Введение к работе
Актуальность исследования и степень ее разработанности
Лекарственные средства из группы -адреноблокаторов являются препаратами первого ряда для лечения многих сердечно-сосудистых заболеваний. Однако, несмотря на глубокую разработку современных представлений о фармакодинамике и практическом применении этих лекарственных средств у больных хронической сердечной недостаточностью, многие стороны их действия на почки изучены недостаточно или совсем не исследованы. Прежде всего, это касается влияния -адреноблокаторов на ионорегулирующую функцию почек, нарушение которой включается в патогенез отеков и других водно-электролитных расстройств, возникающих у пациентов с ХСН. В развитии и прогрессировании отечного синдрома при ХСН главную роль играет гиперактивность СНС и РААС, которая вызывает увеличение в почках реабсорбции ионов натрия, приводящее к нарастающей задержке жидкости и электролитов в организме (DiBona G.F. Neural control of renal function: cardiovascular implications / G.F. DiBona// Hypertension. 1989. Vol. 13, № 6, Pt 1. P. 539-548; Torp M. Effects of renal denervation on the NKCC2 cotransporter in the thick ascending limb of the loop of Henle in rats with congestive heart failure / M. Torp, L. Brond, J.B. Nielsen et al. // Acta Physiol. (Oxf.). 2012. Vol. 204, № 1. P. 146-151).
Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что 1-адренорецепторы, опосредующие большинство фармакологических эффектов -адреноблокаторов, широко представлены в клубочках, эпителиальных клетках канальцев, гранулированных клетках ЮГА, продуцирующих ренин, то-есть в клеточных структурах, которые имеют прямое отношение к процессам, обеспечивающим не только ионорегулирующую функцию почек, но и ее нейрогуморальную регуляцию (Boivin V. Immunofluorescent imaging of beta 1 and beta 2-adrenergic receptors in the rat kidney / V. Boivin, R. Jahns, S. Gambarian et al. // Kidney Int. 2001. Vol. 59, № 2. P. 515-531). Благодаря этому антагонисты -адренорецепторов обладают в почках весьма широким спектром биологической активности. Они блокируют 1-адренорецепторы клеток проксимальных канальцев и толстого восходящего колена петель Генле (ТВКПГ), которые опосредуют стимулирующее действие СНС на реабсорбцию натрия и воды в указанных сегментах нефрона (Sonalker P. A., Iackson E.K. Norepinephrine via beta- adrenoreceptors regulates bumetamide- sensitive cotransporter type I expression in the thick ascending limb cells / P.A. Sonalker, E.K. Iackson // Hypertension. 2007. Vol. 49, № 6. P.1351-1357). Препараты этого ряда, являясь антагонистами 1-адренорецепторов клеток ЮГА, тормозят продукцию почками ренина и подавляют активность циркулирующей (плазменной) РААС и почечной тканевой РАС, которые рассматриваются сейчас в качестве основного звена нейрогуморального механизма, контролирующего транспорт ионов натрия в клетках почечных канальцев. Ряд клинических и экспериментальных данных указывает на способность препаратов этого ряда изменять также функциональное состояние простагландиновой и калликреин-кининовой систем почек, которые участвуют в процессах регуляции ионного транспорта в дистальных отделах нефрона (Libano-Soares J.D. Prostaglandin E modulates proximal tubule Na+-ATP-ase activity: cooperative effect between protein kinase A and protein kinase C /J.D. Libano-Soares, S.S. Landgraf, E. Gomes-Quintana et al. // Acta Biochem. Biophys.- 2011.- Vol.- 507, № 2.- P. 281-286; Zaika O. Bradykinin acutely inhibits activity of the epithelial Na+-channel in mammalian aldosterone-sensitive distal nephron / O. Zaika, M. Mamenko, R.G. O’Neil // Am. J. Physiol. Renal. 2011. Vol. 300, № 5. P. F1105-F1115). Вполне очевидно, что СНС, РААС и другие почечные нейрогуморальные системы могут вовлекаться в механизм действия -адреноблокаторов на ионорегулирующую функцию почек.
В настоящей работе проведен фармакологический анализ роли нейрогуморальных систем в формировании почечных эффектов -адреноблокатора пропранолола и исследовано влияние препаратов 3 поколения небиволола и карведилола на ионорегулирующую функцию почек крыс с моделью сердечной недостаточности.
Цель исследования
Цель исследования – уточнение роли почечных нейрогуморальных систем в механизме действия -адреноблокаторов на ионорегулирующую функцию почек и выяснение возможности их применения для коррекции водно-электролитных нарушений при экспериментальной сердечной недостаточности.
Задачи исследования
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.
1. Изучить влияние -адреноблокатора пропранолола на ионорегулирующую функцию почек крыс.
2. Исследовать взаимодействие -адреноблокатора пропранолола в почках крыс с ингибитором синтеза простагландинов диклофенаком натрия и ингибитором калликреин-кининовой системы контрикалом.
3. Выяснить влияние ингибиторов ренин-ангиотензиновой системы эналаприла, лозартана и алискирена на ионорегулирующую функцию почек крыс при действии -адреноблокатора пропранолола.
4. Оценить влияние -адреноблокаторов небиволола и карведилола на ионорегулирующую функцию почек крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью, вызванной длительным действием на сердце избыточной физической нагрузки и адреномиметика фенилэфрина
Методология и методы исследования
Для оценки роли почечной ренин-ангиотензиновой, калликреин-кининовой и простагландиновой систем в механизме действия пропранолола на ионорегулирующую функцию почек крыс и изучения влияния небиволола и карведилола на функциональное состояние почек крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью использованы различные методические подходы.
Клиренсовые опыты на наркотизированных крысах
Эксперименты выполнены на наркотизированных тиопенталом-натрия (50 мг/кг, внутрибрюшинно) белых беспородных крысах-самцах массой 180-230 г, содержавшихся на обычном рационе вивария при свободном доступе к воде.
После наступления наркоза крысу фиксировали на операционном столике на спине и делали трахеотомию для обеспечения нормального дыхания животного во время эксперимента. Затем по белой линии живота вскрывали брюшную полость и в нижнюю полую вену ниже впадения почечных вен вставляли катетер для введения изотонического раствора хлорида натрия. Для поддержания необходимого уровня диуреза крысе первоначально внутривенно вводили 1-2 мл солевого раствора, содержавшего 0,25% инулина, а затем скорость введения снижали до 50 мкл/мин, которую поддерживали постоянно в ходе всего эксперимента, продолжавшегося 80-90 минут. Одновременно из мочевого пузыря с помощью катетера в микропипетки собирали 10-минутные порции мочи. После стабилизации диуреза, которая обычно наступала через 30-40 минут, забирали две контрольные порции мочи и вводили исследуемые лекарственные препараты. Перед введением препарата и в ходе эксперимента брали из хвостовой вены пробы крови в объеме 0,1 мл, разводили в 0,9 мл 4% раствора трихлоруксусной кислоты и после осаждения белков центрифугировали при 3000 оборотов в минуту. В полученных образцах мочи и крови на фотоэлектроколориметре КФК-2-УХЛ42 антроновым микрометодом определяли концентрацию инулина. Содержание электролитов в моче и крови исследовали на пламенном фотометре ПФМ МУ. При подсчете концентрации натрия в крови делали поправку на гематокрит.
После обработки полученных результатов в каждом эксперименте рассчитывали по общепринятым формулам величину основных показателей ионорегулирующей функции почек: клиренс инулина, отражающий скорость клубочковой фильтрации, диурез, выделение с мочой ионов натрия и калия, экскретируемую фракцию натрия и отношение (индекс) натрий/калий мочи (Наточин Ю.В. Физиология почки: формулы и расчеты. Л.: Наука, 1974. 59с.; Рябов С.И., Наточин Ю.В. Методы очищения в оценке функционального состояния почки (глава 2) / С.И.Рябов, Ю.В.Наточин // Функциональная нефрология. СПб.: Лань, 1997. С.45-76). Для более точной оценки все показатели пересчитывались на 100 г массы крысы.
Каждый опыт ставился на одном животном. После окончания опыта наркотизированные крысы подвергались эвтаназии с помощью передозировки наркоза. Всего выполнено 8 серий экспериментов (80 опытов).
В ходе эксперимента пропранолол водился в дозе 0,5 мг/кг п/к однократно. Ионорегулирующая функция почек крыс изучалась также при комбинации пропранолола с ингибитором калликреина контрикалом и ингибитором циклооксигеназы диклофенаком натрия, которые вводились внутримышечно за 20 минут до инъекции -адреноблокатора соответственно в дозах 5000 АТрЕ/кг и 2,5 мг/кг, угнетающих синтез почечных кининов и ПГЕ2. Ингибитор АПФ эналаприл, антагонист АТ1-ангиотензиновых рецепторов лозартан и алискирен предварительно назначались животным однократно внутрь в дозах соответственно 0,5, 0,5 и 5 мг/кг/сутки в течение 7 дней до постановки эксперимента.
Опыты на крысах с моделью сердечной недостаточности
Эксперименты выполнены на 22 белых беспородных крысах-самцах массой 190-260 г, находившихся на обычном рационе вивария и имевших свободный доступ к воде. Животные были разделены на две группы, в которых после первоначальной оценки действия небиволола и карведилола на ионорегулирующую функцию почек интактных крыс и 5-дневного периода “washout” моделировалась сердечная недостаточность и вновь изучалась реакция почек на исследуемые препараты.
Экспериментальную сердечную недостаточность у крыс моделировали по методике В.И.Инчиной и др. (2000) в модификации С.П.Саликовой и др. (2002). С этой целью животным в течение 10 дней ежедневно вводили подкожно 0,1 мл 1% раствора адреномиметика фенилэфрина и затем подвергали их интенсивному плаванию до полного изнеможения. В результате у крыс развивается ЭСН, которая подтверждается клиническими (тахикардия, асцит, гепатомегалия) и морфологическими (микроскопия гистологических срезов миокарда и печени) данными (Инчина В.И. Состояние миокарда в модельной ситуации активации гипертензивных механизмов / В.И. Инчина, В.В. Столярова, Г.Г. Гарькин и др. // Второй конгресс по патофизиологии. М. 2000. С.68; Саликова С.П. Структурный анализ миокарда крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью при культивировании in vitro / С.П.Саликова, С.В.Пресняков, Фуад Мухаммед Фарек // Морфология. 2002. Т.121. № 2-3. С.128-129).
Влияние лекарственных средств на функциональное состояние почек крыс оценивалось на фоне 3% водной нагрузки с добавлением 0,6 % хлорида натрия. С этой целью животные после солевой нагрузки и введения препаратов помещались на 24 часа в индивидуальные плексигласовые боксы для сбора мочи. В полученных суточных порциях мочи с использованием коммерческих наборов CREATININE 60 (фирма «Кормей», Польша) определяли концентрацию креатинина на биохимическом анализаторе «Vitalit» (фирма «I.S.E.S.r.I.», Италия) и исследовали содержание натрия и калия методом пламенной фотометрии. Показатели суточного диуреза, экскреции с мочой креатинина, натрия, калия и отношение натрий/калий мочи рассчитывали по общепринятым формулам в пересчете на 100 г массы животного. Для взвешивания крыс использовались электронные весы HL-400 (фирма «A&D», Япония).
По окончании опытов животных подвергали эвтаназии с помощью эфирного наркоза. Всего выполнено 10 серий экспериментов (100 опытов).
Небиволол и карведилол назначали животным после 10-дневного периода формирования ЭСН однократно внутрь в течение 3 дней соответственно в дозах 0,15 и 1 мг/кг/сутки, которые примерно соответствуют высшим суточным дозам для людей.
Опыты на наркотизированных и бодрствующих крысах проведены в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 10.10. 1983 г., № 267 МЗ РФ от 19.06. 2003 г., регламента Европейской Конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации. План исследования одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ.
Статистическая обработка
Статистическая обработка данных проведена на персональном компьютере с использованием программы STATISTICA 10.0 в соответствии с методиками, описанными В.П. Боровиковым (2003) (Боровиков В.П. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере. СПб.: Питер, 2003.- 688 с.) и с учетом рекомендаций по анализу результатов медицинских исследований (Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиасфера, 2002. 312с.). При анализе количественных характеристик для оценки центральной тенденции использовалась медиана (Ме), для характеристики вариабельности – нижний и верхний квартили (Q25-Q75). Статистическую значимость различий количественных характеристик между выборками данных, полученных в экспериментах на крысах с ЭСН, проверяли с помощью U-критерия Манна-Уитни. Достоверность связанных между собой результатов, полученных в опытах на наркотизированных животных, оценивалась с помощью критерия Вилкоксона. Статистически значимыми считались различия при р < 0,05.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Научные положения и выводы диссертации основаны на анализе достаточного объема экспериментального материала, адекватном подборе экспериментальных групп животных и применении современных методов исследования ионорегулирующей функции почек в экспериментальных условиях. В работе использовались сертифицированные лекарственные препараты, позволившие получить достоверные данные об их фармакологической активности в почках. Для статистической оценки результатов использовались современные методики сбора и обработки исходных количественных данных.
Основные материалы исследования представлены и обсуждены на заседании проблемной комиссии по кардиологии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ в 2012 году. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на региональных конференциях молодых ученых и специалистов Оренбургской области (г. Оренбург, 2011; 2012 гг.), Аспирантских чтениях молодых ученых (г. Самара, 2011 г.) и на заседании областного общества фармакологов (г. Оренбург, 2010 г.). Результаты исследования представлены в материалах Российского национального конгресса кардиологов (г. Москва, 2010; 2011 гг.), Московского международного форума кардиологов (г. Москва, 2012 г.), Сибирского медико-биологического конгресса (г. Барнаул, 2011 г.), 77 Российской научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ (г. Уфа. 2012 г.), IV съезда фармакологов России (г. Казань, 2012 г.) и Всероссийской научно-практической конференции «Нанотехнологии в фармакологии и медицине» (г. Оренбург, 2012 г.).
Автор лично участвовал в проведении экспериментов на наркотизированных и бодрствующих крысах, статистической обработке и интерпретации полученных данных и подготовке к публикации основных результатов диссертационной работы в журнальных статьях и тезисах конференций.
Положения, выносимые на защиту
1. Антагонист -адренорецепторов пропранолол тормозит у наркотизированных крыс, имеющих повышенную активность симпатической нервной системы, реабсорбцию натрия в почках и вызывает выраженную диуретическую реакцию, которая сопровождается увеличением натрийуреза и выделения калия с мочой.
2. Почечные простагландиновая и калликреин-кининовая системы не участвуют в механизме, реализующем действие -адреноблокатора пропранолола на ионорегулирующую функцию почек крыс.
3. Ренин-ангиотензиновая система почек ослабляет ингибирующее влияние -адреноблокатора пропранолола на реабсорбцию натрия в почках крыс и
препятствует формированию его диуретического, натрийуретического и калийуретического действия.
4. -Адреноблокаторы небиволол и карведилол улучшают ионорегулирующую функцию почек крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью, вызванной избыточной физической нагрузкой и введением адреномиметика фенилэфрина, способствуя увеличению выделения ионов натрия с мочой.
Научная новизна
Впервые в экспериментальных условиях проведен фармакологический анализ функционального значения различных нейрогуморальных систем в механизме, реализующем действие -адреноблокаторов на ионорегулирующую функцию почек крыс.
Подтверждено, что -адреноблокатор пропранолол вызывает у наркотизированных крыс диуретическую, натрийуретическую и калийуретическую реакцию, основной причиной которой является угнетение реабсорбции натрия в почках.
В опытах с ингибиторами синтеза простагландинов и кининов диклофенаком натрия и контрикалом впервые показано, что простагландиновая и калликреин-кининовая системы не участвуют в механизме, реализующем действие пропранолола на ионорегулирующую функцию почек крыс.
В экспериментах с ингибиторами ренин-ангиотензиновой системы эналаприлом, лозартаном и алискиреном впервые установлено, что почечная ренин-ангиотензиновая система выполняет в почках функцию модулятора, препятствующего избыточной диуретической и натрийуретической реакции, возникающей у крыс при действии пропранолола.
Впервые показано, что краткосрочное назначение -адреноблокаторов 3 поколения небиволола или карведилола крысам с моделью сердечной недостаточности, вызванной чрезмерной физической нагрузкой и введением адреномиметика фенилэфрина, улучшает ионорегулирующую функцию почек, способствуя существенному увеличению выделения с мочой ионов натрия.
Теоретическая и практическая значимость работы
С помощью фармакологического анализа уточнена роль нейрогуморальных систем в механизме формирования почечных эффектов -адреноблокаторов и оценен характер фармакодинамического взаимодействия этих препаратов в почках с ингибиторами АПФ, антагонистами АТ1-ангиотензиновых рецепторов и прямыми ингибиторами ренина, которые широко применяются совместно с -адреноблокаторами для лечения ХСН и других сердечно-сосудистых заболеваний. В процессе исследования выявлена также способность -адреноблокаторов карведилола и небиволола увеличивать выделение натрия с мочой и улучшать ионорегулирующую функцию почек у животных с моделью сердечной недостаточности.
Практическое значение полученных результатов заключается в выяснении характера фармакодинамического взаимодействия ингибиторов ренин-ангиотензиновой системы в почках с -адреноблокаторами и выявлении способности -адреноблокаторов 3 поколения карведилола и небиволола препятствовать задержке натрия у животных с моделью сердечной недостаточности, что позволяет рекомендовать их для апробации в клинике с целью повышения эффективности лечения больных ХСН с отечным синдромом.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармакологии и кафедры пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ.
Публикации
Соискатель имеет 15 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 12 работ общим объемом 31 печатная страница, в том числе 5 публикаций в научных журналах, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 96 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Библиографический указатель включает 128 источников, из них 24 отечественных и 104 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 3 рисунками и 12 таблицами.
