных бляшек часто присутствовали телеангиэкта-зии, зоны пигментации и депигментации. Очаги поражения кожи чаще наблюдались на щеках и спинке носа (33,3%), изолированно на спинке носа (25%), волосистой части головы (12,5%), лобной части (8,3%). Имели место очаги также в области шеи, ушных раковин, слизитых полостей рта, под глазами.
Размеры очагов: от 1 до 5-6 см в диаметре. Преобладание в очагах эритемы, инфильтрации свидетельствовало об обострении процесса, а наличие атрофии, пигментации — о затухании процесса. У всех наблюдаемых нами больных имели место как свежие очаги кожных поражений, так и очаги с атрофией и пигментацией.
Жалобы больных в большинстве случаев носили невротический характер. В 75% случаев отмечался зуд кожи, следы расчесов (20,8%), в 12,5% — артралгии в суставах кистей.
По данным амбулаторных карт в 16,6% случаев определялся хронический гастрит с пониженной секрецией, в 20,8% — артериальная гипертензия, но установить их прямую связь с прогрессированием ДКВ не удалось.
Появление болей в суставах часто сопровождалось обострением кожного процесса. Лабораторные исследования у больных ДКВ выявили сниже ниє гемоглобина менее 13 г/л в 12,5% случаев, СОЭ выше 15 мм/час — в 8,3%, гамма-глобулины 20% — в 8,3%, СРБ (+ и более), ЦИК 4 ед. — в 8,3%) случаев. АНФ у всех больных отрицательный. Иммуноглобулины А 2,2 г/л — в 8,3%, М 1,2 г/л — в 4,2% и G 12 г/л — в 12,5% случаев. Содержание антител к н-ДНК у всех больных было на уровне нормы. Лечение больных ДКВ проводилось опытными врачами-дерматологами в кожвендис-пансере и областной клинической больнице №1. Кровь для анализа у больных бралась однократно в первые 2-3 дня после обращения к врачу.
Забор крови у пациентов проводился в утренние часы из локтевой вены до приема пищи. Активность энзимов в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови определялась в день забора крови или на следующий день.
В работе использовалась химическая стеклянная посуда (пробирки, пипетки), которая предварительно силиконировалась. С этой целью пробирки, пипетки заполняются раствором силикона (5% или 10% раствор дихлорме-тилсилана или трихлорметилсилана в толуоле) на 10 минут, а затем содержимое выливается в отдельную посуду (можно использовать повторно 2-3 раза). Силиконированная посуда промывается дистиллированной водой, высушивается в перевернутом виде в течение 20 минут и затем помещается в сушильный шкаф на 1,5 часа при температуре 150 -160С до полного высыхания. Кровь из локтевой вены в количестве 5-6 мл помещается в силикони-рованную пробирку, в которую предварительно добавляется 3,8% раствор цитрата натрия (из расчета 0,1 мл на 1 мл венозной крови), добавляется 5-6 мл 0,9% раствора хлористого натрия, и содержимое пробирки тщательно перемешивается.
Выделение клеток крови проводилось по методике Boyum (1968). С этой целью нами использовался лимфосеп (Lymphoseparation medium) фирмы «JCN Biomedicals» с плотностью раствора 1,077-1,079 г/мл (64, 129, 130). Затем в центрифужную пробирку помещается 3 мл лимфосепа и по стенке пробирки наслаивается 5 мл забранной крови. Соотношение кровь-лимфосеп может колебаться от 1:2 до 1:4. Далее проводится центрифугирование в течение 20 минут при 2000 об/мин. За этот период эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки, над ними находится слой лимфосепа и выше — слой плазмы. Между плазмой и лимфосепом должно четко контурироваться белесоватое кольцо — скопление лимфоцитов. Затем осторожно, с помощью пастеровской пипетки с загнутым концом, не допуская перемешивания, извлекаются лимфоциты в объеме 1-1,2 мл и переносятся в центрифужную пробирку, в которую затем добавляют 6 мл 0,9% раствора хлористого натрия, перемешивают и проводят центрифугирование при 1500 об/мин. в течение 10 минут.
Определение активности ксантиндегидрогеназы в лизатах клеток и плазме крови
Энзим катализирует гидролиз АМФ до аденозина и ортофосфата: 5 -НТ АМФ + Н20 аденозин + ортофосфат Для определения активности 5 -НТ использовалась методика, предложенная Wood R., Williams D. (1981), основанная на измерении количества неорганического фосфора в результате дефосфорилирования АМФ под влиянием 5 -НТ (350). При использовании АМФ в качестве субстрата его дефос-форилирование происходит не только за счет 5 -НТ, но и за счет неспецифических ЩФ, что лишает реакцию специфичности. В данной методике этот недостаток устраняется путем введения в инкубационную среду хлористого никеля, полностью ингибирующего активность 5 -НТ. Вследствие этого в методике в одной пробе определяется общая фосфатазная активность (5 -НТ и ЩФ), а в другой пробе — только активность ЩФ (активность 5 -НТ ингиби-рована никелем). Разница между общей фосфатазной активностью и активностью ЩФ дает значение активности 5 -НТ. Необходимые реагенты: 1. 0,05 М мединаловый буфер, рН 7,5 (при t=37C). 2. АМФ-двунатриевая соль 6 Н20 (499 мг растворить в 100 мл дистиллированной воды). Готовить ежедневно, или хранить в замороженном виде отдельными порциями. 3. 0,1 М раствор хлористого никеля: растворить 2,38 г хлористого никеля в 100 мл дистиллированной воды. 4. Натриевая соль лаурил сульфата: 10 г растворить в 1000 мл дистиллированной воды. Сохраняется в течение 7-8 дней при температуре +4С. 5.
Олово хлористое/гидразина сульфат: растворить 28 мл концентрированной серной кислоты (х.ч.) в 700 мл бидистиллированной воды, добавить 2 г гидразина сульфата и довести водой объем до 1000 мл. Для приготовления рабочего реагента добавить 0,2 г хлористого олова (при постоянном перемешивании) в 1000 мл раствора гидразина сульфата. Затем профильтровать. Раствор стабилен в течение 2 недель при комнатной температуре. 6. Кислотный молибденовый раствор (6 ммоль/л): растворить 35 мл концентрированной серной кислоты в 700 мл бидистиллированной воды, охладить, добавить 10 г молибдата аммония и довести водой до 1000 мл. 7. Основной фосфатный раствор (6 ммоль/л): растворить 0,408 г обезвоженного однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2РО4) в 500 мл деионизированной воды. 8. Рабочий стандартный раствор (300 мкмоль): к 1 мл основного фосфатного раствора (реагент 7) добавить 19 мл деионизированной воды (1:20). Использовать в день приготовления. Ход определения: Для проведения анализа у одного пациента необходимы 4 пробирки, которые маркируются как «опыт», «контроль-1», «кон-троль-2» и «стандарт». Последовательность исследования представлена в таблице 6.
Перемешать, выждать 15 минут (для развития окраски) и измерить абсорбцию при 618 нм на спектрофотометре (можно ФЭК-М) всех проб против «контроля-2» где Аопыт, АКОНТр и Аставд означают экстинкции соответствующих растворов против «контроля-2». Объем и время выражены в мл и минутах. Поскольку показатели объема плазмы (лизатов клеток), растворов, мо-лярность в данной методике являются постоянными величинами, при внесении их в формулу она приобретает следующий вид:
При сокращении (после умножений постоянных величин) формула упрощается и выглядит следующим образом: При определении активности 5 -НТ в лимфоцитах использовалась суспензия нативных лимфоцитов, так как по данным литературы (252) 95-98% энзима содержится в клеточной мембране, и поэтому в лизатах лимфоцитов активность 5 -НТ небольшая. Как и для других ферментов, описанных выше, активность 5 -НТ в плазме рассчитывается в нмоль/мин/мл, в лимфоцитах — на 1 мл, содержащий 1 х 107 клеток, в эритроцитах — на 1 мл, содержащий 1 х 109 клеток. Методики расчета активности энзима на клетки крови описаны выше. Результаты исследований обрабатывались с помощью методов вариационной статистики и программы «STATISTICA 6.0».
Активность энзимов в крови здоровых людей
Исследования активности энзимов были проведены в крови (плазма, лизаты эритроцитов и лимфоцитов) 33 практически здоровых людей, среди которых 18 (54,5%) мужчин и 15 (45,5%) женщин. Средний возраст мужчин — 36,1±2,8 (а=11,8), женщин — 36,4±2,6 (о=10,2), всей группы — 36,2±1,9 (а= 10,9) лет. Энзимные показатели крови, представленные в таблицах 7-9, анализировались в зависимости от пола и возраста, но существенной зависимости активности всех энзимов от этих факторов не выявлено (р 0,05), но содержание МК в плазме крови мужчин было выше, чем у женщин (t=4,9; р 0,001). Корреляционные связи между активностями энзимов в различных биологических средах представлены в таблице 10. В плазме определялись высокие обратные связи между КДГ—КО, прямые умеренные между КО—5 -НТ и обратные умеренные между КДГ— 5 -НТ; в лимфоцитах — обратные умеренные связи между КО—КДГ и КДГ—5 -НТ, прямые умеренные между КО—5 -НТ; в эритроцитах — обратные умеренные связи между КО—КДГ, прямые умеренные между КО— 5 -НТ и слабые обратные между КДГ—5 -НТ. Нами также были изучены корреляционные связи между активностями одного и того же энзима в различных средах исследования (табл. 10). Определялись прямые высокопрочные связи между КОлимф.—КОэр., КДГлимф.—КДГэр., 5 -НТэр.— 5 -НТпл., 5 -НТлимф.—5 -НТпл., прямые умеренные связи между КОэр.—КОпл., КДГэр.—КДГпл., 5 -НТлимф.— 5 -НТэр., прямые слабые связи между КОлимф.—КОпл. и КДГлимф.—КДГпл.
С целью установления границ условной нормы активности энзимов в крови здоровых людей (референтные пределы) нами была использована формула: М±2а, исходя из которой, 95% возможных результатов у здоровых не должны выходить за эти границы. Результаты представлены в таблице 11. Оригинальные энзимные исследования у больных СКВ в трех биологических средах (лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови) проводились в первые 2-3 дня поступления в стационар, через 10-12 дней лечения и перед выпиской из стационара, в стадии начинающейся клинической ремиссии. При поступлении на лечение у больных СКВ (всей группы) индекс SLAM (табл. 12) составил 4,42±0,26 (а=1,91) баллов, индекс SLEDAI — 22,8±1,84 (а=13,5) баллов, индекс повреждения — 8,15±0,43 (а=3,14) баллов. В плазме крови (табл. 13-14) при поступлении в стационар, по сравнению со здоровыми, определялось увеличение содержания МК (t=2,5; р 0,05), повышение активности КО (р 0,001), снижение КДГ (р 0,001) и 5 -НТ (р 0,001); в лизатах эритроцитов (табл. 15) — снижение активности 5 -НТ (р 0,001), статистически незначимое повышение активности КО (р=0,065) и снижение КДГ (р=0,058); в лизатах лимфоцитов (табл. 16) — снижение активности всех энзимов (все р 0,001). Анализ корреляционных связей между активностями энзимов у больных СКВ (всей группы) при поступлении на лечение показал, что по сравнению со здоровыми, в плазме (табл. 17) поменялись направления и прочность всех взаимосвязей между энзимами: между КО—КДГ обратные высокопрочные связи стали умеренными обратными, между КО—5 -НТ умеренные прямые связи сменились на слабые обратные, а обратные связи между КДГ— 5 -НТ сменились на умеренные прямые связи.
В лизатах эритроцитов (табл. 18) также, по сравнению со здоровыми, выявлены значительные метаморфозы: между КО—КДГ значительно уменьшилась прочность обратных связей, между КО—5 -НТ прямые уме ренные связи сменились на слабые обратные, а между КДГ—5 -НТ слабые обратные связи поменялись на слабые прямые. В лимфоцитах (табл. 19), практически, не изменились взаимосвязи между КО—5 -НТ, но между КО—КДГ умеренные обратные сменились на прямые высокопрочные связи, а между КДГ—5 -НТ умеренные обратные связи сменились на прямые обратные. некоторых энзимных показателей: в плазме крови (табл. 14) снизилась активность КО (р 0,01) и наметилась тенденция к повышению активности КДГ (р=0,18) и 5 -НТ (р=0,09); в лизатах эритроцитов (табл. 15) за этот период лечения существенной динамики энзимных показателей не произошло, и только наметились тенденции к снижению активности КО и повышению КДГ и 5 -НТ (р 0,05); в лизатах лимфоцитов (табл. 16) повысились активности всех энзимов: КО (р 0,01), КДГ (р 0,05) и 5 -НТ (р 0,001).
![Клинико-патогенетическое значение исследования активности ксантиноксидазы, ксантиндегидрогеназы, пуриннуклеозидфосфорилазы и 5'-нуклеотидазы в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ревматоидным артритом [Электронный ресурс]](/i/i/4391/194221.png "Клинико-патогенетическое значение исследования активности ксантиноксидазы, ксантиндегидрогеназы, пуриннуклеозидфосфорилазы и 5'-нуклеотидазы в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ревматоидным артритом [Электронный ресурс] Агафонова Наталья Львовна")
![Клинико-патогенетическое значение определения активности гуаниндезаминазы, гуанозиндезаминазы, пуриннуклеозидфосфорилазы и гуанозинфосфорилазы в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных системной красной волчанкой [Электронный ресурс]](/i/i/4241/204213.png "Клинико-патогенетическое значение определения активности гуаниндезаминазы, гуанозиндезаминазы, пуриннуклеозидфосфорилазы и гуанозинфосфорилазы в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных системной красной волчанкой [Электронный ресурс] Брагина Татьяна Геннадьевна")
