Клинические и генетические особенности семейного ревматоидного артрита (РА) Шарапова Евгения Павловна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА I. Обзор литературы 10

1. Клинико-генетические особенности семейного и спорадического РА 10

1.1 .Значимость генетических факторов при РА 10

1.2. Клинические особенности семейного и спорадического РА 15

1.3. Клинический полиморфизм семейного РА 16

2. Феномен антиципации при РА 19

3. Ревматоидный артрит и гены HLA-DRB1 23

3.1 Номенклатура и генетическая организация HLA комплекса 23

3.2. Гены HLA-DRB1 и ревматоидный артрит в популяциях 25

3.3. Гены HLA-DRB 1 - маркеры риска или тяжести РА? 28

3.4. Семейный РА и гены HLA-DRB1 33

ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 38

ГЛАВА III. Собственные данные 50

1 .Клинические особенности семейного и спорадического РА 50

2. Анализ клинического полиморфизма в семьях с повторными случаями РА ...54

3.Феномен антиципации при РА 62

4. Характеристика распределения генов HLA-DRB 1* и аллелей гена HLA- DRB 1 04 в семьях с повторными случаями РА 66

ГЛАВА IV. Обсуждение результатов 84

Выводы 106

Практические рекомендации 108

Список литературы. 109

Приложение 128

• Клинические особенности семейного и спорадического РА
• Номенклатура и генетическая организация HLA комплекса
• Анализ клинического полиморфизма в семьях с повторными случаями РА
• Характеристика распределения генов HLA-DRB 1* и аллелей гена HLA- DRB 1 04 в семьях с повторными случаями РА

Введение к работе

Широкая распространенность ревматоидного артрита (РА) (0,6-1,3%), быстрое прогрессирование болезни, приводящее к ранней инвалидизации, высокая временная нетрудоспособность и значительная семейная агрегация заболевания определяют социальную значимость болезни [3]. Большое количество исследований, посвященных изучению причин возникновения РА, показало, что он относится к заболеваниям с наследственной предрасположенностью. Одним из доказательств наследственной предрасположенности к РА является семейная агрегация, заболевания. [12,16,101]. Так, F.Wolfe с соавторами показали, что около 11% пробандов с РА имеют родственника, страдающего этим заболеванием [184]. Десятикратное превышение распостраненности РА в семьях по сравнению с популяцией отметили также AG.Wasmuth с коллегами. [176]. Однако конкретные механизмы, обусловливающие возникновение повторных случаев в семьях, остаются до конца не решенными. Определенный вклад в решение этой проблемы могут внести исследования по изучению особенностей клинической картины заболевания в семьях с повторными случаями болезни и у больных спорадическим РА.

В последние годы проводились работы, целью которых являлось выявление демографических, клинических и иммуногенетических особенностей семейного и спорадического РА. Однако результаты этих исследований весьма противоречивы: одни авторы сообщают о более тяжелом течении заболевания и более раннем начале РА в семьях с повторными случаями РА [97,98], другие -не находят достоверных различий в возрасте начала РА и в клинической картине у пробандов этих двух групп [29,51,134,185]. Кроме того, многоцентровое международное исследование [30] семей больных РА с повторными случаями заболевания показало, что демографические, клинические и иммуногенетические характеристики РА в различных популяциях имеют свои отличительные черты.

5
В связи с вышеизложенным, представляет интерес сравнительное изучение
клинических особенностей семейного (РАс) и спорадического РА (РАсп), а
также генетических механизмов, детерминирующих клинический

полиморфизм РА в семьях русской популяции.

При изучении конкретных механизмов предрасположенности к РА
внимание исследователей было привлечено, в первую очередь, к системе HLA,
важной функцией которой в иммунном ответе является связывание и
презентирование процессированных чужеродных антигенов для их
распознавания Т-лимфоцитами. Многочисленные популяционные

исследования подтвердили наличие ассоциации генов HLA-DRB1* с РА [74,83,115,126,129,159,172]. Высокодостоверная ассоциативная связь выявлена для гена DRB1*04 в большинстве изученных популяций, а для гена DRB1*01 -в некоторых [113]. Внедрение молекулярных методов в исследовательскую практику позволило установить, что только некоторые аллели гена DRB1*04 (0401,0404,0405,0408) наиболее сильно ассоциированы с РА. [68,131,189]. Среди больных РА европеоидной расы повышена частота гена DRB1*01 и аллелей гена DRB1*04: *0401, *0404, *0408 [121,141, 155,189], а в некоторых популяциях с РА ассоциированы другие HLA-DRB1* аллели, включая *0405, *0101, *1001,*1402 [94,125,129,182,186]. Последующее секвенирование этих аллелей показало, что все они совместно < наследуют высоко консервативную DRB1* аминокислотную последовательность в позиции 70-74 в третьем гипервариабельном регионе (HVR3) [38,72,73]. Этот наследуемый эпитоп (РА-эпитоп, Shared epitop, SE) рассматривается как ответственный за формирование чувствительности к РА. Большое количество сообщений, включая недавние работы [69,76,87,113,172], описывают ассоциацию между РА и SE-несущими аллелями. Изучение ассоциаций аллелей HLA-DRB1 -локуса с клиническим полиморфизмом РА позволило сформулировать концепцию, согласно которой гены HLA-DRB1-локуса являются маркерами не чувствительности, а тяжести РА [93,116,137,150,165]. Однако, несмотря на значительное количество работ

на эту тему, вопрос о степени достоверности этой ассоциации остается открытым. Изучение особенностей клинического полиморфизма РА на семьях с повторными случаями заболевания и его взаимосвязи с генами HLA-DRB1* и аллелями гена DRB1*04 до настоящего времени в русской популяции не проводилось.

Настоящее исследование позволит выявить клинические особенности, семейного и спорадического РА, количественно оценить вклад генетической компоненты и выявить значимость генов HLA-DRB1* и вариантов гена HLA-DRB1*04 в предрасположенности к РА и формировании клинического полиморфизма РАс.

Целью настоящей работы явилось изучение клинических особенностей семейного и спорадического РА, фенотипической и генотипической изменчивости семейного РА и их взаимосвязи в семьях с повторными и множественными случаями РА в русской популяции.

Задачи исследования:

1. Изучить клинические особенности семейного и спорадического РА, оценить степень сходства и различий в клинической картине семейного РА в парах родитель-потомок и сибс-сибс, выявить значимость генетической компоненты.

2. Проверить наличие феномена антиципации при РАс в русской популяции.

3. Изучить значимость генов HLA-DRB1* и аллельных вариантов гена HLA-DRB1*04 в предрасположенности к РА и в формировании клинического полиморфизма в семьях с повторными случаями заболевания в русской популяции.

Научная новизна исследования.

Впервые проведена количественная оценка вклада генетических факторов в детерминацию клинического полиморфизма семейного РА.

Впервые показано наличие феномена антиципации при РА (проявление болезни в более раннем возрасте и в более тяжелой форме среди потомков по

7 сравнению с их родителями) в семьях с повторными случаями заболевания в русской популяции.

Впервые проведено клинико-генетическое исследование в семьях с повторными случаями РА с использованием молекулярных методик и выявлена ассоциация определенных генов риска и их комбинаций с тяжестью и возрастом начала РА в русской популяции.

В результате проведенного молекулярного исследования генов HLA-DRB1 * в семьях больных РА с повторными случаями заболевания для русской популяции впервые показано, что носительство двойной дозы SE существенно увеличивает риск возникновения РА, а отсутствие SE в генотипе больных достоверно уменьшает его. Среди больных с двойной дозой SE максимальный риск возникновения РА выявлен у носителей гетерозиготных генотипов (имеющих два разных аллеля, относящихся к SE) и несколько меньший у носителей гомозиготных генотипов (имеющих два одинаковых SE).

Установлено, что аллель *0408 при РАс обладает протективным действием: носители аллеля *0408 имеют более поздний возраст начала РА и риск развития системных проявлений у них в 12,3 раза ниже, чем у больных, не имеющих данного аллеля.

Практическая ценность работы.

Проведенное исследование клинико-генетического характера дополнило представления о клинических особенностях семейного и спорадического РА, выявило аллели риска возникновения РА и тяжести заболевания в семьях с повторными случаями.

Генотипы *01/0401, *0401/0404, *Х/0401 могут быть использованы в семьях больных РА в качестве тест - маркеров для определения лиц, имеющих более высокую вероятность возникновения РА, а также для прогнозирования течения болезни и выбора оптимальной базисной терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. В формировании клинического полиморфизма семейного РА важную роль играют генетические факторы, вклад которых количественно оценен при анализе сходства и различий клинической картины в парах родитель — потомок и сибс - сибс.

2. У больных семейным РА выявлены более ранний возраст начала
заболевания и тенденция к более тяжелому течению болезни по сравнению с
больными спорадическим РА.

3. В семьях с повторными случаями РА заболевание у потомков проявляется
в более молодом возрасте и часто в более тяжелой форме, чем у родителей
( феномен антиципации при РА в русской популяции).

4. У больных РАс риск развития заболевания увеличивается при
носительстве двойной дозы SE в генотипе, и он существенно выше у
гетерозиготных носителей (имеющих два разных аллеля, относящихся к классу
SE, OR=17,8), чем у гомозиготных носителей (имеющих два одинаковых SE
аллеля, OR=5,8).

5. Носительство гена DRB1*01 в сочетании с аллелями гена DRB1*04
(*0401 и *0404) существенно увеличивает риск возникновения РА в семьях
больных с повторными случаями заболевания. Максимальный риск
возникновения РА выявлен у больных с генотипом *01/0401, т.е. отмечается
отчетливый кумулятивный эффект между геном DR*01 и аллелем *0401 при
их сочетании в генотипе.

6. Носители аллелей *0408 заболевают в более позднем возрасте и риск развития системных проявлений у них значительно ниже, чем у больных, не имеющих данного аллеля. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Российском съезде медицинских генетиков (Курск,2000), на 9-м Азиатском конгрессе

9 ревматологов (Пекин,2000), на III съезде ревматологов России (Рязань, 2001), на Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов и приложения. Библиографический указатель содержит 193 работы, из которых - 26 отечественных и 167 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 28 таблицами.

Работа проведена в отделе эпидемиологии и генетики ревматических болезней ГУ Институт ревматологии РАМН (директор - член-корреспондент РАМН, профессор Е.Л.Насонов).

I. Литературный обзор.

1. Клинико-генетические особенности семейного и спорадического РА. 1.1. Значимость генетических факторов при РА.

Ревматоидный артрит (РА) представляет собой хроническое системное воспалительное заболевание соединительной ткани с прогрессирующим поражением суставов и нарушениями в иммунной системе. Характерной особенностью РА является выраженный полиморфизм, заключающийся в широкой вариабельности симптомов, клинических форм, вариантов течения, а также накопление вторичных случаев РА в семьях, особенно среди родственников первой степени родства.

Этиология РА остается не вполне ясной, что обусловливает широкий поиск средовых и генетических факторов, ответственных за развитие заболевания как в популяции, так и в семьях с повторными случаями РА. Значимая роль генетических факторов в детерминации РА уже подтверждена многочисленными семейными и близнецовыми исследованиями. [48,53,56,86,88,91,95,127,135,174] Одним из доказательств наследственной предрасположенности к РА является семейная агрегация заболевания. Изучением этой проблемы занимались как зарубежные, так и отечественные исследователи. [42,169]. Еще в 1958 г. J.Lawrence и J.Bell [101] показали наличие семейной агрегации РА. Дальнейшие работы также отметили накопление вторичных случаев заболевания у родственников больных РА [12,16,26,52,101,145,184,187]. Так, F.Wolfe и М.А. Khan показали, что 10,9% пациентов с РА имеют вторичные случаи РА среди родственников первой степени родства [184]. Однако не все популяционные исследования, проводимые во многих странах, отметили значительное повышение риска развития РА среди родственников первой степени родства по сравнению с общей популяцией [31,48,50,90,184]. Работы, проводимые в России и включавшие клинические, серологические, рентгенологические методы

обследования родственников больных РА, показали, что распространенность этого заболевания у родственников первой степени родства значительно превышает популяционную: по данным А.В. Орлова-Морозова и Е.Е.Михайлова [12,16]- в 7 раз (4,3 % против 0,59 %); В.В. Якусевича - в 4,3 раза. [26]

Участие генетических факторов в детерминации РА также подтверждено близнецовыми исследованиями. Использование близнецового метода для выяснения наследственной обусловленности заболевания, хорошо демонстрирует взаимоотношение между генотипом и внешней средой. Так, суммарный анализ близнецовых исследований показал, что конкордантность у монозиготных близнецов (МЗБ) составила 30% против 5% у дизиготных (ДЗБ) [53,54,102]. Превалирование высокой степени конкордантности у МЗБ в сравнении с ДЗБ свидетельствует о большем влиянии наследственных факторов, чем средовых, однако низкое ее значение (30%) доказывает недостаточность одних генетических факторов для реализации заболевания. Однако следует заметить, что даже лучшие близнецовые исследования имеют недостатки. Концепция близнецового метода предполагает, что МЗБ являются генетически идентичными. Однако, в процессе развития эмбрионов такие явления, как соматические мутации, инактивация Х-хромосомы и геномный импритинг [104] могут привести к различиям генной активности в парах МЗБ. По мнению РК Gregersen, эти различия могут стать источником дискордантности по аутоиммунным заболеваниям у генетически идентичных индивидуумов [74]. Недооценка истинного уровня конкордантности может также быть вызвана временным разрывом между заболеванием первого и второго близнеца. По наблюдению V. Тагр и НК. Grauda [160] эта разница может составить от нескольких лет до нескольких десятилетий. Исходя из вышеизложенного, доля генетической компоненты в развитии РА значительно выше, чем оценивают проведенные близнецовые исследования, и может доходить до 50% и даже выше [187,11].

12
Являясь мультифакториальным заболеванием, РА имеет следующие
черты, характерные для всех мультифакториальных заболеваний

[11,15,17,22,39,60]:

Достаточно высокая частота в популяции

Клинический полиморфизм, заключающийся в существовании скрытых субклинических и тяжелых форм заболевания

Более раннее начало и некоторое усиление клинических проявлений в нисходящих поколениях

Значительные половые и возрастные различия в популяционной частоте нозологических форм

Относительно низкий уровень конкордантности по манифестным проявлениям болезни у МЗБ, тем не менее существенно превышающий соответствующий уровень у дизиготных близнецов

Сходство клинических и других проявлений болезни у ближайших родственников пробандов

Несоответствие закономерностей наследования простым Менделевским моделям.

Понятие «мультифакториальность» включает в себя достаточно широкий спектр моделей наследования. Примерами крайних вариантов могут служить моногенная модель с неполной пенетрантностью и чисто аддитивная модель наследования, предполагающая участие в детерминации заболевания множества генетических и средовых факторов. Для более четкого понимания механизмов, лежащих в основе возникновения РА в популяции и семьях, предложено несколько моделей наследования РА. Все они основаны на определении степени накопления повторных случаев заболевания в семье по сравнению с встречаемостью болезни в популяции.

По мнению C.O.Carter, A.P.Read, P.Wordsworth и J.Bell [39,135,187] ревматоидный артрит имеет сложный полигенный тип наследования с аддитивным действием генов. Большое количество генов

13 обусловливает практически непрерывную изменчивость, и заболевание возникает только в том случае, когда суммарное действие генов превышает определенный уровень-порог. В пользу полигенного типа наследования РА свидетельствуют высокая его распространенность в популяции от 0,3% до 1,3%, большая частота заболевания у родственников 1 степени родства по сравнению с популяционным контролем, преимущественное поражение женского пола.

Одним из признаков полигенного наследования является зависимость риска развития заболевания у родственников от возраста начала болезни у пробанда. Так, Е.Е.Михайлов, [12] в своей диссертации показал, что частота вторичных случаев заболевания среди родственников пробандов с ранним возрастом начала РА (до 35 лет) превышала популяционную в 8 раз, а для пробандов с поздним возрастом начала — не отличалась от популяционной. При анализе распределения вторичных случаев заболевания среди родственников 1 степени родства выявлена большая агрегация среди родственников пробандов с системными проявлениями по сравнению с родственниками пробандов без системных проявлений. Таким образом, значение генетических факторов в детерминации как РА в целом, так и отдельных его клинических форм и вариантов подтверждается семейными исследованиями.

Сотрудниками отдела эпидемиологии и генетики Института ревматологии РАМН в исследовании на 200 семьях больных РА, собранных методом единичной регистрации, было показано, что распределение заболевания в московской популяции и семьях соответствует модели одного аутосомального двухаллельного локуса с неполной и различной у двух полов пенетрантностью. Полученные значения параметров модели наследования РА: 100%-ная пенетрантность у гомозигот по аномальному аллелю для обеих полов; пенетрантность, равная нулю у мужчин, а также близкая к нулю (0,028%) у женщин, гомозиготных по нормальному аллелю, и, пенетрантность, равная 2% и 6% (для мужчин и женщин соответственно) для

14 гетерозигот по аномальному аллелю, при частоте аномального аллеля равной 2,14%, свидетельствуют о наличии «главного» гена предрасположенности к РА [5]. Однако неполная пенетрантность (в частности гетерозигот), вследствие которой не все носители аномального генотипа проявляют фенотип (заболевание), указывает на влияние других генов, к числу которых могут относиться ассоциированные с РА гены, например HLA.

Для выявления генов предрасположенности к РА было исследовано большое
число разнообразных биохимических и иммунологических маркеров, однако
наиболее значимая роль в формировании подверженности к заболеванию
показана для HLA-DRB1* аллелей, возможно, вследствие общности
аминокислотных последовательностей в третьем гипервариабельном регионе
DRpl цепей. Учитывая данные многочисленных популяционных

исследований, подтверждающих наличие ассоциации генов HLA-DRB*1 с ревматоидным артритом, ряд авторов на семейном материале протестировали модель наследования РА и количественно оценили вклад HLA в структуру генетической компоненты РА. По данным C.M.Deighton [50] он составляет 24,2%-37,3%, а по данным A.S. Rigby и P.Wordsworth с соавт. [139] - не более 30% от общего вклада генетических факторов. По мнению этих авторов, тип наследования РА близок к рецессивному [188].

Таким образом, в настоящее время структура генетической компоненты РА изучена недостаточно, хотя наиболее масштабные исследования предполагают, что РА - мультифакториальное заболевание с выраженным эффектом главного гена. Однако нельзя исключить влияния других «фоновых» генов или их сочетаний на пенетрантность главного гена предрасположенности к РА, чем, возможно, и объясняется клинический полиморфизм РА.

15 1.2. Клинические особенности семейного и спорадического РА.

Наиболее характерной чертой РА является наличие клинического полиморфизма, переходных и смешанных форм этого заболевания, т.е. клинического континуума. Одной из важных задач генетики РА является изучение генетических механизмов, способствующих возникновению заболевания в популяции и среди близких родственников больных РА, а также детерминирующих клинический полиморфизм как у больных без семейного анамнеза, так и у больных в семьях с повторными и множественными случаями заболевания. В настоящее время остается не ясным вопрос: почему же возникают вторичные случаи РА в семьях, что обусловливает их возникновение и существуют ли генетические маркеры, способные предсказать возникновение РА и повторных случаев РА в семьях? Частично помочь решению этой задачи могут исследования по изучению внутрисемейного клинического полиморфизма и сравнению клинической картины РА у больных с семейным анамнезом и у больных спорадическим РА.

В последние годы проводились работы, целью которых являлось сравнение демографических, клинических и иммуногенетических особенностей РА в семьях с повторными случаями заболевания (РАс) и у больных РАсп. [29,30,51,97,98,185]

C.K.Kwoh с соавт. [97] приводят данные, полученные в США, в которых был проанализирован возраст начала заболевания у больных с РАс по сравнению с РАсп. Оказалось, что возраст начала РА у пробандов РАс и РАсп существенно различался и составил 41 год против 48 лет соответственно.

Аналогичные результаты получены в Финляндии [98], где возраст начала РА у больных из семей с повторными случаями РА достоверно отличался от больных РА без семейного анамнеза (42,0 и 46,5 соответственно, р=0,0020).

Другие результаты были получены F.Wolfe с соавторами [185], которые проанализировали клинические и демографические особенности у больных РАс и РАсп. Для анализа были взяты 96 пациентов из семей с

множественными случаями РА и 860 пациентов без семейного анамнеза, которые наблюдались в течение 10 лет. Данные обследования не выявили статистически значимых отличий по демографическим (пол, возраст начала болезни), а также по клиническим показателям тяжести болезни (длительность заболевания, шкала боли, шкала нетрудоспособности, сила сжатия кистей, число болезненных/воспаленных суставов, рентгенологическая стадия болезни, частота хирургических вмешательств - эндопротезирования). Однако авторы статьи предлагают с осторожностью относиться к результатам данного исследования, т.к. выборка семей РАс была небольшой.

Отсутствие различий в возрасте начала РА при семейном и спорадическом РА отметили также T.R.D.J. Radstake с коллегами в Нидерландах [134], где данные показатели практически не отличались в этих группах. Авторы отметили различия лишь при анализе возраста начала РА у пробандов мужского пола.

Таким образом, учитывая полученные противоречивые литературные данные, представляется интересным изучение клинического полиморфизма у больных с семейным и спорадическим РА в русской популяции.

Следует отметить, что о вкладе генетической компоненты в развитие клинического полиморфизма в семьях с повторными случаями РА можно судить только косвенно по работам, в которых сравниваются семейный и спорадический РА, а также РАс в различных популяциях. Представляется интересным определение значимости генетической компоненты в детерминации клинического полиморфизма РАс в русской популяции.

1.3. Клинический полиморфизм семейного РА

Демографические, клинические, иммуногенетические показатели у больных РАс могут иметь значительные отличия в различных популяциях. Так, в Европе с 1996 по 1998 гг. проводилось многоцентровое международное исследование клинических и иммуногенетических особенностей РАс [30], в

17 которое были включены 271 семья с пораженными парами сибсов (565 пациентов с РА) из Бельгии, Франции, Италии, Испании, Нидерландов, Португалии. Анализировались как демографические (пол, возраст начала заболевания) и клинические показатели (ревматоидный фактор, продолжительность болезни, наличие системных проявлений, рентгенологическая стадия), так и HLA-DRB1* - олиготипирование, которое показало большие различия между Европейскими странами.

78% включенных в исследование больных были женщины, средний возраст начала болезни- 44 года, 79% больных были серопозитивны. Найденные различия между больными из европейских стран касались продолжительности болезни (11-18 лет), преобладания эрозивного артрита (70-93%), ревматоидных узелков (15-44%), наличия синдрома Шегрена (5-38%), наличия системности (3-16%) (р < 0,05 во всех случаях). Таким образом, оказалось что:

более позднее начало РА отмечалось у больных из Испании и Нидерландов (45-47 лет против 41-44 в других странах)

эрозивный РА преобладал в Бельгии и Испании

- ревматоидные узелки чаще встречались у больных из Бельгии и
Нидерландов

синдром Шегрена выявлялся с большей частотой в Бельгии, Испании, Нидерландах

системные проявления РА были более характерны для пациентов из Бельгии, Италии.

Кроме того, в данной работе были проанализированы внутрисемейные особенности РА, что позволило отметить некоторые различия между относительным вкладом генов и факторами окружающей среды.

Известно, что если начало заболевания имеет тенденцию к появлению болезни у членов одной семьи в сходном возрасте, то главную роль здесь играют генетические факторы. Но если календарный год начала болезни

18 различается у них незначительно, то роль окружающей среды не менее важна. В этом и предыдущих исследованиях [145,153] возраст, календарный год начала и другие клинические и рентгенологические характеристики значительно различались среди пораженных пар сибсов. Авторы считают, что такая гетерогенность РА даже внутри семей может лимитировать возможность выявления генетических факторов в предрасположенности к РА [30] .

Следует отметить, что оценка степени генетической детерминированности клинического полиморфизма РА в доступной нам литературе встречалась лишь в единичных работах. Так, Л.И.Алексеева, 1982, Л.И.Беневоленская с соавторами, 1992, [1, 2] выявили более существенную агрегацию РА среди родственников первой степени родства у пробандов, имеющих РА с системными проявлениями (5,3%), по сравнению с родственниками пробандов, не имеющих системных проявлений (2,3%). Наследуемость подверженности для РА без системных проявлений равнялась 58%, а для РА с системными проявлениями - 56%. Коэффициент генетической корреляции между ними был равен 1.0, что позволило трактовать их в рамках мультифакториальной модели с преимущественно аддитивной генетической компонентой как формы, детерминированной одной подверженностью с двумя порогами.

В своей работе Е.Е.Михайлов [12] показал, что совпадение клинических форм РА в семьях пробандов, имеющих РА с системными проявлениями, было отмечено в 16,7% случаев, а в семьях пробандов больных РА без системных проявлений - в 87,5%) случаев. В данном исследовании была также обнаружена тенденция к накоплению вторичных случаев заболевания при 3-4 рентгенологической стадии РА.

Таким образом, РА, как мультифакториальное заболевание с полигенным характером наследования, предполагает участие многих генетических и средовых факторов в развитии заболевания. Исследования различных генетических маркеров могут помочь в изучении значимости их в

19 предрасположенности к РА и формированию клинического полиморфизма в семьях с повторными случаями этого заболевания.

2. Феномен антиципации при РА.

Понятие "антиципация" (упреждение) используют для описания такого явления наследственной передачи заболевания, при котором начало его манифестации становится более ранним в каждом последующем поколении, а тяжесть заболевания увеличивается [24]. Несмотря на то, что об антиципации сообщалось еще в начале века, долгое время считали, что это явление связано со статистическим артефактом, обусловленным смещенной регистрацией семейных случаев заболевания. Так, лица, которые заболевают рано и тяжело, как правило, оказываются не в состоянии воспроизвести потомство и не попадают в последующую выборку родителей. Другим фактором антиципации может быть то, что более ранние и тяжелые случаи заболевания регистрируются во время исследования чаще, чем более легкие и с поздним началом. Возможны и другие причины, приводящие к более ранним проявлениям заболевания в поколениях. В то же время утяжеление заболевания может быть связано с тем, что организм при более раннем проявлении болезни как бы в большей степени повреждается вследствие большей длительности заболевания. Эти факты послужили основой для вывода о том, что антиципация должна рассматриваться как статистический артефакт [24].

Началом научных исследований проблемы антиципации следует считать работы французского психиатра Б. Мореля. Он выделил группу психозов, различные варианты которых являются признаками процесса "вырождения", поражающего отдельные семьи. Под "вырождением" автор понимал болезненные отклонения от нормы, которые обладают свойством передаваться по. наследству, все более усиливаясь. Новый взгляд на явление антиципации возник в связи с использованием молекулярно-генетических подходов при

20 изучении таких заболеваний, как миотоническая дистрофия [78] и синдром ломкой Х-хромосомы [67].

Было высказано предположение, что в основе этого явления лежит нестабильность генома, а именно — неизвестное ранее явление, связанное с расширением области тринуклеотидных (триплетных) повторов у здоровых и пораженных индивидов. У здоровых лиц число таких повторов было невелико (около 10), а у больных их число резко увеличивалось, достигая 1000 [117]. Такое явление было названо экспансией тринуклеотидных повторов.

Тринуклеотидные повторы представляют собой неотъемлемую часть человеческого генома, в котором нуклеотидная последовательность на определенных участках состоит из повторяющихся, следующих друг за другом (так называемых тандемных) триплетов, т.е. трех определенных нуклеотидов. Всего в структуру ДНК может входить 10 различных по составу триплетов. Они принадлежат к классу простых повторяющихся последовательностей, или микросателитов. Характерной особенностью всех микросателитных последовательностей является их полиморфизм, т.е. существование большого числа аллелей, различающихся числом копий тандемных повторов и, следовательно, своей длиной. Новейшей' страницей в изучении микросателитных последовательностей явилось открытие их роли в мутагенезе человека. Эти данные послужили основой для проведения клинико-генеалогического исследования, в котором были учтены возможные методические погрешности. Полученные результаты показали, что родители и деды-бабки пробандов. заболевали в более позднем возрасте, чем пробанды [8,23]. Одно из объяснений явления антиципации было основано на предположении о том, что оно представляет собой гомозиготизацию по генам предрасположенности к заболеванию в пределах ограниченного числа поколений за счет ассортативности браков в популяции индивидов с относительно высокой подверженностью проявлению шизофрении [7]. В пользу этой гипотезы свидетельствовали результаты расчета генетической

21 корреляции и наследуемости для ранних и поздних клинических форм эндогенных психозов.

Для каждого конкретного заболевания может различаться как нуклеотидный состав повторов, так и гены, участки которых содержали эти повторы. Описанное явление было классифицировано как мутационное, а новые мутации получили название динамических, так как скорость увеличения количества повторов очень велика, если сравнивать с обычными мутациями, имеющими место в геноме. При этом нестабильность, возникающая за счет мутирования, становится генератором дальнейшей нестабильности. [138]

Обнаружено, что размер области тринуклеотидных повторов влияет на клиническую картину заболевания, при этом в ряду поколений он обычно растет, вызывая повышение тяжести заболевания.

Однако рассмотрение экспансии тринуклеотидных повторов в качестве единственного механизма, лежащего в основе молекулярно-генетической природы антиципации, представляется преждевременным. Так, при изучении взаимосвязи этих двух явлений при миотонической дистрофии было установлено, что наряду с увеличением числа повторов у большинства пар родитель-потомок, были отмечены и исключения, когда наблюдалась обратная корреляция. На изменение числа тринуклеотидных повторов также оказывал влияние пол пораженных родителей, что указывает на роль геномного импритинга в развитии этого заболевания.

Таким образом, начиная с 1991 года, в мире наблюдается настоящий
информационный взрыв, связанный с открытием и изучением совершенно
нового класса мутаций - экспансии нестабильных тандемных

тринуклеотидных повторов. Повышенный интерес, возникший к данному явлению, послужил началом к изучению феномена антиципации в ревматологии.

В1994году Chris Deighton с коллегами [47] сравнили возраст начала РА у родителей и потомков из семей с множественными случаями РА (были

22 использованы семьи из ранее описанных родословных с множественными случаями РА из банка данных Ньюкасла) и поликлинических больных РА, родители которых, как сообщали эти пациенты, также болели РА. В группе поликлинических больных РА пробанды (п=20) описывали более поздний возраст начала РА у родителей, чем свой возраст начала заболевания: 38,3 (95% CI 33,8 to 42,8) против 53,7 (р=0,002); пробанды из семей с множественными случаями (п=7) также показали более ранний возраст начала РА, чем их родители: 32,4 против 43,4 (р=0,1). Примечательно, что возраст начала РА у пробандов из семей с множественными случаями был более молодой, чем у пробандов поликлинических: 32,4 года против 38,3лет (разница статистически недостоверна). В семи пораженных парах мать-пробанд, пробанды имели тенденцию к более тяжелому РА (использовался опросник оценки здоровья, индекс тяжести, титр РФ.)

В 1998году авторы G.D.Wring, M.Regan и C.M.Deighton [190] описали феномен генетической антиципации при узелковой форме остеоартроза (ОА). Обследовались 30 пар родители/потомки с ОА. Было показано, что возраст начала симптомов ОА у потомков составил 43 года (от 38 до 47 лет) против 61 года у родителей (от 58 до 65 лет): р<0,001. В 50% случаев (15 пар) потомки имели сходное или более тяжелое течение заболевания, чем их родители, несмотря на более молодой возраст и меньшую продолжительность заболевания (оценивались количество узелков и вовлечение крупных суставов). Для изучения проблемы антиципации требуется проведение таких исследований, в которых были бы учтены результаты и методы как клинико-генетического, так и молекулярно-генетического подхода. Это означает, что явление антиципации обнаруживается как статистическая закономерность. В связи с этим анализ семейного материала должен быть проведен таким образом, чтобы исключить ложную антиципацию. Для исключения ложной антиципации используют такой подход, когда к родителям пробандов подбирают ряд контрольных групп других родственников. Одной из таких групп являются

23 сибсы родителей (дяди, тетки пробандов). Если в рассматриваемой семье имеет место феномен антиципации, то следует ожидать, что по распределению возраста начала заболевания группа родителей и дядей-теток пробандов окажутся сходными.

Таким образом, экспансия тринуклеотидных повторов создает молекулярную базу для понимания таких интригующих клинико-генетических феноменов, как антиципация, эффект пола родителей при передаче более тяжелых форм заболеваний и фенотипический полиморфизм.

В русской популяции феномен антиципации при РА не изучался.

3. Ревматоидный артрит и гены HLADRB1*

3.1. Номенклатура и генетическая организация HLA комплекса.

HLA комплекс картируется на коротком плече 6-ой хромосомы, занимает приблизительно 0,1% всего генома человека (Campbell and Trowsdale, 1993,1997.) Генетические локусы комплекса HLA сгруппированы в 3 региона, обозначаемые как регионы класса I, класса II, класса III. Гены, кодирующие классические антигены I класса, картируются в трех главных локусах региона класса I: HLA-A, HLA -В, HLA -С.

Регион класса III включает в себя гены фактора пропердина, компонентов комплемента (СЗ и С4), ферментов глиоксалазы, фосфоглюкомутазы, фактор некроза опухоли (TNF) и др. Эти гены по структуре и функциям не относятся к генам системы HLA, а лишь картируются внутри нее.

В регионе класса II основными локусами являются DR, DQ, DP, а также открытые в более позднее время локусы DM, LMP и ТАР.

Остановимся более подробно на генетической организации локуса DR и структуре пептидов (антигенов), кодируемых генами этого локуса.

Каждая молекула класса II представляет собой гетеродимерную структуру, состоящую из а- и Р-цепей. Каждая цепь состоит из аминокислот и

24 подразделяется на III региона: внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный. Внеклеточный регион каждой цепи в свою очередь делится на два домена: домены, проксимально расположенные по отношению к клеточной мембране, и домены, дистально расположенные по отношению к клеточной мембране и содержащие полиморфные последовательности. Полиморфизм в значительной степени связан с pi доменом, в котором имеется три гипервариабельных участка, которые соответствуют аминокислотным остаткам в положении 9-13, 26-37, 67-74.

Система HLA чрезвычайно полиморфна, что связано с наличием большого числа альтернативных вариантов (аллелей) каждого гена, входящих в этот комплекс.

Обозначим на примере антигена DR4 основные этапы эволюционирования методов детекции антигенов/генов системы HLA и их номенклатуры. Первоначально серологическим методом выявлялась антигенная детерминанта, которая получила название HLA-DR4. Параллельное использование клеточных методов исследования позволило выделить несколько аллелей антигена DR4. Они получили название Dw4, DwlO, Dwl3, Dwl4, Dwl5. Классические антигены локуса DR (HLA специфичности) первоначально выявлялись лишь серологическими и клеточными методами и обозначались как DR1, DR2, DR4 и т.д.

В настоящее время, используя молекулярные методы исследования, выявляют гены, которые обозначают как HLA-DRB1*01, *02, *04 соответственно, а варианты генов (аллели), например гена DRB1*04 - HLA-DRB1*0401, *0402, *0404, *0405, *0408, а гена HLA-DRB1*01 - DRB1*0101, DRB1*0102.

Последующее секвенирование этих аллелей показало, что все они совместно наследуют высококонсервативную DRB1* аминокислотную последовательность в позиции 70-74 в третьем гипервариабельном регионе

25 (HVR3) [38,72]. Этот наследуемый эпитоп цепи (так называемый РА-эпитоп, Shared epitop, SE) рассматривается как ответственный за формирование чувствительности к РА. В 1987 году PK.Gregersen предложил Shared epitop hypothesis, которая базируется на предположении, что молекулы 2 класса прямо вовлекаются в этиологию и патогенез аутоиммунных заболеваний [73]. Инициация иммунного ответа требует Т-клеточной активации, а такая активация требует присутствия как чужеродного пептида, так и молекул 2 класса на антигенпрезентирующих клетках (АРС).

3.2. Гены HLA-DRB1* и ревматоидный артрит в популяциях.

В настоящее время достоверно установлено участие генетических
факторов в развитии РА, значимая роль которых подтверждена

многочисленными семейными и близнецовыми исследованиями, и наличие достоверной связи РА с генами HLA-DRB1 * .

Со времени первого сообщения P.Stastny в 1978 году [155] о наличии ассоциации гена HLA-DR4 с РА проводились многочисленные популяционные исследования [126], которые подтвердили эту ассоциацию. Понимание взаимосвязи между РА и генами HLA-DR изменялось в ходе проведения новых исследований, демонстрирующих, что не только ген HLA-DR4 ассоциирован с РА [37,131]. В неевропейских популяциях (Индия, Якима индейцы) с повышением риска РА ассоциировались другие варианты генов HLA-DR (не DR4) [124,181]. При изучении широкого круга популяций появлялись новые интересные данные. Высокодостоверная ассоциативная связь выявлена для гена HLA-DR4 - в большинстве популяций, а для HLA-DR1 - в некоторых. Внедрение молекулярных методов в исследовательскую практику позволило установить, что только некоторые варианты генов л о куса HLA-DRB1 (*0401,*0404, *0405,*0408, *0101, *1001, *1402) [68, 129, 131,182,186,189] наиболее сильно ассоциированы с РА. Эти аллели кодируют аминокислотные последовательности QKRAA или QRRAA в позиции 70-74 третьего гипервариабельного региона молекулы HLA класса П.

26 Консервативный аминокислотный участок в молекуле, кодируемый генами HLA-DRB1 локуса, получил название «общий эпитоп» (РА-эпитоп, Shared epitop, SE). [38,72,73] Этот наследуемый эпитоп рассматривается как ответственный за формирование чувствительности к РА.

В дальнейшем было показано, что вклад гена HLA-DRB1*04 и некоторых
его вариантов в детерминацию заболевания различен. Так, по данным
D.Jawaheer с соавторами [87] у HLA-DRB 1*04-позитивных МЗБ не найдено
значимых различий в уровне конкордантности между гомозиготами

(имеющими в генотипе два гена DR4) и гетерозиготами (имеющими в генотипе только один ген DR4). Между тем было выявлено 5-кратное, возрастание конкордантности в парах МЗБ, имеющих двойную дозу SE, по сравнению с МЗБ, негативными по SE.

Большое количество сообщений, включая недавние работы [76,173], описывают ассоциацию между РА и SE-несущими аллелями. Показано, что все HLA-DRB1 молекулы, несущие SE, ассоциированы с РА, но сила этой ассоциации варьирует в различных популяциях [120].

Так, в европеоидной популяции наиболее ассоциированы с РА аллели
HLA-DRB 1*0401, DRB1*0404, DRB1*0408 и DRB1*0101

[68,121,141,155,189]; в японской и корейской популяциях - 0405 [125,155]; в израильской популяции - HLADRB 1*0101, в испанской популяции- HLA DRB1*1001, *0405 [143,192], в Якима индейской популяции - HLA DRB1*1402. По данным G.M. Mody [115] у темнокожих африканцев наблюдалась ассоциация с РА при комбинации аллелей DRB 1*0401, *0405, а также отмечена ассоциация с DQB 1*0302.

Следует заметить, что ассоциация РА с определенными аллелями генов DRB1* выявлена не только среди популяций, но и среди этнических групп одной популяции. Так, в популяции эмигрантов индейцев в Южной Африке выявлена ассоциация РА с геном DRB1*04 для Muslims и с геном DRB1*10 -

27 для Hindi и Tamils [115]. Ассоциация РА с HLA-DRB1*04 выявлена среди наибольшего числа этнических групп [131]. (Таблица 1)

Таблица 1.

Ассоциация ревматоидного артрита с генами HLA-DRB1 в
различных этнических группах

28 3.3. Гены HLA-DRB1* - маркеры риска или тяжести РА?

В настоящее время сведения о связи генов HLA второго класса и РА
остаются противоречивыми; некоторые исследователи предполагают

связь HLA с риском развития РА, другие - с тяжестью РА. Эта дискуссия была инициирована исследованием, проведенном в Нидерландах, авторы которого [45] не отметили строгой ассоциации между РА и геном HLA-DRB1*04, но выявили связь с рентгенологическим прогрессированием РА. В других работах [90,161] также сообщалось о слабой ассоциации РА и HLA-DRB1*04. Другими исследованиями было показано, что стационарные больные с РА демонстрируют более строгую ассоциацию с геном HLA-DRB1*04 или его аллелями, являющимися SE [48,162,179,188], и эта ассоциация ярко выражена у пациентов с наиболее тяжелыми вариантами РА и синдромом Фелти.

СМ. Weyand с коллегами нашли, что носители двойной дозы SE имеют больший риск развития системных проявлений [179]. Так, больные с генотипом HLA-DRB 1*0401/0401, которые являются истинными гомозиготами, т.к. имеют два одинаковых аллеля, имеют наибольший риск развития органных поражений, а больные с генотипом *0401/0404 (составленные гетерозиготы, т.к. имеют два различных аллеля) - ревматоидных узелков.

Два исследования, проведенных в Великобритании, показали, что наибольший риск развития тяжелого РА ассоциирован с генотипами HLA-DRB 1*0401/0404 и *0401/0401 [128,188]. Однако эти генотипы редко встречались в английской популяции. Между тем имеется несколько сообщений, предполагающих только ограниченное влияние генов HLA-DRB 1 * на тяжесть заболевания [77,151].

Суммируя опубликованные данные о распространенности РА-ассоциированных генотипов в различных популяциях и частоте эрозивного артрита, было показано, что пациенты, являющиеся гомозиготами по SE,

29 особенно если они имеют генотипы HLA-DRB 1*0401/0401 или *0401/0404, имеют наибольший риск развития эрозивного артрита.

В исследовании, проведенном в Канаде в 1995 году М.Е. Suarez-Almazor с соавторами [108], изучалась связь генов DRB 1*01, DRB 1*04 и аллелями гена DRB1*04 с риском развития и тяжестью течения РА. Было показано, что из всех пациентов 54% были ВЯВ1*04-позитивными, 17% - имели ген DRB 1*01 и большинство из них были серопозитивными по РФ. Наиболее часто встречаемыми аллелями были DRB 1*0401 (64%) , *0404 (15%) и *0408 (11%). Анализируя риск развития РА у пациентов, было выявлено, что у гетерозигот DRBl*01/04 он был выше, чем у DRB1*04 - позитивных больных (OR=4,6 и OR=2,3 соответственно), и возрастал у больных с положительным ревматоидным фактором (у DRB1*04 до 2,9, а у DRB 1*01/04 - до 6,9). При анализе тяжести РА у больных, несущих один, два или ни одного аллеля риска, не отмечалось статистически достоверных различий в активности болезни, суставном индексе, наличии системных проявлений, рентгенологическом и функциональном статусе, хотя для ревматоидного фактора была выявлена линейная зависимость с дозой аллелей. Сведения о том, что ревматоидный фактор является предиктором тяжести заболевания в моделях с различными комбинациями генов HLA, а также о значительной ассоциации гена DRB1*04 и DRB 1*01/04 гетерозигот с серопозитивностью, позволяют предположить, что потенциальное влияние этих антигенов на тяжесть РА может быть связано с серопозитивностью. Так, последние наблюдения J.Lee Nelson с соавторами, США, показали сильную ассоциацию гена DRB1*04 с серопозитивным РА у женщин с недавним началом РА. Причем пациенты, у которых РФ был выявлен в первые 18 месяцев от начала болезни, имели более строгую связь с DRB1*04, чем те пациенты, у которых РФ появлялся позднее этого срока. Авторы считают, что ревматоидный фактор является менее важным фактором риска, что подтверждается различными клиническими наблюдениями (развитие тяжелого РА у серонегативных

пациентов, а также отсутствие нарастания тяжести РА у пациентов с двумя аллелями риска при возрастании титра ревматоидного фактора) [119].

В настоящее время многими авторами обсуждается влияние DRB1* аллелей, а также «дозы генов» на тяжесть течения PA. Young А. с коллегами [193] сообщают о найденной ассоциации гена DRB1*04 со скоростью эрозивного процесса, однако работы других авторов этого не подтверждают [177,188]. При анализе отдельных показателей тяжести РА было обнаружено, что группа SE-негативных пациентов показала статистически значимое снижение скорости рентгенологического прогрессирования по сравнению с SE-позитивной группой. Более того, ни один из SE-негативных пациентов не имели системных проявлений, а также значительных деформаций, требующих хирургического вмешательства. Наиболее тяжелое течение РА наблюдалось в группе больных РА с двойной дозой SE. Связь SE аллелей с тяжестью течения РА отмечена как у серопозитивных, так и у серонегативных пациентов. СМ. Weyand с соавторами [179] подтвердили наличие связи генов HLA-DRB1* с тяжелым эрозивным РА у серопозитивных пациентов, 96% которых имели аллели риска, а 46% из них несли два аллеля риска. Y.Toda с группой исследователей также сообщали о нарастании рентгенологического прогрессирования РА у серопозитивных пациентов, несущих два аллеля риска [163]. Между тем описано, что и у серонегативных больных с двойной дозой генов риска можно устойчиво предсказывать наибольшее рентгенологическое ухудшение [133].

Различные исследования имеют цель найти прогностические маркеры РА. Клинические и лабораторные показатели, такие как суставной индекс, острофазовые лабораторные показатели, ревматоидный фактор, часто используемые в клинике, не являются достаточно специфичными, т.к. помогают оценить общую активность заболевания, но не прогноз. Возможными предикторами течения заболевания могут стать генетические факторы (гены HLA), которые, возможно, оказывают болезнь-модифицирующий эффект и позволят идентифицировать на ранней стадии

31 заболевания пациентов с неблагоприятным прогнозом. G.T.Nepom с коллегами, [120] показали, что типирование HLA-DRB1-кластера имеет различное значение на разных стадиях РА: на ранних стадиях РА не отмечается высокой ассоциации с генами HLA-DRB1*, и лишь через 1-2 года, при наличии эрозивного процесса, возрастает ассоциация с генами HLA-DRB1*. По мнению авторов, такие генетические различия в этот временной промежуток ясно показывают генетический вклад HLA в прогрессирование эрозивных форм РА. Выявлена высокая ассоциация DRB1*04 с тяжелыми эрозивными формами РА, тогда как больные с не эрозивным полиартритом не имели ассоциации со специфическими HLA генами. Данные результаты свидетельствуют о том, что генетическое типирование может быть клинически полезным при рутинном обследовании больных с ранним артритом с целью прогнозирования течения болезни и назначения адекватного лечения [61,71]..

Сведения иного характера были получены в аналогичных исследованиях, проводимых в Японии K.Higami с соавторами в 1997году и Нидерландах Van C.HJaarsveld в 1998году у больных с ранней стадией РА, положительных по DRB1*01 и DRB1*04 [82,149,166]. Больных наблюдали в течение 12 месяцев, однако авторы не отметили прогностической значимости этих генов в отношении рентгенологической прогрессии и возрастания функциональной недостаточности. На данные выводы, возможно, повлиял короткий срок наблюдения больных.

Большинство исследований, в которых авторы пытались найти прогностические маркеры РА, являлись ретроспективными и включали пациентов, у которых продолжительность симптомов РА была 5 лет или менее до их первого обращения к врачу [168]. Только немногие авторы проводили длительные проспективные исследования на больных с ранним РА (продолжительность болезни менее 6 месяцев) [64,109]. Недостатками этих исследований являются невозможность стандартизировать сбор анамнеза, недостаточная унифицированность клинических, рентгенологических,

32
биохимических и иммунологических обследований, что снижает

достоверность результатов из-за небольших выборок больных, сопоставимых для оценки тяжести течения и прогноза заболевания.

Исследование, проводившееся во Франции в 1995году, отвечало вышеперечисленным требованиям [41]. B.Combe с коллегами включили в исследование две группы больных, сопоставимых по возрасту и длительности заболевания. Отбор был основан на тяжести суставного поражения, оцениваемого по рентгенограммам. В первой группе (п=71) пациенты имели тяжелый РА со счетом Ларсена больше или равным 4,0 (оценивались рентгенограммы суставов кистей и стоп), во второй группе (п=99) течение болезни было более благоприятным (счет Ларсена менее 2,0; оценивались рентгенограммы всех вовлеченных суставов). Медицинская документация пациентов была изучена ретроспективно, и часть пациентов с неполными данными обследования была исключена. Таким образом, отборочные критерии позволили включить только 47 пациентов в каждую группу. У всех больных проводилась оценка клинических данных (наличие экстраартикулярных проявлений, необходимость хирургических вмешательств, потребность в лекарственной терапии); суставной индекс и шкала нетрудоспособности не были унифицированы и не могли быть оценены. Оценка активности заболевания регулярно проводилась с помощью лабораторных показателей. Иммуногенетический анализ включал НЬА-ОІІВ1*-типирование и олиготипирование генов DRB1 * 01 и DRB1 * 04.

Иммуногенетический анализ продемонстрировал, что главным показателем, который может предсказать неблагоприятный прогноз на ранней стадии РА, является наличие генов DRB1*04 или *01 (95,7% пациентов в первой группе были ассоциированы с DR4 или DR1, по сравнению с 55,3% во второй группе и 37,1% в контроле; два аллеля риска были определены у 34,1% пациентов в первой группе - против 8,5% во второй группе и 7,9% в контроле). В данном исследовании DR1 ассоциировался только с тяжелым РА, в то время

33 как в Северной Америке и Великобритании, по данным других авторов, DR1 был ассоциирован с легким течением заболевания [114,154].

Анализируя влияние SE аллелей на возраст начала РА, данные авторы не отметили отличий между SE -позитивными и SE-негативными пациентами. Однако, по результатам исследования K.Eberhardt было выявлено, что пациенты, не имеющие генов риска, развивают РА в более позднем возрасте и, кроме того, имеют более медленное течение заболевания [59]. В ранних исследованиях [85], в которых использовалось серологическое типирование генов HLA, также предполагалось, что HLA-DR4 более часто наблюдается у пациентов с началом РА в молодом возрасте. Более поздние молекулярные исследования подтвердили эту ассоциацию [106,118,168], особенно у мужчин [106]. Другие исследования не показали значительной связи HLA-DR4 с возрастом начала РА или с полом [81].

3.4. Семейный РА и гены HLA-DRB1*

Большой интерес представляли и представляют работы по изучению семейного РА и его связи с генами HLA-DRB1*, поскольку они дают возможность установить или отвергнуть генетическую природу такой связи. Проводимые зарубежными авторами иммуногенетические исследования показали, что РА ассоциирован с антигенами HLA-DR4, а в семьях с повторными случаями РА также идет накопление этого антигена [44,56,86,88,91,127,135,167,174].

Так, в работе Д.Б.Яковлевой., 1986, у родственников первой степени родства больных РА отмечена тенденция к накоплению антигенов HLA-DR4, также как и у пробандов. Накопление этих антигенов отмечено также и в семьях с множественными случаями заболевания. Данные результаты послужили основанием для изучения клинических и иммуногенетических особенностей РАс.

Проводимое в Европе (с 1996 по 1998 г.) многоцентровое международное исследование клинических и иммуногенетических особенностей РАс пациентов из Бельгии, Франции, Италии, Испании, Нидерландов и Португалии [30] выявило значительные отличия в иммуногенетическом статусе. Было показано, что DRB1*04 преобладал в Нидерландах и Бельгии (81 и 88% соответственно), а в Испании, Португалии, Франции, Италии гены DRB1*04, DRB1*01, DRB1*10 встречались с одинаковой частотой. В целом преобладали аллели *0401 (41%) и *0101 (22%), а аллели *0405, *0408, *0102 встречались менее чем в 8%.

Всего 22% сибсов с РА были негативны по SE аллелю; в то время как 47% несли один SE и 30% - два SE аллеля. Носительство SE аллелей широко варьировало среди стран (р<0,0001): отсутствие SE аллелей в 6-36%, один SE аллель в 41-60%, два SE аллеля в 20-39%.

Выявленные отличия в клинической картине между больными европейских стран (описанные выше в данной главе) могут говорить о том, что фенотипическая гетерогенность может быть обусловлена генетическими факторами, включающими HLA и SE. В настоящее время известно, что имеют значение различия в аллелях, представляющих SE, так как их влияние на прогноз не эквивалентно. Тяжелое течение заболевания ассоциировано с SE [35], с двойной дозой SE и с определенными аллелями гена DRB1*04 [111,122,154,167,180] или их комбинацией, в то время как DRB1*01 может быть ассоциирован с более легким течением РА [154,173]. Подтверждением вышеуказанного могут служить результаты данного исследования, согласно которым наиболее тяжелое течение РА наблюдалось в Бельгии и Нидерландах (преобладание эрозивного РА, системных проявлений заболевания, более частая встречаемость синдрома Шегрена), где отмечалась высокая встречаемость DRB1*04 и двойной дозы SE аллелей. Однако в данном исследовании выборка семей была недостаточно велика, вследствие чего о

35 влиянии иммуногенетических характеристик на течение РА можно только предполагать.

В 1999 г. в Финляндии S.Laivoranta-Nyman с соавторами [98] провели исследование по изучению иммуногенетических различий между пациентами с семейным и спорадическим РА на 129 больных РАс и 217 больных с РАсп. Были обнаружены следующие отличия между этими двумя группами:

4. Повышенную частоту генов DR4 имели пациенты с РАс по сравнению с РАсп (68,2% и 54,8%, р=0,019)

5. SE аллели и гены DRB1*01, DRBl*10 были найдены в большем числе случаев при РАс, чем при РАсп (81,4% и 77,9% соответственно, р - NS). Однако гомозиготы по SE аллелям были более характерны для РАс, чем для РАсп (48,1% и 33,2% соответственно, р=0,0084).

6. Наиболее часто в обеих группах встречались аллели DRB 1*0401 и *0404; и эти аллели, а также DR1, DR10 встречались с одинаковой частотой у пациентов с РАс и РАсп (аллель *0401 встречался более часто, чем *0404 в обеих изучаемых группах).

Как при РАс, так и при РАсп отмечалось снижение частоты гена DRB1*06 по сравнению с контролем (р< 0,01), что может указывать на протективную роль гена DR6. Авторы считают, что полученные результаты подтверждают более строгую ассоциацию с HLA-DR4 у больных РАс, чем у больных РА без семейного анамнеза, и предполагают, что аккумуляция генов «риска» может частично объяснить появление вторичных случаев заболевания в семьях, а также более раннее начало РА у пациентов с семейным РА.

Некоторыми авторами предпринимались попытки найти определенный аллель, который являлся бы маркером семейного РА. Так, в исследовании на семьях с множественными случаями у больных РА было выявлено преобладание аллеля DRB1*0408 (16,7%) по сравнению с *0404 (6,7%). А у больных без семейного анамнеза отмечалось повышение аллеля *0404 (17,9%)

36 по сравнению с *0408 - 3,5%. Авторы считают, что это повышает вероятность того, что аллель *0408 играет более важную роль в семейном РА. [106].

Полагают, что риск возникновения РА, а также тяжесть заболевания тесно связаны с наличием определенных генов риска или их комбинацией. Это подтверждено исследованием, проведенным J.E. McDonagh с коллегами на 17 семьях с повторными случаями РА. [113] Изучалась роль генов HLA-DRB1* в детерминации болезни и тяжести течения. Распределение аллелей в семьях оказалось следующим: 61,7% членов семей были ОШ31*04-позитивными; в 50% из них выявлялся аллель DRB1*0401 и в 10% - 0408. Аллель DRB1*0404 был представлен менее чем в 2%. Среди всех пациентов с РА 87,5% несли SE аллель; у 45% из них определялся единичный SE аллель, у 42,5% - два SE аллеля. Среди здоровых кровных родственников распределение SE аллелей было следующим: 73,9%), 45,5%), 28,4% соответственно, а в контроле - 46%, 34%, 11% соответственно. Таким образом, максимальный риск развития РА наблюдался у гетерозигот SE+/+ (OR=36, 95%) СІ) со следующей иерархией риска: *0401/0404 или *0401/0408 (OR=90); у гетерозигот: *0401/*0404 (OR=30), *01/0401 (OR=18,8) и у гомозигот *0401/0401 (OR=12,5)

Учитывая полученные результаты, можно предположить кумулятивный эффект определенных SE аллелей на риск возникновения РА. Однако HLA-DRB 1*0404 и 0408 аллели не были представлены у гетерозигот с генотипом SE(+)/SE(-) в английской популяции и, следовательно, не могут рассматриваться как самостоятельные факторы риска для PA. J.T. Nepom с соавторами [121] предполагают скорее аддитивный эффект DRB 1*0404 и *0408 аллелей, чем синергический (среди больных РА не было ни одного пациента с HLA-DRBl*0404/*0404).

Другого мнения придерживаются A.MacGregor с коллегами которые считают, что DRB 1*0404 является независимым фактором риска, в отличие от аллеля *0401. [106]

Анализируя тяжесть течения у больных РАс, J.E. McDonagh и группа исследователей [113] отметили у SE-негативных больных отсутствие системных проявлений РА, необходимости приема базисных препаратов и хирургических вмешательств на суставах. При сравнении SE-позитивных (SE+/+) и SE-негативных (SE-/-) больных они отметили более тяжелое течение РА в группе SE(+/+). При детальном анализе тяжести течения РА было выявлено, что гомозиготы * 0401/0401 имели тенденцию к более тяжелому течению заболевания, чем гетерозиготы *0401/0404 и *0401/0408 по сравнению с SE(-/-) группой.

Таким образом, влияние аллелей, представляющих SE, и определенных генотипов на риск возникновения и тяжесть течения РА в различных популяциях не эквивалентно. Изучение генетических механизмов, детерминирующих риск возникновения РА, а также клинического полиморфизма этого заболевания в семьях русской популяции представляется достаточно обоснованным.

38 II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.Организация работы.

Исследование проводилось с 1992 года. Пробандами являлись больные РА, в семьях которых были повторные случаи РА у родственников первой или второй степени родства, и больные РА без повторных случаев заболевания в семье. Практически все больные были направлены в ИР РАМН из поликлиник г. Москвы и Московской области, наблюдались в ИР РАМН и были доступны для осмотра и обследования в условиях ИР. Набор пробандов РАс проводился двумя путями: во-первых, обследовались больные, находившиеся в стационаре ИР РАМН, где при сборе семейного анамнеза выявлялись повторные случаи РА в семье, во-вторых, использовался архив ИР РАМН, отбирались больные ревматоидным артритом, имевшие родственников 1 и 2 степени родства, страдающих РА. Для клинико-генеалогического анализа отбирались семьи только русской национальности. Родственники больных обследовались амбулаторно. Клиническое обследование максимального числа членов семей больных ревматоидным артритом представляет определенные трудности, зато методически более правильно. Составление родословных путем опроса пробандов может приводить либо к завышению числа больных в семье, поскольку различные заболевания суставов широко распространены и нередко трактуются как ревматоидный артрит, либо возможна обратная ситуация, когда пробанд не сообщает врачу о больных родственниках. По этой причине нам приходилось выезжать на дом к пожилым больным, не имевшим возможности приехать в ИР РАМН, и проводить осмотр, забор крови на ДНК, иммунологический и биохимический анализы (рентгенография суставов делалась по месту жительства). В двух семьях матерям сибсов, больных РА, был поставлен диагноз РА при непосредственном осмотре на дому.

На каждого больного и их родственников заполнялась специально разработанная карта обследования, что позволило стандартизировать сбор

39 анамнеза, унифицировать клинические, рентгенологические и иммунологические исследования.

2.МАТЕРИАЛ И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ БОЛЬНЫХ

Исходя из задач исследования, направленных на изучение демографических и клинических особенностей семейного и спорадического РА, для сравнения возраста начала РА в анализ были взяты 42 пробанда РАс и 173 пробанда РАсп. Все пробанды из семей РАсп находились на стационарном лечении в lp.o. РТР РАМН за период с 1995 по 1999годы. На каждую семью составлялась родословная. При наличии родственников пробанда РАсп, подозрительных на заболевание РА, они приглашались в ИР для обследования, что позволило поставить диагноз РА родственникам первой степени родства у двух пробандов из этой группы. Все пробанды и вторичные случаи РАс, а также пробанды РАсп удовлетворяли критериям ACR 1987г. ( таблицы 2 и 3). Исключение составили двое больных РАс, заболевших в возрасте до 15 лет, но которые на момент обследования были серопозитивными и отвечали критериям ACR, 1987г. Пробандам РАс и их больным родственникам диагноз был поставлен в ИР РАМН.

Группу пробандов РАс составили больные из 20 семей, где пораженными являлись родители/потомки; из 16 семей, где больными являлись сибсы и из 6 семей, где больными были тети (дяди)/племянницы (племянники).

Из таблиц 2.и 3 следует, что все пробанды и вторичные случаи из семей с повторными случаями РА, а также пробанды без семейного анамнеза соответствовали критериям ACR, 1987г., Частота ревматоидных узелков и положительный ревматоидный фактор у пробандов с семейным анамнезом были выше, чем у вторичных случаев, причем ревматоидные узелки у пробандов с семейным РА встречались в два раза чаще, чем у пробандов

40 спорадическим РА. Распределение титров ревматоидного фактора у наших больных не анализировались.

Таблица 2

Распределение диагностических критериев ревматоидного артрита (ACR,1987) у больных РАс, отобранных для клинико-генеалогического анализа

Клиническая характеристика больных РАс и распределение их по полу представлены на 88 человек из 42 семей (таблицы 4 и 5) Характеристика на больных РАсп представлена в таблице 6.

Таблица З

Распределение диагностических критериев ревматоидного артрита

у больных РАсп (ACR,1987)

Таблица 4.

Распределение больных РАс по полу.

Таким образом, группу больных РАс составили 9 мужчин и 79 женщин. Группа больных спорадическим РА была представлена только женщинами.

Таблица 5.

Клиническая характеристика больных РА из семей с повторными

случаями

Как видно из таблиц 5 и 6, у пробандов РАс значительно чаще встречается 3-4 стадии РА, чем у пробандов РАсп (71,5% и 45,7% соответственно), системные проявления (50% и 32% соответственно), а также асептические некрозы костей различной локализации (24% и 18,4% соответственно). Однако на данные результаты могла повлиять различная продолжительность болезни у пробандов и их родственников со вторичными случаями РАс и пробандов РАсп (таблица 7) .

Таблица 6.

Клиническая характеристика больных РА без семейного анамнеза

Таблица 7.

Сравнительная характеристика продолжительности болезни у больных РАс и РАсп

* р для продолжительности болезни у пробандов РАс, по сравнению с пробандами РАсп **р для продолжительности болезни у вторичных случаев РАс по сравнению с пробандами РАсп

Таблица 7 демонстрирует, что средняя продолжительность заболевания была достоверно выше у пробандов и родственников со вторичными случаями из семей РАс по сравнению с пробандами РАсп (спорадический РА) и составила 15,3±12,5лет, 10,8±6,7 и 8,22±6,5 лет (соответственно, р=0,000 и р=0,018)

Для решения задач, направленных на изучение фенотипической и генотипической изменчивости РАс, в работе использовался метод классической генетики — клинико-генеалогический. Для данного анализа было отобрано 36 семей, где вторичными случаями являлись родственники I степени родства (в 20 семьях пораженными являлись родители-потомки, в 16 семьях — сибсы).

Молекулярное типирование генов локуса HLA-DRB1* было проведено в 32 семьях (68 больных РА и 75 их здоровых родственников). Эти семьи входили в состав 36 семей, отобранных для клинико-генеалогического анализа. Олиготипирование аллельных вариантов гена DRB1*04 было проведено в 31 семье ( у 66 больных РА и 69 здоровых родственников). Контролем служили

44 135 здоровых (не имеющих РА) доноров города Москвы русской национальности, оттестированных в отделе иммуногенетики Института иммунологии МЗ РФ (зав.отд., проф. Алексеев Л.П.).

3. ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для диагностических целей и решения задач, направленных на изучение значимости генов HLA-DRB1* аллельных вариантов гена DRB1*04 в предрасположенности к РА и формированию клинического полиморфизма в семьях с повторными случаями заболевания, использовались общепринятые меотдики: определение ревматоидного фактора, скорости оседания эритроцитов, гемоглобина и т.п. Кроме перечисленных тестов, проводились молекулярные исследования.

1. Ревматоидный фактор определялся по реакции латекс-агглютинации в иммунологической лаборатории ИР РАМН (зав. профессор Сперанский А.И.). Серопозитивными считались больные, у которых латекс-тест был равен или больше 1/40 .

2.У всех больных РА и их родственников забирались образцы крови в количестве 40 мл и выделялась ДНК. Выделение ДНК проводилось в отделе эпидемиологии и генетики ИР РАМН и осуществлялось м.н.с. Самаркиной Е.Ю.

3. Олиготипирование аллелей HLA DRB1* ( низкоразрешающий метод). Основным материалом для исследования служили 146 образца ДНК, выделенных из мононуклеарных клеток (МК) периферической крови 32 пробандов, 36 больных РА- членов их семей и 78 кровных и некровных родственников. Контрольной группой служили 135 здоровых доноров крови, оттестированных в отделе иммуногенетики Института иммунологии МЗ РФ (зав.отд., проф. Л.П.Алексеев).

Выделение ДНК проводили из 10 мл обработанной ЕДТА периферической крови обследуемых лиц на градиенте плотности верографин-фикола ( р= 1,078) по Воут [36].

ДНК выделяли из МК методом высаливания согласно рекомендациям 12 рабочего Совещания по гистосовместимости [33].

Олиготипирование аллелей гена HLA-DRB1* проводилось

низкоразрешающим (базовым) методом полимеразной цепной реакции с
использованием смешанных сиквенс-специфических праймеров ( PCR-MSSP),
разработанным в Институте иммунологии МЗ РФ [9]. Низкоразрешающее
генотипирование позволяло выявить группы аллелей гена DRB1,

соответствующих серологическим DR-специфичностям (набор реагентов «HLA DR-TEX», производитель - НПО «ДНК-Технология», г. Москва).

Олиготипирование аллелей DRB1* проводилось в два этапа согласно прилагаемой к набору инструкции. На первом этапе использовались две пары олигонуклеотидных праймеров, из которых одна пара фланкировала участок ДНК длиной 247 пар оснований, ответственный за полиморфизм всех серологически выявляемых антигенов DR, а вторая пара праймеров ограничивала синтез участка ДНК длиной 243 пары нуклеотидов, который детерминировал полиморфизм только некоторых серологически выявляемых антигенов и их субтипов: DR3 (17,18), DR5 (11,12), DR6 (13,14), DR8.

Условия проведения ПЦР на первом этапе: денатурация - 94С - 1 минута; 90С - 20 сек., 67С - 2 сек.-7 циклов; 92С - 1 сек, 65С - 1 сек. - 28 циклов, 10С-хранение.

Наличие амплификационных продуктов (одного или двух) проверяли в 1,5% агарозном геле. Амплификация проходила всегда с первой парой праймеров. Реакция со второй парой праймеров зависела от того, имел или не имел индивид в своем генотипе какой-либо аллель из вышеперечисленных (DR3, 5, 6, 8).

На втором этапе образовавшиеся амплификаты служили матрицей для ПЦР ("nested" PCR), в которых использовался набор из 8 пар группоспецифических праймеров, которые фланкировали последовательности нуклеотидов, кодирующих аллели DRB1*01, *03, *04, *07, *08, *09, *10, *11(*05), *12( *05), *13( *06), *14( *06), *15( *02), *16( *02), *17( *03), *18( *03).

Условия проведения ПЦР на втором этапе: 93С - 1 сек, 64С - 2 сек.- 15 циклов.

Визуализацию результатов мультиплексных "nested" PCR проводили в в 3% агарозном геле.

Специфичность образовавшихся продуктов амплификации определяли по их отношению к расположению в агарозном геле полос маркера длин амплифицированных фрагментов pUC19/MspI

4. Олиготипирование аллелей HLA DRB1* 04 (высокоразрешающий метод).

С целью олиготипирования аллелей DRB1*04 все выявленные на первом

этапе ОК4-позитивные (DR4+) образцы были тестированы

высокоразрешающим методом дот-блот-гибридизации с использованием радиоактивномеченных [у Р] АТФ-олигонуклеотидных проб (зондов) [33], позволяющих идентифицировать 17 аллельных вариантов DRB1* 04 (*0401-0417).

Предварительно DR4-no3HTHBHbie образцы были амплифицированы со специфическими праймерами по следующей программе: первоначальная денатурация при 95 в течение 2 мин., далее - 30 циклов денатурации при 94 в течение 30 сек, отжига при 60 в течение 45 сек, и достройки при 72 в течение 45 сек. После 30 циклов такого температурного режима следовала достройка при 72 в течение 5 мин. Амплифицированные продукты размером приблизительно 250 пар оснований визуализировали в 1,5% агарозном геле.

Выбор специфических праймеров (последовательности праймеров приведены ниже) зависел от результатов низкоразрешающего (базового)

47 типирования гена HLA DRB1*. Если при низкоразрешающем олиготипировании в генотипе индивида был выявлен наряду с *04 какой-либо другой аллель DRB1* ( DR4 + / DR4 -), образцы амплифицировали только с одной парой праймеров - 2DRBAMP-4 и 2DRBAMP-B. Если же низкоразрешающим методом был выявлен только DR4, предполагали, что индивиды являются либо истинными гомозиготами, т.е. имеют два одинаковых аллеля DRB1*04, либо являются гетерозиготами по DR4, т.е. имеют два разных аллеля DRB1*04. Для решения вопроса о гомозиготности или гетерозиготности амплификацию проводили с двумя парами праймеров, причем в качестве прямого праймера всегда использовали 2DRBAMP-4, а в качестве обратных праймеров использовали 2DRBAMP-GR и 2DRBAMP-VR. Праймеры 2DRBAMP-4 и 2DRBAMP-GR фланкировали последовательность, включающую полиморфизм аллелей *0401, *0405, *0407, *0408, *0409, *0414, 0415?, *0416, *0417, праймеры 2DRBAMP-4 и 2DRBAMP-VR - полиморфизм аллелей *0402, *0403, *0404, *0406, *0410, *0411, *0412, *0413, *0415.

Последовательности DR4 - специфических праймеров: 2DRBAMP-4 - 5' GTT ТСТ TGG AGC AGG ТТА ААС (кодоны 6-13) 2DRBAMP-B - 5' CCG CTG САС TGT GAA GCT СТ ( кодоны 87-94 ) 2DRBAMP-GR - 5' CTG САС TGT GAA GCT СТС АС ( кодоны 86-92 ) 2DRBAMP-VR- 5' CTG САС TGT GAA GCT СТС СА ( кодоны 86-92 )

Дот-блот-гибридизация была проведена согласно рекомендациям 12 рабочего совещания по гистосовместимости [33] с использованием 16 олигонуклеотидных проб (зондов), меченных со стороны 5'-конца [у " Р ] АТФ в присутствии Т4 полинуклеотидкиназы (фирма "USB"). Олигонуклеотидные пробы каждая длиной 18 нуклеотидов были синтезированы фирмой "Синтол".

С помощью вакуумного прибора " Dot-Blotter " амплификаты ( по 2-5 мкл.) переносили на нейлоновые мемебраные фильтры ( Hybond N + фирмы " Amersham"), фиксировали. Количество фильтров зависело от количества радиоактивномеченных зондов: если в генотипе индивидов выявляли один

48 аллель DR4, использовали 16 олигинуклеотидных зондов, а, следовательно, образцы были нанесены на 16 фильтров. Если же образцы были амплифицированы двумя парами праймеров, полученные амплификаты были нанесены на 32 фильтра.

Фильтры с фиксированными на них образцами амплифицированных продуктов гибридизовали с радиоактивномеченными зондами в течение 2 часов при 54 С в буфере, содержащим 50 mM Tris-HCH (рН=8.0), 3.0 М Tetramethylammonium Chlorid (ТМАС), 2 mM EDTA ( рН=8.0), 5X-Denchart's solution, 0.1% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы селедки. Далее фильтры были дважды отмыты в ТМАС - растворе при 59 С. После высушивания фильтры были экспонированы рентгенологической пленке (Kodak, XAR-5) в течение 2-9 часов. Радиоактивый сигнал от положительно-гибридизованного образца засвечивал пленку, что выявлялось после проявки.

Для последующего анализа все индивиды, которым проводилось олиготипирование, были разделены на три группы в зависимости от наличия или отсутствия аллеля / аллелей, кодирующих SE-эпитоп: SE+/+, SE+/-, SE-/-. (SE: *0401,*0404,*0405,*0408).

Мы не проводили олиготипирование аллелей DRB1* 01, поскольку среди идентифицированных к настоящему времени аллеллей лишь два (*0101 и *0102) практически всегда встречаются у европейцев и относятся к SE. В то же время аллели *0103, *0104, *0105 и *0106 либо чрезвычайно редко, либо вообще не встречаются у европейцев и структурально не входят в SE-эпитоп. Таким образом, мы допустили, что тестированный низкоразрешающим методом DRB1* 01 можно отнести к группе аллелей, кодирующих SE-эпитоп.

Исследование проводилось с.н.с. Гусевой И.А. в отделе эпидемиологии и генетики ревматических болезней ИР РАМН.

4.СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА МАТЕРИАЛА.

Для оценки степени сходства и различий в клинической картине РА в парах родитель-потомок и парах сибсов использовался метод «Каппа-статистика»,

49 при котором сравнивались процент совпадений клинических проявлений у больных РА в семьях с повторными случаями РА (наблюдаемое совпадение) и процент совпадения клинических проявлений РА при случайном распределении признака (ожидаемое совпадение). Вычисляемый по этим величинам Каппа - коэффициент показывает вклад неслучайной компоненты (в нашем исследовании это генетические факторы, в том числе и HLA) в наблюдаемое совпадение двух анализируемых признаков.

Частоты генов и аллельных вариантов системы HLA у исследуемого контингента как в целом, так и подгруппах, а также среди здоровых лиц сравнивали с использованием точного критерия Фишера и критерия хи -квадрат, как по таблицам «2 х 2» (четырехпольные таблицы взаимной сопряженности), так и большей размерности. Сила ассоциаций и значимость анализируемого параметра, как фактора риска, оценивалась с помощью показателя отношения преобладаний ( OR).

Оценка силы влияния аллелей DRB1* локуса на частоту РА в семьях с повторными случаями проводилась с помощью однофакторного дисперсионного анализа.

50 Г л а в a III

СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ

Существование наследственной предрасположенности к РА показано при семейных, близнецовых и популяционных исследованиях, результатом которых явилась констатация значительного повышение риска развития РА среди родственников первой степени родства по сравнению с популяцией. Однако в литературе имеются лишь единичные работы, указывающие на особенности клинического полиморфизма в семьях с повторными случаями РА. Так, в одном исследовании был зафиксирован более ранний возраст начала РА у потомков по сравнению с их больными родителями [47]. В другой работе авторы, сравнивая демографические данные и течение РА у больных с семейным анамнезом и у больных без семейного анамнеза, не нашли достоверных отличий в этих группах [185]. В другом исследовании авторы, сравнивая возраст начала «семейного» ревматоидного артрита и спорадического, указывают на более ранний возраст начала РА у больных из семей с повторными случаями РА [98]. В настоящее время известно, что «семейный» РА имеет в различных популяциях свои отличительные черты, поэтому представляет несомненный интерес поиск как общих, так и отличительных особенностей «семейного» РА в русской популяции, а также изучение генетических механизмов, детерминирующих клинический полиморфизм РА в семьях с повторными случаями РА и семейную агрегацию.

1.КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СЕМЕЙНОГО И СПОРАДИЧЕСКОГО РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА

Учитывая противоречивые результаты, полученные в различных популяциях при сравнении демографических и клинических особенностей семейного РА и при сравнении семейного и спорадического РА [30,98,185], представляло определенный интерес сравнить возраст начала заболевания, а также

51 проанализировать особенности клинической картины РА у больных РАс и РАсп в русской популяции. Таблица 8

Возраст начала РА у пробандов РАс и у больных РАсп

Таблица 9.

Сравнительная характеристика больных РАс и больных РАсп

В сравнительный анализ возраста начала РА были включены 42 пробанда РАс и 173 пробанда РАсп, последовательно поступавшие на стационарное лечение в lp.o. ГУ ИР РАМН за период с 1995 по 1999гг. Было установлено,

52 что пробанды из семей с повторными случаями РА заболевают в более раннем

возрасте, чем пробанды из семей без повторных случаев РА (37,1±12,3 и 45,3 ± 13,5 лет соответственно, р=0,0001). (Таблица 8).

Отмечалось также достоверное увеличение числа больных с семейным РА, заболевших в возрасте до 30 лет включительно (14 из 42) по сравнению с больными РА без семейного анамнеза (29 из 173): 33,3% и 16,7% соответственно, р<0,02.

С целью сравнения клинической картины у пробандов РАс и РАсп использовался метод случай-контроль. Критериями отбора пациентов РАсп служили возраст больных и продолжительность болезни. Из вышеуказанных групп больных были отобраны 32 пробанда РАс (пробанды из семей с повторными случаями, в которых было проведено молекулярное типирование генов локуса HLA-DRB1*) и 64 пациента РАсп из вышеуказанных 173 больных. (Таблица 9)

При анализе демографических и клинических особенностей РА у больных РАс и РАсп были выявлены следующие отличия:

7. достоверно более ранний возраст начала заболевания при РАс, чем при РАсп;

8. большее накопление системных проявлений при РАс, чем при РАсп (50% и 31,3% соответственно);

3. 3-4 рентгенологические стадии среди пробандов РАс встречались несколько чаще, чем при РАсп (75% и 66% соответственно);

4. остеонекрозы при РАс встречались несколько чаще, чем при РАсп ( 34% и 23% соответственно);

5. синдром Шегрена встречался более чем в два раза чаще у пробандов РАсп, чем у пробандов РАс (7,8% против 3,1% соответственно);

6. амилоидоз у пробандов РАс не встретился ни разу, а у пробандов РАсп -только в одном случае (1.6%).

53 Таким образом, при сравнении клинической картины у больных РАс и РАсп достоверных различий выявлено не было, но отмечалась одна интересная особенность, которая заключалась в преимущественной локализации асептических некрозов в головке бедренной кости при семейном РА, в то время как при РАсп, асептические некрозы преимущественно локализовались в области коленных суставов. Так, у больных из семей с повторными случаями РА асептический некроз головок бедренной кости встречался в три раза чаще, чем асептический некроз смежных мыщелков бедренных и б/берцовых костей (67% и 22% соответственно), и в два раза чаще, чем у больных без семейного анамнеза (67% и 33% соответственно).

Таблица 10

Локализация асептических некрозов костей у больных РАс и РАсп

Асептический некроз другой локализации (головки плечевых костей, лучевых и др.) встречался лишь в 11% случаев у больных с семейным анамнезом, а у больных без семейного анамнеза - в 20% случаев (таблица 10).

Таким образом, нами выявлено, что больные РАс заболевают в более раннем возрасте, чем больные РАсп.

54 2. АНАЛИЗ КЛИНИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА СЕМЕЙНОГО РА

Изучение генетических механизмов, обусловливающих возникновение заболевания в популяции и среди близких родственников больных РА, а также детерминирующих клинический полиморфизм болезни в семьях, может помочь, в раскрытии механизмов защиты от манифестации заболевания. Определенный вклад в решение этой проблемы вносят исследования по изучению внутрисемейного клинического полиморфизма РА.

Проведенный клинико-генеалогический анализ базировался на выборке семей с повторными и множественными случаями РА (36 семей). В 20 семьях пораженными являлись родители - потомки, в 16 семьях - сибсы.

Анализ распределения ревматоидного фактора показал ( таблица 11), что достоверно чаще наблюдается совпадение по серонегативности (отсутствию РФ ) как в парах родитель / потомок (р <0,01), так и в парах сибсов ( р<0,05 ) по сравнению с ожидаемым совпадением при случайной < комбинации их в семьях, рассчитанных на основании их частоты в популяции.*

Наблюдаемый процент совпадений по отсутствию ревматоидного фактора (по серонегативности) в парах родитель/потомок превышает ожидаемый процент совпадений - 65% и 51% соответственно (р=0,1), а в парах сибс/сибс - 81,2% против 57,8% (р=0,006). Доля неслучайных факторов, в первую очередь генетических, в формировании сходства клинической картины РА в семье по наличию или отсутствию РФ составила 28,6% в парах родитель/потомок и 55,5% у сибсов, что свидетельствует о существенном влиянии доминантной компоненты в детерминации этого признака. В данном случае степень сходства клинической картины (РА серонегативный) была более высока в парах сибсов.

Таблица 11

АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ РЕВМАТОИДНОГО ФАКТОРА В ПАРАХ РОДИТЕЛЬ-ПОТОМОК, СИБС-СИБС И СУММАРНО

РФ(+) - 0,762

РФ (-) - 0,238 (*Популяционный контроль по СССР )

При анализе особенностей распределения клинических форм РА (РА с

системными проявлениями и РА без системных проявлений) среди больных было выявлено, что в семьях с вторичными случаями РА значительно чаще идет накопление РА с системными проявлениями как в парах родитель/потомок ( р < 0,001 ), так и в парах сибс/сибс (р< 0,01) по сравнению с ожидаемыми величинами при случайном сочетании двух пораженных этой формой заболевания в семье. Эта закономерность сохранялась и на суммарной выборке семей (N=36). ( Таблица 12).

56 Таблица 12

АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ КЛИНИЧЕСКИХ ФОРМ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА (РА без системных проявлений и РА с системными проявлениями) В ПАРАХ РОДИТЕЛЬ -

ПОТОМОК, СИБС-СИБС И СУММАРНО

Каппа-статистика

Популяционная частота*: РА без системных проявлениями - 0.773 (Беневоленская, Бржезовский)

РА с системными проявлениями - 0.227

Как демонстрирует таблица 12, наблюдаемый процент совпадений

клинических форм (по наличию и отсутствию системности) по сравнению с

ожидаемым процентом совпадений при случайном распределении, в парах

57 родитель / потомок составил 70% против 52% соответственно, в парах сибс / сибс - 50% против 38% и суммарно 61% против 48,9%. В процентном выражении доля неслучайной компоненты (доля генетических факторов, каппа — коэффициент), обусловливающая совпадение клинических форм РА, составила 35,5% в парах родитель/потомок и 19% в парах сибс/сибс, что свидетельствует о преимущественно аддитивном взаимодействии генетических факторов, определяющих сходство клинической картины РА в семьях с повторными случаями заболевания. Таким образом, в парах родитель/потомок степень сходства клинической картины более высокая, чем в парах сибс/сибс. Таблица 13

АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА ПО СТАДИЯМ СРЕДИ ПАР РОДИТЕЛЬ - ПОТОМОК, СИБС-СИБС И СУММАРНО

Каппа статистика

Популяционная частота [3].

2ст. -0,187 Зет. - 0,413 4ст. - 0,293

Анализ совпадений по стадиям РА (таблица 13) среди пар родитель/потомок выявил, что совпадение по стадиям 2 - 2 и 4 - 4 среди них значительно ( р < 0,0001 ) превышает ожидаемое совпадение этих признаков при случайной комбинации их в семьях, рассчитанных на основании их частоты в популяции.

Совпадение по стадиям заболевания отмечалось в 45% в парах

родители/потомки и в 50% в парах сибс/сибс. При этом вклад неслучайной

компоненты в совпадение рентгенологических стадий РА в тех и других парах

был практически одинаков и составил 21,4% и 21,9% соответственно.

Таблица 14

АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ РА ПО ХАРАКТЕРУ НАЧАЛАЗАБОЛЕВАНИЯ (ОСТРОЕ - ХРОНИЧЕСКОЕ ) В ПАРАХ РОДИТЕЛЬ - ПОТОМОК, СИБС - СИБС И

Частота признака (собственная выборка) Острое начало = 0,383. Постепенное =0,617

Каппа-статистика

59 Не выявлено достоверных различий по характеру начала заболевания (острое и хроническое) в парах родитель/потомок по сравнению с ожидаемой частотой при случайном распределении признака (таблица 14), тогда как в парах сибсов острое начало заболевания встречалось чаще, чем ожидалось при случайном распределении (различия статистически достоверны, р<0,05).

Наблюдаемый процент совпадений по началу РА у сибсов (острое -острое)
по сравнению с ожидаемым составил 75% и 50% соответственно. Доля
неслучайной компоненты составила 50% ± 25% ( р=0,02 ), что

свидетельствует о существенном влиянии генетических факторов на характер начала РА у сибсов, обусловленном, по - видимому, наличием мажорного по своему действию гена.

Проиллюстрируем вышеизложенные данные на примере семьи N2. Больная М.Г., пробанд (II-1), заболела в возрасте 52 лет. Начало РА подострое, с артритов плечевых, коленных суставов с последующим вовлечением мелких суставов кистей. Заболевание протекало первые три года с высокой клинико-лабораторной активностью, с образованием контрактур локтевых и коленных суставов и ульнарной девиации кистей. Принимала преднизолон 10мг первые полгода заболевания, лейкеран в течение 3 лет (отменен из-за рецидивирующего герпеса). В последующие годы оставалась на небольших дозах НПВП, т.к. активность заболевания была невысокой. Через 8 лет от начала заболевания при обследовании у больной R-логически выявлена стадия 2Б. Д-з: Ревматоидный артрит: полиартрит, серопозитивный, ст.2Б, акт.1, ФН-1.

Вторичный случай в семье: мать пробанда (1-1). Заболела в возрасте 76 лет. Начало заболевания подострое, с артритов мелких суставов кистей. В течение года получала плаквенил, ортофен 150 мг/сут. В последующие годы у больной отмечалась ремиссия. При обследовании через 8 лет от начала заболевания у больной R-логически выявлена так же, как и у пробанда, стадия-2Б. Д-з: Ревматоидный артрит: полиартрит, серонегативный, ст.2Б, акт.О, ФН-0.

Таким образом, в данной семье, где пораженными являлись родитель/потомок, пробанд (дочь) заболела в более раннем возрасте, чем ее мать. Несмотря на различное течение заболевания, через восемь лет они имели одинаковую рентгенологическую стадию заболевания, что, возможно, обусловлено влиянием генетических факторов.

При изучении особенностей начала РА с мелких или крупных суставов было выделено несколько типов сочетаний (мелкие - мелкие, крупные -крупные, мелкие - крупные, мелкие — крупные + мелкие и крупные + мелкие -крупные + мелкие). Таблица15.

Как демонстрирует таблица 15, наблюдаемый процент совпадений по сравнению с ожидаемым процентом совпадений, при предположении отсутствия связи между типами начала суставного синдрома, в парах родитель/потомок и сибс/сибс составил 53,3% и 37,3% (р<0,04); 40% и 26,2% (р<0,04) соответственно и суммарно 45,7% и 30,9% ( р<0,01 ). Такое совпадение по характеру начала суставного синдрома среди больных родственников I степени родства обусловлено, по-видимому, систематически действующими факторами (в том числе генетическими), о чем свидетельствуют значения Каппа - коэффициентов (в парах родитель / потомок - 18,6% , в парах сибсов - 25,5%), р=0,04).

Таким образом, полученные в результате исследования данные об
особенностях клинического полиморфизма РА среди пораженных

родственников указывают на более тяжелое течение заболевания в семьях с повторными случаями РА, по сравнению с РАсп и свидетельствуют об определенном влиянии генетических факторов в его детерминации, что дает основание для их более углубленного изучения.

Таблица15.

АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ РА ПО НАЧАЛУ СУСТАВНОГО СИНДРОМА В ПАРАХ РОДИТЕЛЬ-ПОТОМОК, СИБС - СИБС И СУММАРНО

КАППА - СТАТИСТИКА

Частота признаков

(собственная выборка): мелкие - 36/71 = 0.507; крупные-27/71=0.390

мелк. + крупн. = 0.113

62 З.ФЕНОМЕН АНТИЦИПАЦИИ ПРИ

РЕВМАТОИДНОМ АРТРИТЕ

Принимая во внимание факт, что при ряде таких мультифакториальных заболеваний, как остеоартроз, шизофрения, ишемическая болезнь сердца, было выявлено более раннее начало заболевания у потомков по сравнению с их родителями (феномен антиципации или упреждения), представляло интерес проанализировать возраст начала заболевания РА в семьях, где пораженными являлись родители/потомки и проверить, существует ли в русской популяции феномен антиципации при РА. Результаты анализа представлены в таблице 16.

Таблица 16

Распределение по возрасту начала РА в парах родитель/потомок

Анализ возраста начала в парах родитель/потомок показал, что средний возраст начала РА у родителей был достоверно выше, чем у потомков: 46,6 ± 14,0 лет и 26,3±12,5лет соответственно.

Долгое время считали, что феномен антиципации обусловлен статистическим артефактом вследствие того, что более тяжелое течение заболевания может быть связано с большей длительностью болезни у потомков и что более ранние и, как правило, более тяжелые случаи заболевания регистрируются во время исследования чаще, чем более легкие и с поздним началом [24]. Результаты нашего исследования по сравнению продолжительности болезни у родителей и потомков показывают отсутствие

63 достоверных различий (17,5±10,7лет и 11,2±7,2 лет соответственно, р>0,052), что свидетельствует в пользу наличия феномена антиципации.

Выявленную закономерность по возрасту начала РА в парах родитель/потомок подтверждают усредненные по возрасту начала заболевания данные в парах тети/ племянники: средний возраст начала заболевания среди тетей/дядей составил 44,3 ± 15,9 лет против 25,0 ± 9,4 лет у племянников. Продолжительность болезни у них была практически одинаковой (11,3± 6,7лет и 10,3± 8,8 лет соответственно, р>0,86). (Таблица 17).

Таблица 17

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПО ВОЗРАСТУ НАЧАЛА РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА В ПАРАХ ТЕТИ/ПЛЕМЯННИКИ

Анализируя клинические проявления РА, характеризующие тяжесть заболевания, такие как системность, образование контрактур и анкилозов суставов в первые 3 года заболевания, необходимость в больших дозах НПВП, потребность в цитостатической, гормональной терапии (системной и в\суставной) и наличие таких осложнений, как асептические некрозы костей, амилоидоз, у наших больных в парах родитель / потомок в 50% выявлена тенденция к утяжелению РА у потомков по сравнению с родителями. Анализ клинических проявлений РА в парах тети - племянники также показал утяжеление заболевания у племянников в 80% случаев.

Для подтверждения вышеизложенных результатов приведем пример родословной семьи N32.

64 Пробанд (II-1) А.А., 47лет. Заболела в возрасте 25 лет. Начало заболевания постепенное, с артритов крупных суставов. Заболевание протекало с низкой лабораторной и постоянной клинической активностью, что требовало приема больших доз НПВП. Образование контрактур локтевых суставов и анкилозов лучезапястных суставов - через 5 лет от начала заболевания. Первые 15 лет болезни принимала препараты хинолинового ряда (были отменены из-за ухудшения зрения), в последующем - хлорбутин 6-8мг/сутки в течение 7 лет, который отменила самостоятельно, т.к. у больной наступила ремиссия. Через 17 лет от начала заболевания был выявлен асептический некроз головки правой бедренной кости.

Диагноз: Ревматоидный артрит: полиартрит, серонегативный, ст.4, акт.1, ФН-2. Асептический некроз головки правой бедренной кости.

Брат пробанда (П-2) А.К., 1948года рождения. Наблюдался в ИР с 1980 года с диагнозом: Подагра. Подагричесикй артрит. Тофусы. Постоянно принимал аллопуринол ЮОмг/сутки, НПВП. В 1993 году (в возрасте 45 лет) у больного появились постоянные боли, стойкая припухлость лучезапястных, а в последующем проксимальных межфаланговых суставов кистей и утренняя скованность больше 1 часа. В анализах крови - ускорение СОЭ до 49 мм/час. Образование контрактур локтевых суставов и резкое ограничение движений в лучезапястных суставах у больного появились к концу 1994 года (через год после описанных симптомов). На рентгенограммах кистей у больного выявлены множественные эрозии суставных поверхностей ПМФС и л/запястных суставов, анкилозы лучезапястных суставов. Из-за постоянно сохраняющейся активности РА принимал высокие дозы НПВП. В 1994 году в ИР РАМН в стационаре поставлен диагноз: Подагра, хронический подагрический артрит, тофусы в сочетании с ревматоидным артритом: полиартрит, серонегативный ст.4, акт.З, ФН-1.

Мать пробанда (1-1) А.С., 1925года рождения. Заболела в возрасте 68 лет. Начало заболевания постепенное, с артритов лучезапястных и мелких суставов

65 кистей с последующим вовлечением крупных суставов. Наблюдалась в районной поликлинике. В начале заболевания отмечалось ускорение СОЭ до 50мм/час. В течение 1 года принимала небольшие дозы НПВП, базисной терапии не проводилось. В последующем потребности в приеме НПВП практически не возникало из-за отсутствия клинической активности. Образование анкилозов лучезапястных суставов у больной - в первый год заболевания, контрактуры коленного сустава - на третьем году болезни. При амбулаторном обследовании в ИР поставлен диагноз: Ревматоидный артрит: полиартрит, серонегативный, ст.4,акт.1, ФН-2.

Таким образом, в одной семье РА страдают сибсы и мать сибсов. Как видно из приведенных выше данных, начало болезни у сибсов более раннее (25лет у пробанда и 45 лет у сибса), чем у матери (68лет). При сравнении клинической картины у всех пораженных в семье, можно отметить определенные общие черты: постепенное начало РА, серонегативность по РФ, 4 рентгенологическая стадия заболевания. Однако, у брата и матери пробанда клиническая картина заболевания более схожа: начало артритов с мелких суставов, а у пробанда — с крупных суставов, высокая лабораторная активность в начале заболевания, а у пробанда - низкая на всем протяжении болезни (СОЭ не превышала 14мм/час), образование анкилозов и контрактур суставов в первые 2 года заболевания, а у пробанда - после 5 лет болезни, хорошая переносимость диклофенака и непереносимость диклофенака у пробанда. Следует заметить, что несмотря на различную лабораторную активность, у сибсов отмечалась постоянно высокая клиническая активность и имелась потребность в приеме высоких доз НПВП, в то время как мать сибсов практически не принимала НПВП.

Изучение возраста начала РА и тяжести болезни в семьях с повторными случаями РА показало, что в парах родитель/потомок дети заболевают в более раннем возрасте, чем родители, и заболевание протекает у них, как правило,

более тяжело. То есть при РА в русской популяции, так же как и при ряде других мультифакториальных заболеваниях, выявлен феномен антиципации.

Таким образом, как видно из полученных нами данных, при анализе клинического полиморфизма РА в семьях с повторными случаями, сходство клинической картины в парах родители/потомки, сибс/сибс более выражено, чем следовало бы ожидать при случайном совпадении, что свидетельствует о существенном влиянии генетических факторов.в детерминации клинической картины РАс. Полученные результаты дают основание для более углубленного изучения природы генетической компоненты, лежащей в основе детерминации клинического полиморфизма семейного РА и, в первую очередь, системы HLA, значимость которой была подтверждена в ряде немногих семейных и многочисленных популяционных исследований. В российской популяции такие исследования до настоящего времени не проводились.

^Характеристика распределения генов HLA-DRB1* и аллелей reHaDRBl*04 в семьях с повторными случаями РА

Поиск генетических маркеров предрасположенности к РА в семьях с вторичными случаями заболевания представляет несомненный теоретический и практический интерес с позиции выявления факторов риска, которые оказывают влияние на возникновение повторных случаев заболевания, что в последующем позволит выделить группу родственников пробандов с повышенной вероятностью возникновения РА.

По данным зарубежной литературы в настоящее время выявлена высоко достоверная ассоциативная связь РА с геном DRB1*04 в большинстве популяций и DRB1*01 - в некоторых. Внедрение в исследовательскую практику молекулярно-генетических методов типирования позволило установить, что только некоторые варианты генов *04 и *01 наиболее значимо ассоциированы с РА. Высокая степень ассоциированности заболевания с

67 некоторыми из аллелей этих генов была выявлена в ряде исследований у представителей различных популяций. При этом установлено, что этническая принадлежность оказывает существенное влияние на особенности распределения ассоциированных с РА аллелей - маркеров предрасположенности. Кроме того, опубликованные в отечественной и в зарубежной литературе данные свидетельствуют как о генетическом, так и клиническом полиморфизме РА.

В нашем исследовании HLA DRB1 * полиморфизм был изучен у 143 человек (68 больных РА и 75 здоровых членов семей).

Контролем по отношению к основной группе при сравнении частот генов HLA-DRB1* служили 135 доноров крови русской национальности г. Москвы, протестированных в лаборатории Института иммунологии МЗ РФ. Частотная характеристика генов HLA-DRB1* среди пробандов и их родственников, больных РА, представлена в таблице 18.

Таблица 18

Частотная характеристика генов HLA DRB1* среди пробандов и их родственников, больных РА

Как видно из таблицы, статистически значимых различий в частоте встречаемости генов HLA-DRB1* среди пробандов и их родственников с повторными случаями РА не выявлено ( суммарное значение %2 равно 4.1, р=0.33 ). Отсутствие различий в частоте встречаемости генов позволяет объединить эти две группы в одну обобщенную семейную выборку больных РА и рассчитать соответствующие суммарные частоты генов.

Характеристика распределения генов среди всех больных РА, их здоровых родственников и в контрольной группе представлена в таблице 19.

Таблица 19

Частотная характеристика генов HLA-DRB1* среди больных РАс, их здоровых родственников и в контрольной выборке.

р для частоты встречаемости гена у больных РАс, по сравнению с контролем

*р для частоты встречаемости генов у здоровых родственников, по сравнению с контролем

Из всех 68 больных РА 17 человек (25%) были HLA-DRB1*01 положительными, а 44 человека (64,7%) являлись носителями гена DRB1*04 против 15,6% и 17,8%, соответственно, в контроле.

Как видно из представленных данных, различия в характере распределения
генов между больными РА и их здоровыми родственниками статистически не
значимы (%2 = 6.47, р = 0,12 ), в то время как различия по частоте встречаемости
генов у больных РА и среди здорового контроля статистически

достоверны ( уг = 58.0, р = 0,0001 ).

Аналогичным образом статистически значимы различия в частотной характеристике распределения генов между здоровыми родственниками больных РА и здоровым контролем (х2= 39,3, р = 0,0001 ).

Из таблицы 19 следует, что носительство гена HLA DRB1* 04 повышает вероятность заболевания РА в 8,5 раза (OR = 8,5), т.е. этот ген является фактором риска, способствующим возникновению ревматоидного артрита в русской популяции. В то же время наличие в генотипе генов HLA DRB1 * 02, *05, *06 уменьшает риск возникновения РА в 2,1, в 2,3 и в 7,2 раза соответственно, т.е. эти гены являются протективными по отношению к РА. Определенный интерес представляет анализ влияния гомозиготности и гетерозиготности на риск возникновения РА. Частота гомозиготных и гетерозиготных HLA DRB1 генотипов среди больных РА и в контрольной группе приведена в таблице 20.

Как следует из таблицы, доля всех гомозигот среди больных РА составила 18,7%, а гетерозигот - 81,3% по сравнению с 13,1% гомозигот и 86,9% гетерозигот в контрольной группе соответственно. Достоверных различий между двумя сравниваемыми выборками по частоте гомозигот не выявлено (%2 = 6,56, р=0,11), тогда как по частоте встречаемости гетерозиготных генотипов получены достоверные различия между больными РА и здоровым контролем ( %2 = 40,7, р=0,0001 ). Отмечается значимое 4-х кратное накопление числа гетерозигот по гену HLA-DRB1* 04 ( OR=5,8 ) у

70 больных PA ( 23,2% ) по сравнению с контролем (5,6%), т.е. гетерозиготность по гену DRB1*04 является предрасполагающим фактором в возникновении РА.

Таблица 20

Частота HLA DRB1* гомо — и гетерозиготных генотипов среди больных

РАс и здорового контроля и здорового контроля

С другой стороны, среди больных РА достоверно снижено количество гетерозигот по гену HLA DRB1* 06, (OR = 0,19, что соответствует снижению риска возникновения заболевания в 5 раз). Следовательно, гетерозиготность по этому гену является протективным фактором по отношению к данному заболеванию.

Другим аспектом, имеющим важное теоретическое и практическое значение, является определение аллелей гена *04, ассоциированных с риском развития РА и его клиническим полиморфизмом в семьях с повторными случаями РА в русской популяции.

Работы, проведенные в ряде европейских стран среди больных РА из семей с повторными случаями, выявили значительные межпопуляционные отличия в

71 клинической картине заболевания, что может быть обусловлено генетическими факторами, включающими гены HLA, которые имеют общий эпитоп (SE или РА - эпитоп).

HLA-DRB1* олиготипирование было выполнено у 66 больных РА (31 пробанд и 35 больных с вторичными случаями РА) и у 69 здоровых родственников.

Мы получили следующие результаты. Почти половина всех больных - 30 человек (45,4%) имели аллель *0401; 12 больных (18,2%>) имели аллель *0404, а аллель *0408 встретился у 9 больных (13,6%). В группе здоровых родственников также преобладал аллель *0401 (31,9%), а аллель *0402, не входящий в группу SE ( РА - эпитопов ), встретился только у трех человек (4,3%) в этой группе. Аллель *0405 в обследованных группах больных РА и их здоровых родственников не был выявлен ни в одном случае.

Таким образом, в семьях больных РА обнаружен ограниченный по сравнению с контролем набор аллелей гена DRB1*04. Среди DRB1*04 положительных больных РА выявлены только те аллельные варианты гена (*0401, *0404, *0408), которые имеют общий эпитоп (SE). Таблица 21. Таблица 21.

Частота встречаемости аллелей гена DRB1*04 в семьях с повторными
случаями РА

В таблице 22 представлены частоты встречаемости аллелей гена DRBl*04

среди ЭБ1В1*04-положительных больных РА и в группе DRB1*04

положительного здорового контроля.

Таблица 22.

Распределение аллелей гена DRB1*04 в семьях с повторными и

множественными случаями РА среди DRB1*04 положительных больных

РА и DRB1*04 положительного контроля

Как видно из таблицы, распределение аллелей гена DRB1*04 и их частота у пробандов и родственников с повторными случаями РА очень сходны, что подтверждает и статистический анализ на однородность подвыборок ( уг = 3,5 при 2 степенях свободы, что соответствует вероятности р = 0,17 ).

Таким образом, достоверных различий по частоте носительства аллелей гена DRB1*04 между пробандами и их больными родственниками не отмечается,

73 что позволяет объединить их в одну единую выборку больных РА. В то же время набор аллельных вариантов гена DRB1*04 и их частотная характеристика среди здорового контроля существенно отличается от больных РА ( %2 = 30,8 при 7 степенях свободы, р = 0,0001 ). Так, аллель *0401 достоверно чаще встречается у больных РА по сравнению с здоровым контролем ( 60,6% против 29,7% в контроле, OR = 3,6; р=0,0001 ). Кроме того, у больных РА наблюдается 2-х кратное увеличение носительства аллеля *0408 по сравнению с контролем (OR = 2,6), однако эти различия не достигают 5% уровня значимости. Следует отметить, что в русской популяции не выявлено достоверных отличий по частоте встречаемости аллеля *0404 в выборках больных РА и здорового контроля (21,3% против 28,1% соответственно).

У больных РАс аллельный полиморфизм гена DRB1*04 представлен вариантами *0401, *0404 и *0408, имеющими SE (РА-эпитоп), тогда как аллели *0402, *0403, *0406, *0407 которые не имеют SE, в этой выборке не встретились ни разу. Аллель *0405, имеющий РА-эпитоп, и ассоциирующийся с РА в азиатской популяции, также не встретился ни разу в группе больных РА. В группе контроля аллели *0402, *0407 выявлены у 12,5%, аллель *0403 -у 6,2%о индивидуумов, а аллели *0405 и *0406 - идентифицированы каждый только в одном случае.

В настоящее время доказательством того, что ген HLA-DRB1*04 ассоциирован больше с тяжестью, чем с риском возникновения РА, является более выраженная его ассоциация с РА у стационарных больных, у больных с эрозивным РА и системными проявлениями [167]. Однако ассоциация этого заболевания с данным геном не является достаточно информативной для предсказания особенностей течения болезни у конкретного больного, поскольку многие пациенты с РА, экспрессирующие ген DRB1*04, имеют и легкое течение болезни. Дальнейшее определение аллелей гена DRB1*04 и выявление того факта, что не все аллели гена DRB1*04 ассоциированы с РА, легло в основу «гипотезы общего эпитопа» (SE). И вновь выявленные

74 ассоциации не были достаточно информативными для клинической практики. В настоящее время имеются доказательства, что оба относящихся к SE родительских аллеля, полученных их потомком, играют важную роль при РА, так как возможен их кумулятивный эффект относительно риска развития заболевания. Эта гипотеза нашла свое подтверждение в ряде работ, в которых сообщалось о возрастании риска заболевания у пациентов с тяжелым РА, ассоциированным с носительством генотипа *0401/0404. Высокий риск по заболеваемости был выявлен также и при носительстве генотипа *01/0401, между тем как гомозиготный генотип *0401/0401 редко встречался у больных с тяжелым РА.

Таким образом, определенный HLA-DRB1* генотип, вероятно, может оказывать влияние на тяжесть заболевания, однако различные аллели, кодирующие идентичную аминокислотную последовательность (SE- общий эпитоп), имеют различную силу ассоциации с РА, а определенные комбинации аллелей могут повышать риск развития РА. Иллюстрацией вышесказанному могут служить данные таблицы 23.

В таблице показано распределение SE и генотипов, включающих SE, среди больных РА из семей с повторными случаями (РАс) и в выборке здорового контроля. В SE-позитивные выборки больных РА и здорового контроля включались лица, являющиеся носителями генов DRB1 *01 и DRB1 *04.

Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что в выборке больных семейным РА (РАс) одна треть (33,3%) пациентов являлись носителями одного. SE ( в контроле один SE аллель имелся у 28,1% лиц, различия недостоверны ), 43,9% больных - носителями двух SE в разных сочетаниях (SE/SE), против 5,1% в контроле (показатель относительного риска OR=14,3, рО.00000001). В группе контроля достоверно чаще встречается SE-негативный генотип SE(-)/SE(-) р<0,00001, OR=0,15. Т7е. вероятность развития РА для носителей этого генотипа снижена в 6,8 раза по сравнению с априорным.

Таблица 23.

Распределение SE у больных РА в семьях с повторными случаями

Не выявлено различий по генотипу, включающему только один SE. Практически с одинаковой частотой генотип SE(+)/SE(-) встречался у больных РА и в группе здорового контроля (р=0,5, показатель относительного риска OR=l,28). Следовательно, на вероятность заболевания у конкретного лица существенное влияние оказывает эффект дозы SE аллелей (одинарная или двойная).

При более детальном анализе носительства двойной дозы SE аллелей обращает на себя внимание, что среди больных РА отмечается снижение доли гомозиготных генотипов (15,1% против 2,9% в контроле) и увеличение доли гетерозиготных генотипов (28,8% против 2,2% в контроле). Наличие у индивидуума гомозиготного по SE генотипа (к примеру *0401/0401 или *0404/0404 - истинные гомозиготы) при прочих равных условиях увеличивает вероятность проявления РА у него в 5,8 раза, тогда как носительство гетерозиготных генотипов (например *01/0401 или *0401/0404- составленные гомозиготы) - в 17,8 раза. Максимальный риск проявления РА выявлен для носителей генотипа 01/0401, тогда как для гомозигот 0401/0401 он существенно ниже, т.е. в русской популяции выявляется отчетливый кумулятивный эффект при взаимодействии в генотипе аллелей DRB1*01 и DRB1*0401.

Исследования, проведенные в ряде европейских стран по изучению клинического полиморфизма РА и его взаимосвязи с генами HLA-DRB1* и аллелями гена HLA-DRB1* 04, выявили наличие определенных различий в клинической картине заболевания, а также в силе и направленности ассоциаций в изученных популяциях. В свете вышесказанного, изучение значимости генов HLA-DRB1*, аллелей гена DRB1*04 (особенно имеющих общий РА эпитоп) и генотипов, включающих SE, в формировании клинического полиморфизма в семьях с повторными случаями РА в русской популяции представляло несомненный интерес.

Распределение фенотипических признаков РА у DRBl*04-no3HTOBHbix больных и их частотная характеристика представлены в таблице 24.

С целью изучения клинического полиморфизма в анализ были включены следующие признаки: рентгенологическая стадия болезни, наличие или отсутствие ревматоидного фактора, системных проявлений, асептического некроза, амилоидоза, синдрома Шегрена, а также возраст начала заболевания и продолжительность болезни. При анализе все больные были подразделены на две группы: DR-4-позитивные (DR+) и DR4-HeraraBHbie (DR-).

77 Как видно из таблицы, по возрасту начала болезни и средней продолжительности РА эти две сравниваемые выборки больных достоверно не отличались друг от друга. Среди DR4 - позитивных больных положительные диагностические титры ревматоидного фактора были выявлены у 75,6% больных, в то время как у DR4 - негативных пациентов серопозитивными по РФ были 56,5% лиц, однако эти различия не достигали 5% уровня значимости. Таблица 24

Клиническая характеристика DR4(+) и DR4(-) больных РА

При сравнении особенностей клинической картины у DR4 - позитивных и DR4 - негативных пациентов не выявлено достоверных различий ни по стадиям заболевания, ни по частоте встречаемости системных проявлений, асептических некрозов, амилоидоза, синдрома Шегрена. Вышеперечисленные признаки встречалась практически с одинаковой частотой как у DR4 -позитивных, так и у DR4 - негативных больных. Следует отметить, что средняя продолжительность болезни в этих группах была достаточно длительной: 14 и 13 лет соответственно, поэтому о тяжести заболевания мы могли судить косвенно, по исходам болезни.

Не выявив различий в клинической картине у DR4 - позитивных и DR4-негативных больных, мы проанализировали влияние дозы аллелей (принадлежащих к классу SE) на клинический полиморфизм РА у больных из семей с повторными случаями заболевания. Полученные данные представлены в таблице 25.

При анализе клинических проявлений РА у больных в группах, имеющих один, два и ни одного аллеля риска (SE), статистически значимых различий между анализируемыми показателелями не выявлено, однако, больные, имеющие один или два SE, чаще имели постепенное начало РА, 3-4стадия РА, асептические некрозы костей. Ревматоидный фактор обнаруживался значительно чаще в группе SE-позитивных больных, чем в группе SE-негативных больных, хотя данные отличия не достигали уровня 5% значимости.

79 Таблица 25.

Анализ влияния дозы SE аллелей на клиническую картину

у больных РАс

80 Таблица 26*.

Влияние генотипа на возраст начала РА у SE-позитивных больных из семей с множественными случаями РА.

*В данный анализ не включался пробанд из семьи N18, являющийся гомозиготным по SE, т.е. с генотипом *0408/0408 и заболевший в возрасте 15 лет.

Анализируя возраст начала РА у SE-позитивных и SE-негативных больных ( таблица 26 ), мы не выявили достоверных отличий, но оказалось, что среди SE-позитивных больных, у пациентов с генотипами DRB 1*01/0401, *0401/0404 и DRB1*X/0401 возраст начала болезни был значительно ниже, чем у больных, имевших в генотипе аллель DRB 1*0408: 31,3±9,1 и 44,6±13,4 соответственно ( р=0,004 ). У больных, имеющих DRB 1*01/0401, *0401/0404 и DRB1*X/0401 генотипы, чаще встречались системные проявления и 3-4 R-стадии РА, чем у больных, не имеющих данных генотипов, однако различия не достигали уровня 5% значимости ( в указанных генотипах гены DRB1*X -гены, не относящиеся к классу SE).

Проанализировав тяжесть заболевания среди SE-позитивных больных с наличием семейного анамнеза (РАс), мы также обнаружили, что пациенты, имеющие аллель *0408, достоверно реже имеют системные проявления, чем больные, не имеющие данного аллеля. (Таблица 27)

81 Таблица 27

Влияние аллеля *0408 на особенности клинической картины РА у SE-позитивных больных

Как видно из таблицы, вероятность развития системных проявлений у больных РА, носителей аллеля *0408, в 12,3раза ниже, чем у больных, не имеющего данного аллеля. Таким образом, аллель DRB 1*0408 оказывает протективное влияние не только на возраст начала болезни при семейном РА, но и на тяжесть заболевания. Т.е. в русской популяции определенные аллели гена DRB1*04 и ген DRB1*01 играют важную роль в детерминации не только клинической картины у больных с семейным РА, но и влияют на возраст начала заболевания, что еще раз свидетельствует о важной роли генетической компоненты в формировании клинического полиморфизма РА.

Таким образом, выявленные отличия в клинической картине среди SE-позитивных больных из семей с повторными случаями РА, свидетельствуют о том, что на изученную фенотипическую гетерогенность заболевания значимое влияние оказывают генетические факторы, включающие HLA и SE. В детерминации этого феномена существенное значение имеют аллели, представляющие SE, так как их влияние на течение болезни не эквивалентно друг другу. Подтверждением вышесказанному могут служить результаты нашего исследования, согласно которым более тяжелое течение и более ранний возраст начала РА имели больные с генотипом *01/0401, *Х/0401 или *0401/0404.

82 Проведенный однофакторный дисперсионный анализ оценки силы влияния генов DRB1* системы HLA на частоту возникновения РА в семьях показал, что влияние отдельных аллелей статистически не значимо. Таблица 28.

Таблица 28

Результаты однофакторного дисперсионного анализа оценки силы влияния гена DRB1* на частоту РА в семьях с повторными случаями

В то же время выявлено статистически значимое влияние на частоту возникновения РА в семьях гена HLA-DRB1*07 . Выявленные факты свидетельствуют о том, что гены DRB1*, по-видимому, являются генами пенетрантности главного гена РА в семьях с повторными и множественными случаями заболевания. Однако они играют важную и, по-видимому, достаточно самостоятельную роль в формировании клинического полиморфизма РА.

В заключение главы необходимо подчеркнуть, что проведенное исследование расширило представление об общих и отличительных чертах семейного и спорадического РА, выявило клинические особенности семейного РА и феномен антиципации в русской популяции.

83
Изучение генетических маркеров выявило связь заболевания с отдельными
из них, что также подтверждает участие генетических факторов в патогенезе
заболевания. Выявленные ассоциации генов HLA-DRB1* и аллелей гена
HLA-DRB1*04 с некоторыми клиническими особенностями РА,

свидетельствуют об участии их в формировании клинического полиморфизма РАс.

Клинические особенности семейного и спорадического РА

Наиболее характерной чертой РА является наличие клинического полиморфизма, переходных и смешанных форм этого заболевания, т.е. клинического континуума. Одной из важных задач генетики РА является изучение генетических механизмов, способствующих возникновению заболевания в популяции и среди близких родственников больных РА, а также детерминирующих клинический полиморфизм как у больных без семейного анамнеза, так и у больных в семьях с повторными и множественными случаями заболевания. В настоящее время остается не ясным вопрос: почему же возникают вторичные случаи РА в семьях, что обусловливает их возникновение и существуют ли генетические маркеры, способные предсказать возникновение РА и повторных случаев РА в семьях? Частично помочь решению этой задачи могут исследования по изучению внутрисемейного клинического полиморфизма и сравнению клинической картины РА у больных с семейным анамнезом и у больных спорадическим РА.

В последние годы проводились работы, целью которых являлось сравнение демографических, клинических и иммуногенетических особенностей РА в семьях с повторными случаями заболевания (РАс) и у больных РАсп. [29,30,51,97,98,185]

C.K.Kwoh с соавт. [97] приводят данные, полученные в США, в которых был проанализирован возраст начала заболевания у больных с РАс по сравнению с РАсп. Оказалось, что возраст начала РА у пробандов РАс и РАсп существенно различался и составил 41 год против 48 лет соответственно.

Аналогичные результаты получены в Финляндии [98], где возраст начала РА у больных из семей с повторными случаями РА достоверно отличался от больных РА без семейного анамнеза (42,0 и 46,5 соответственно, р=0,0020).

Другие результаты были получены F.Wolfe с соавторами [185], которые проанализировали клинические и демографические особенности у больных РАс и РАсп. Для анализа были взяты 96 пациентов из семей с множественными случаями РА и 860 пациентов без семейного анамнеза, которые наблюдались в течение 10 лет. Данные обследования не выявили статистически значимых отличий по демографическим (пол, возраст начала болезни), а также по клиническим показателям тяжести болезни (длительность заболевания, шкала боли, шкала нетрудоспособности, сила сжатия кистей, число болезненных/воспаленных суставов, рентгенологическая стадия болезни, частота хирургических вмешательств - эндопротезирования). Однако авторы статьи предлагают с осторожностью относиться к результатам данного исследования, т.к. выборка семей РАс была небольшой.

Отсутствие различий в возрасте начала РА при семейном и спорадическом РА отметили также T.R.D.J. Radstake с коллегами в Нидерландах [134], где данные показатели практически не отличались в этих группах. Авторы отметили различия лишь при анализе возраста начала РА у пробандов мужского пола.

Таким образом, учитывая полученные противоречивые литературные данные, представляется интересным изучение клинического полиморфизма у больных с семейным и спорадическим РА в русской популяции.

Следует отметить, что о вкладе генетической компоненты в развитие клинического полиморфизма в семьях с повторными случаями РА можно судить только косвенно по работам, в которых сравниваются семейный и спорадический РА, а также РАс в различных популяциях. Представляется интересным определение значимости генетической компоненты в детерминации клинического полиморфизма РАс в русской популяции. Демографические, клинические, иммуногенетические показатели у больных РАс могут иметь значительные отличия в различных популяциях. Так, в Европе с 1996 по 1998 гг. проводилось многоцентровое международное исследование клинических и иммуногенетических особенностей РАс [30], в которое были включены 271 семья с пораженными парами сибсов (565 пациентов с РА) из Бельгии, Франции, Италии, Испании, Нидерландов, Португалии. Анализировались как демографические (пол, возраст начала заболевания) и клинические показатели (ревматоидный фактор, продолжительность болезни, наличие системных проявлений, рентгенологическая стадия), так и HLA-DRB1 - олиготипирование, которое показало большие различия между Европейскими странами. 78% включенных в исследование больных были женщины, средний возраст начала болезни- 44 года, 79% больных были серопозитивны. Найденные различия между больными из европейских стран касались продолжительности болезни (11-18 лет), преобладания эрозивного артрита (70-93%), ревматоидных узелков (15-44%), наличия синдрома Шегрена (5-38%), наличия системности (3-16%) (р 0,05 во всех случаях). Таким образом, оказалось что: - более позднее начало РА отмечалось у больных из Испании и Нидерландов (45-47 лет против 41-44 в других странах) - эрозивный РА преобладал в Бельгии и Испании - ревматоидные узелки чаще встречались у больных из Бельгии и Нидерландов - синдром Шегрена выявлялся с большей частотой в Бельгии, Испании, Нидерландах - системные проявления РА были более характерны для пациентов из Бельгии, Италии.

Номенклатура и генетическая организация HLA комплекса

HLA комплекс картируется на коротком плече 6-ой хромосомы, занимает приблизительно 0,1% всего генома человека (Campbell and Trowsdale, 1993,1997.) Генетические локусы комплекса HLA сгруппированы в 3 региона, обозначаемые как регионы класса I, класса II, класса III. Гены, кодирующие классические антигены I класса, картируются в трех главных локусах региона класса I: HLA-A, HLA -В, HLA -С.

Регион класса III включает в себя гены фактора пропердина, компонентов комплемента (СЗ и С4), ферментов глиоксалазы, фосфоглюкомутазы, фактор некроза опухоли (TNF) и др. Эти гены по структуре и функциям не относятся к генам системы HLA, а лишь картируются внутри нее. В регионе класса II основными локусами являются DR, DQ, DP, а также открытые в более позднее время локусы DM, LMP и ТАР. Остановимся более подробно на генетической организации локуса DR и структуре пептидов (антигенов), кодируемых генами этого локуса. Каждая молекула класса II представляет собой гетеродимерную структуру, состоящую из а- и Р-цепей. Каждая цепь состоит из аминокислот и подразделяется на III региона: внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный. Внеклеточный регион каждой цепи в свою очередь делится на два домена: домены, проксимально расположенные по отношению к клеточной мембране, и домены, дистально расположенные по отношению к клеточной мембране и содержащие полиморфные последовательности. Полиморфизм в значительной степени связан с pi доменом, в котором имеется три гипервариабельных участка, которые соответствуют аминокислотным остаткам в положении 9-13, 26-37, 67-74. Система HLA чрезвычайно полиморфна, что связано с наличием большого числа альтернативных вариантов (аллелей) каждого гена, входящих в этот комплекс. Обозначим на примере антигена DR4 основные этапы эволюционирования методов детекции антигенов/генов системы HLA и их номенклатуры. Первоначально серологическим методом выявлялась антигенная детерминанта, которая получила название HLA-DR4. Параллельное использование клеточных методов исследования позволило выделить несколько аллелей антигена DR4. Они получили название Dw4, DwlO, Dwl3, Dwl4, Dwl5. Классические антигены локуса DR (HLA специфичности) первоначально выявлялись лишь серологическими и клеточными методами и обозначались как DR1, DR2, DR4 и т.д. В настоящее время, используя молекулярные методы исследования, выявляют гены, которые обозначают как HLA-DRB1 01, 02, 04 соответственно, а варианты генов (аллели), например гена DRB1 04 - HLA-DRB1 0401, 0402, 0404, 0405, 0408, а гена HLA-DRB1 01 - DRB1 0101, DRB1 0102. Последующее секвенирование этих аллелей показало, что все они совместно наследуют высококонсервативную DRB1 аминокислотную последовательность в позиции 70-74 в третьем гипервариабельном регионе (HVR3) [38,72]. Этот наследуемый эпитоп DR.pi цепи (так называемый РА-эпитоп, Shared epitop, SE) рассматривается как ответственный за формирование чувствительности к РА. В 1987 году PK.Gregersen предложил Shared epitop hypothesis, которая базируется на предположении, что молекулы 2 класса прямо вовлекаются в этиологию и патогенез аутоиммунных заболеваний [73]. Инициация иммунного ответа требует Т-клеточной активации, а такая активация требует присутствия как чужеродного пептида, так и молекул 2 класса на антигенпрезентирующих клетках (АРС). 3.2. Гены HLA-DRB1 и ревматоидный артрит в популяциях. В настоящее время достоверно установлено участие генетических факторов в развитии РА, значимая роль которых подтверждена многочисленными семейными и близнецовыми исследованиями, и наличие достоверной связи РА с генами HLA-DRB1 . Со времени первого сообщения P.Stastny в 1978 году [155] о наличии ассоциации гена HLA-DR4 с РА проводились многочисленные популяционные исследования [126], которые подтвердили эту ассоциацию. Понимание взаимосвязи между РА и генами HLA-DR изменялось в ходе проведения новых исследований, демонстрирующих, что не только ген HLA-DR4 ассоциирован с РА [37,131]. В неевропейских популяциях (Индия, Якима индейцы) с повышением риска РА ассоциировались другие варианты генов HLA-DR (не DR4) [124,181]. При изучении широкого круга популяций появлялись новые интересные данные. Высокодостоверная ассоциативная связь выявлена для гена HLA-DR4 - в большинстве популяций, а для HLA-DR1 - в некоторых. Внедрение молекулярных методов в исследовательскую практику позволило установить, что только некоторые варианты генов л о куса HLA-DRB1 ( 0401, 0404, 0405, 0408, 0101, 1001, 1402) [68, 129, 131,182,186,189] наиболее сильно ассоциированы с РА. Эти аллели кодируют аминокислотные последовательности QKRAA или QRRAA в позиции 70-74 третьего гипервариабельного региона молекулы HLA класса П. Консервативный аминокислотный участок в HLA-DR.pi молекуле, кодируемый генами HLA-DRB1 локуса, получил название «общий эпитоп» (РА-эпитоп, Shared epitop, SE). [38,72,73] Этот наследуемый эпитоп рассматривается как ответственный за формирование чувствительности к РА. В дальнейшем было показано, что вклад гена HLA-DRB1 04 и некоторых его вариантов в детерминацию заболевания различен. Так, по данным D.Jawaheer с соавторами [87] у HLA-DRB 1 04-позитивных МЗБ не найдено значимых различий в уровне конкордантности между гомозиготами (имеющими в генотипе два гена DR4) и гетерозиготами (имеющими в генотипе только один ген DR4). Между тем было выявлено 5-кратное, возрастание конкордантности в парах МЗБ, имеющих двойную дозу SE, по сравнению с МЗБ, негативными по SE. Большое количество сообщений, включая недавние работы [76,173], описывают ассоциацию между РА и SE-несущими аллелями. Показано, что все HLA-DRB1 молекулы, несущие SE, ассоциированы с РА, но сила этой ассоциации варьирует в различных популяциях [120]. Так, в европеоидной популяции наиболее ассоциированы с РА аллели HLA-DRB 1 0401, DRB1 0404, DRB1 0408 и DRB1 0101 [68,121,141,155,189]; в японской и корейской популяциях - 0405 [125,155]; в израильской популяции - HLADRB 1 0101, в испанской популяции- HLA DRB1 1001, 0405 [143,192], в Якима индейской популяции - HLA DRB1 1402. По данным G.M. Mody [115] у темнокожих африканцев наблюдалась ассоциация с РА при комбинации аллелей DRB 1 0401, 0405, а также отмечена ассоциация с DQB 1 0302.

Анализ клинического полиморфизма в семьях с повторными случаями РА

HLA комплекс картируется на коротком плече 6-ой хромосомы, занимает приблизительно 0,1% всего генома человека (Campbell and Trowsdale, 1993,1997.) Генетические локусы комплекса HLA сгруппированы в 3 региона, обозначаемые как регионы класса I, класса II, класса III. Гены, кодирующие классические антигены I класса, картируются в трех главных локусах региона класса I: HLA-A, HLA -В, HLA -С.

Регион класса III включает в себя гены фактора пропердина, компонентов комплемента (СЗ и С4), ферментов глиоксалазы, фосфоглюкомутазы, фактор некроза опухоли (TNF) и др. Эти гены по структуре и функциям не относятся к генам системы HLA, а лишь картируются внутри нее.

В регионе класса II основными локусами являются DR, DQ, DP, а также открытые в более позднее время локусы DM, LMP и ТАР.

Остановимся более подробно на генетической организации локуса DR и структуре пептидов (антигенов), кодируемых генами этого локуса.

Каждая молекула класса II представляет собой гетеродимерную структуру, состоящую из а- и Р-цепей. Каждая цепь состоит из аминокислот и подразделяется на III региона: внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный. Внеклеточный регион каждой цепи в свою очередь делится на два домена: домены, проксимально расположенные по отношению к клеточной мембране, и домены, дистально расположенные по отношению к клеточной мембране и содержащие полиморфные последовательности. Полиморфизм в значительной степени связан с pi доменом, в котором имеется три гипервариабельных участка, которые соответствуют аминокислотным остаткам в положении 9-13, 26-37, 67-74.

Система HLA чрезвычайно полиморфна, что связано с наличием большого числа альтернативных вариантов (аллелей) каждого гена, входящих в этот комплекс.

Обозначим на примере антигена DR4 основные этапы эволюционирования методов детекции антигенов/генов системы HLA и их номенклатуры. Первоначально серологическим методом выявлялась антигенная детерминанта, которая получила название HLA-DR4. Параллельное использование клеточных методов исследования позволило выделить несколько аллелей антигена DR4. Они получили название Dw4, DwlO, Dwl3, Dwl4, Dwl5. Классические антигены локуса DR (HLA специфичности) первоначально выявлялись лишь серологическими и клеточными методами и обозначались как DR1, DR2, DR4 и т.д.

В настоящее время, используя молекулярные методы исследования, выявляют гены, которые обозначают как HLA-DRB1 01, 02, 04 соответственно, а варианты генов (аллели), например гена DRB1 04 - HLA-DRB1 0401, 0402, 0404, 0405, 0408, а гена HLA-DRB1 01 - DRB1 0101, DRB1 0102.

Последующее секвенирование этих аллелей показало, что все они совместно наследуют высококонсервативную DRB1 аминокислотную последовательность в позиции 70-74 в третьем гипервариабельном регионе (HVR3) [38,72]. Этот наследуемый эпитоп DR.pi цепи (так называемый РА-эпитоп, Shared epitop, SE) рассматривается как ответственный за формирование чувствительности к РА. В 1987 году PK.Gregersen предложил Shared epitop hypothesis, которая базируется на предположении, что молекулы 2 класса прямо вовлекаются в этиологию и патогенез аутоиммунных заболеваний [73]. Инициация иммунного ответа требует Т-клеточной активации, а такая активация требует присутствия как чужеродного пептида, так и молекул 2 класса на антигенпрезентирующих клетках (АРС). В настоящее время достоверно установлено участие генетических факторов в развитии РА, значимая роль которых подтверждена многочисленными семейными и близнецовыми исследованиями, и наличие достоверной связи РА с генами HLA-DRB1 . Со времени первого сообщения P.Stastny в 1978 году [155] о наличии ассоциации гена HLA-DR4 с РА проводились многочисленные популяционные исследования [126], которые подтвердили эту ассоциацию. Понимание взаимосвязи между РА и генами HLA-DR изменялось в ходе проведения новых исследований, демонстрирующих, что не только ген HLA-DR4 ассоциирован с РА [37,131]. В неевропейских популяциях (Индия, Якима индейцы) с повышением риска РА ассоциировались другие варианты генов HLA-DR (не DR4) [124,181]. При изучении широкого круга популяций появлялись новые интересные данные. Высокодостоверная ассоциативная связь выявлена для гена HLA-DR4 - в большинстве популяций, а для HLA-DR1 - в некоторых. Внедрение молекулярных методов в исследовательскую практику позволило установить, что только некоторые варианты генов л о куса HLA-DRB1 ( 0401, 0404, 0405, 0408, 0101, 1001, 1402) [68, 129, 131,182,186,189] наиболее сильно ассоциированы с РА. Эти аллели кодируют аминокислотные последовательности QKRAA или QRRAA в позиции 70-74 третьего гипервариабельного региона молекулы HLA класса П. Консервативный аминокислотный участок в HLA-DR.pi молекуле, кодируемый генами HLA-DRB1 локуса, получил название «общий эпитоп» (РА-эпитоп, Shared epitop, SE). [38,72,73] Этот наследуемый эпитоп рассматривается как ответственный за формирование чувствительности к РА. В дальнейшем было показано, что вклад гена HLA-DRB1 04 и некоторых его вариантов в детерминацию заболевания различен. Так, по данным D.Jawaheer с соавторами [87] у HLA-DRB 1 04-позитивных МЗБ не найдено значимых различий в уровне конкордантности между гомозиготами (имеющими в генотипе два гена DR4) и гетерозиготами (имеющими в генотипе только один ген DR4). Между тем было выявлено 5-кратное, возрастание конкордантности в парах МЗБ, имеющих двойную дозу SE, по сравнению с МЗБ, негативными по SE. Большое количество сообщений, включая недавние работы [76,173], описывают ассоциацию между РА и SE-несущими аллелями. Показано, что все HLA-DRB1 молекулы, несущие SE, ассоциированы с РА, но сила этой ассоциации варьирует в различных популяциях [120]. Так, в европеоидной популяции наиболее ассоциированы с РА аллели HLA-DRB 1 0401, DRB1 0404, DRB1 0408 и DRB1 0101 [68,121,141,155,189]; в японской и корейской популяциях - 0405 [125,155]; в израильской популяции - HLADRB 1 0101, в испанской популяции- HLA DRB1 1001, 0405 [143,192], в Якима индейской популяции - HLA DRB1 1402. По данным G.M. Mody [115] у темнокожих африканцев наблюдалась ассоциация с РА при комбинации аллелей DRB 1 0401, 0405, а также отмечена ассоциация с DQB 1 0302.

Характеристика распределения генов HLA-DRB 1* и аллелей гена HLA- DRB 1 04 в семьях с повторными случаями РА

Как видно из таблицы, распределение аллелей гена DRB1 04 и их частота у пробандов и родственников с повторными случаями РА очень сходны, что подтверждает и статистический анализ на однородность подвыборок ( уг = 3,5 при 2 степенях свободы, что соответствует вероятности р = 0,17 ).

Таким образом, достоверных различий по частоте носительства аллелей гена DRB1 04 между пробандами и их больными родственниками не отмечается, что позволяет объединить их в одну единую выборку больных РА. В то же время набор аллельных вариантов гена DRB1 04 и их частотная характеристика среди здорового контроля существенно отличается от больных РА ( %2 = 30,8 при 7 степенях свободы, р = 0,0001 ). Так, аллель 0401 достоверно чаще встречается у больных РА по сравнению с здоровым контролем ( 60,6% против 29,7% в контроле, OR = 3,6; р=0,0001 ). Кроме того, у больных РА наблюдается 2-х кратное увеличение носительства аллеля 0408 по сравнению с контролем (OR = 2,6), однако эти различия не достигают 5% уровня значимости. Следует отметить, что в русской популяции не выявлено достоверных отличий по частоте встречаемости аллеля 0404 в выборках больных РА и здорового контроля (21,3% против 28,1% соответственно).

У больных РАс аллельный полиморфизм гена DRB1 04 представлен вариантами 0401, 0404 и 0408, имеющими SE (РА-эпитоп), тогда как аллели 0402, 0403, 0406, 0407 которые не имеют SE, в этой выборке не встретились ни разу. Аллель 0405, имеющий РА-эпитоп, и ассоциирующийся с РА в азиатской популяции, также не встретился ни разу в группе больных РА. В группе контроля аллели 0402, 0407 выявлены у 12,5%, аллель 0403 -у 6,2%о индивидуумов, а аллели 0405 и 0406 - идентифицированы каждый только в одном случае.

В настоящее время доказательством того, что ген HLA-DRB1 04 ассоциирован больше с тяжестью, чем с риском возникновения РА, является более выраженная его ассоциация с РА у стационарных больных, у больных с эрозивным РА и системными проявлениями [167]. Однако ассоциация этого заболевания с данным геном не является достаточно информативной для предсказания особенностей течения болезни у конкретного больного, поскольку многие пациенты с РА, экспрессирующие ген DRB1 04, имеют и легкое течение болезни. Дальнейшее определение аллелей гена DRB1 04 и выявление того факта, что не все аллели гена DRB1 04 ассоциированы с РА, легло в основу «гипотезы общего эпитопа» (SE). И вновь выявленные ассоциации не были достаточно информативными для клинической практики. В настоящее время имеются доказательства, что оба относящихся к SE родительских аллеля, полученных их потомком, играют важную роль при РА, так как возможен их кумулятивный эффект относительно риска развития заболевания. Эта гипотеза нашла свое подтверждение в ряде работ, в которых сообщалось о возрастании риска заболевания у пациентов с тяжелым РА, ассоциированным с носительством генотипа 0401/0404. Высокий риск по заболеваемости был выявлен также и при носительстве генотипа 01/0401, между тем как гомозиготный генотип 0401/0401 редко встречался у больных с тяжелым РА.

Таким образом, определенный HLA-DRB1 генотип, вероятно, может оказывать влияние на тяжесть заболевания, однако различные аллели, кодирующие идентичную аминокислотную последовательность (SE- общий эпитоп), имеют различную силу ассоциации с РА, а определенные комбинации аллелей могут повышать риск развития РА. Иллюстрацией вышесказанному могут служить данные таблицы 23.

В таблице показано распределение SE и генотипов, включающих SE, среди больных РА из семей с повторными случаями (РАс) и в выборке здорового контроля. В SE-позитивные выборки больных РА и здорового контроля включались лица, являющиеся носителями генов DRB1 01 и DRB1 04.

Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что в выборке больных семейным РА (РАс) одна треть (33,3%) пациентов являлись носителями одного. SE ( в контроле один SE аллель имелся у 28,1% лиц, различия недостоверны ), 43,9% больных - носителями двух SE в разных сочетаниях (SE/SE), против 5,1% в контроле (показатель относительного риска OR=14,3, рО.00000001). В группе контроля достоверно чаще встречается SE-негативный генотип SE(-)/SE(-) р 0,00001, OR=0,15. Т7е. вероятность развития РА для носителей этого генотипа снижена в 6,8 раза по сравнению с априорным.

Похожие диссертации на Клинические и генетические особенности семейного ревматоидного артрита (РА)

Клинико-иммунологические особенности раннего ревматоидного артритаЛысак Наталья Владимировна

Особенности диагностики ревматоидного артрита на ранней стадииЧемерис Наталья Андреевна

Суставной и мышечный синдромы ревматоидного артрита: клинико-физиологические особенности вегетативных и болевых нарушений, диагностика и лечениеУланова, Елена Александровна

Особенности анемии у больных ревматоидным артритомГалушко Елена Андреевна

Анализ влияния антиревматической терапии на фенотипические особенности и апоптоз лимфоцитов при ревматоидном артритеКолосова Ирина Раисовна

Ревматоидный артрит у мужчин (клиническая характеристика и особенности гормонального статуса)Прокаева, Татьяна Борисовна

Особенности тиреоидного статуса у больных ревматоидным артритомЗинетуллина Наиля Хайрлисламовна

Клинико-функциональные особенности и диагностика поражений билиарной системы у больных ревматоидным артритомБульда, Владимир Иванович

Особенности состояния кальцийрегулирующих систем и динамика при лечебном применении гемосорбции и плазмафереза у больных ревматоидным артритомБаженов, Александр Николаевич