Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Временная организация биосистем и организмов 12
1.2. Хронофармакологические особенности действия различных лекарственных веществ 18
1.2.1.Хронофармакология психотропных средств 21
1.2.1.1.Хронофармакологическое действие препаратов, угнетающих деятельность центральной нервной системы 22
1.2.1.2. Хронофармакологическое действие препаратов, преимущественно стимулирующих деятельность центральной нервной системы 24
1.3. Хронофармакологические особенности действия мелатонина, как водителя ритма 25
Глава 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Материалы 31
2.1.1. Краткая характеристика экспериментальных животных 31
2.1.2. Описание фармакологических веществ, применённых в исследовании 31
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Метод оценки спонтанной двигательной активности и ориентировочно-исследовательских реакций крыс 39
2.2.2. Метод оценки чувствительности и двигательной активности мелких лабораторных животных (мышей) к термическому раздражению 40
2.2.3. Метод оценки ректальной температуры лабораторных крыс 41
2.2.4. Метод оценки эффективности введения в наркоз лабораторных животных при использовании психотропных средств з
2.3. Методы статистической обработки результатов 42
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 43
3.1. Особенности и закономерности циркадианных ритмов чувствительности к термическому раздражению и двигательной активности мелких лабораторных животных и влияние на них психотропных препаратов с разнонаправленным действием 43
3.1.1. Изучение временной организации реакции мышей на термическое раздражение на фоне введения психотропных препаратов (тиопентал натрия, натрия оксибутират, фенотропил, мелатонин) 43
3.1.2. Изучение временной организации двигательной активности мелких лабораторных животных при термическом раздражении на фоне введёния психотропных препаратов разнонаправленного действия (тиопентала натрия, натрия оксибутирата, фенотропила, мелатонина) 99
3.2. Состояние циркадианных ритмов ориентировочно-исследовательских реакций и двигательной активности лабораторных животных и влияние на них психотропных препаратов 105
3.3. Особенности циркадианных ритмов ректальной температуры крыс в условиях эксперимента при действии средств для неингаляционного наркоза (тиопентал натрия, натрия оксибутират) 145
3.4. Хронофармакологические особенности введения в наркоз лабораторных крыс при использовании психотропных препаратов (тиопентал натрия, натрия оксибутират) 149
Заключение 153
Выводы 157
Практические рекомендации: 159
Список литературы 160
- Хронофармакологические особенности действия различных лекарственных веществ
- Хронофармакологическое действие препаратов, преимущественно стимулирующих деятельность центральной нервной системы
- Метод оценки спонтанной двигательной активности и ориентировочно-исследовательских реакций крыс
- Изучение временной организации двигательной активности мелких лабораторных животных при термическом раздражении на фоне введёния психотропных препаратов разнонаправленного действия (тиопентала натрия, натрия оксибутирата, фенотропила, мелатонина)
Хронофармакологические особенности действия различных лекарственных веществ
Всё живое на нашей планете подчинено строгим законам природы. Это определялось тысячелетиями жизни на Земле. Организмы как просто, так и сложно устроенные обладают свойствами приспособления к меняющимся условиям окружающей среды. Множество факторов влияет на изменчивость организмов и биосистем и на их адаптивные возможности. Тем не менее, ведущим остаётся временной фактор. В современной науке значительная роль отводится не только пространственной организации живых систем, но и их временной организации.
Многие ученые признают, что биоритм отражает течение времени в живой системе [21, 40, 43, 44, 117]. Любая деятельность живого организма происходит в определённые временные интервалы, с которыми так или иначе связана реализация различных процессов от моторики и эмоционального состояния до вегетативных функций [45, 46, 79].
Ритм – универсальное свойство любой системы на нашей планете. Всё живое несёт отпечаток ритмического рисунка событий, характерных для Земли. День и ночь сменяют друг друга, за приливом следует отлив, увеличивается и уменьшается солнечная активность, происходит смена времён года, меняются геомагнитные показатели – всё это природные факторы, связанные с пространственным и временным положением планеты Земля. И, несомненно, все живые организмы реагируют на циклические процессы на планете колебаниями характера и интенсивности биологических процессов.
Существует множество биоритмов, учёные выделяют эндогенные и экзогенные ритмы, экологические, физиологические, разделяют биоритмы по частоте, периодичности, по уровням организации, по источнику происхождения и по функции, которую выполняет ритм [2, 4, 22, 49]. Диапазон биологических ритмов широк и подразделяется в зависимости от длины периода. Наибольшее значение в современной науке имеют циркадные и циркадианные ритмы, те есть суточные и околосуточные колебания биологических ритмов. Так называемым «пейсмейкером» или времязадателем циркадных и циркадианных биологических ритмов выступает фотопериодичность или смена дня и ночи на планете [1, 28, 42, 70, 73, 77]. Цикличность смены фаз света и темноты сформировала периодический адаптивный механизм выработки гормонов и нейромедиаторов [112, 113], а также сформировала суточные ритмы чувствительности рецепторов к этим биологически активным веществам.
В настоящее время выделено более тысячи физиологических функций и процессов у человека и животных, для которых характерная суточная ритмичность. Циркадианные колебания обнаружены на всех уровнях организации живых систем от клеточного до организменного и популяционного [27, 44]. В многочисленных экспериментах зафиксировано существование суточных ритмов активности двигательной и психической, частоты дыхания, частоты сердечнососудистых сокращений и артериального давления, температуры тела и диуреза [31, 41, 47, 50, 53, 74, 83]. Особенное значение имеет характер суточных периодических изменений температуры тела, кровообращения и ритма дыхания, поскольку от этих колебаний зависит уровень обмена веществ. Суточных колебаниям подвержены содержания веществ в органах и тканях, например, калия, натрия, глюкозы, лития, кальция в биологических средах (в крови, плазме и сыворотке, клетках и тканях) [64, 80].
Одним из самых исследованных показателей в хронобиологическом аспекте выступают суточные колебания температуры тела и терморегуляции. Эти колебания проводились как в опытах на животных, так и в исследованиях на человеке. Суточная кривая температуры тела может служить основным параметром циркадианных переключений в организме.
Велико значение также и биологических ритмов центральной нервной системы. Известно, что боль, как и большинство нейрогуморальных процессов в организме подчиняется различным биологическим ритмам, в том числе циркадианным. Смена дня и ночи приводит к тому, что органы и системы также активно изменяют свою активность. Околосуточный цикл - один из активных циклов, влияющих на биосистемы. Изменения геофизических факторов из-за вращения
Земли вокруг своей оси приводят к формированию у человека и животных привычных циклических колебаний функций, физиологических и психических процессов. Суточные циклы животных и человека значительно отличаются и обусловлено это различными путями приспособления к окружающим условиям. Эволюционно сложились популяции, ведущие преимущество дневной образ жизни, и популяции, ведущие преимущественно ночной образ жизни. Так, например, экспериментально доказано, что грызуны имеют преимущественно ночной образ жизни, в то время, как, например, крупный рогатый скот дневной. Человек, как и большинство представителей животного царства, относится к организмам, ведущим дневной тип существования. Различия между этими группами будут обусловлены разным временем максимальной и минимальной активности (различиями акрофаз и батифаз). Несмотря на многочисленные сведения о замедлении большинства физиологических процессов в ночное время, согласно данным хронобиологических исследований, животные и люди обнаруживают заметные индивидуальные различия в рисунке циркадианных ритмов и позиции их акрофазы (момента крайнего отклонения регистрируемого процесса). В частности, может варьировать положение акрофазы как периода покоя, так и бодрствования [65, 66].
Хронофармакологическое действие препаратов, преимущественно стимулирующих деятельность центральной нервной системы
Исследования проводили на 30 белых крысах-самцах популяции Wistar средней массой 300,00 г ± 50,00 г. Животные были разделены на 6 групп по 5 особей в каждой. Периодом проведения этой серии опытов был выбран осенне-зимний период, когда наблюдалась наименьшая продолжительность светового дня. Животным внутрибрюшинно вводили психотропные препараты и через 10 минут после их введения определяли ректальную температуру тела крыс. Температуру измеряли при помощи электронного термометра «Термовал» («Пауль Хартман АГ», Германия) ректально на глубину 2,5 см в течение суток через каждые 4 часа: в 19:00, 23:00, 03:00, 07:00, 11:00, 15:00, 19:00. етод оценки эффективности введения в наркоз лабораторных животных при использовании психотропных средств
Исследования проводили на 30 белых крысах-самцах популяции линии Wistar средней массой 300,00 г ± 50,00 г. Животные были разделены на 6 групп по 5 особей в каждой. Животным внутрибрюшинно вводили психотропные препараты. В первой серии опытов внутрибрюшинно вводили 250 мг/кг 20 % водного раствора натрия оксибутирата, во второй серии эксперимента – тиопентал натрия в дозе 100 мг/кг 2 % водного раствора [58]. После введения препаратов оценивали процесс вхождения животных в наркоз, время латентного периода, скорость наступления «бокового положения», длительность «бокового положения», качественные параметры «вхождения» в наркоз и «выхода» из наркоза. . етоды статистической обработки результатов
Статистическую обработку результатов проводили на базе пакета стандартных программ Windows (Excel) и Statistica 10.0. При вычислении достоверности различий в экспериментах по исследования биоритмов интактных крыс использовали методы непараметрической статистики ANOVA: зависимых групп – критерий Фридмана, независимых групп – критерий Крускала-Уолисса. Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха – Me [Q25; Q75]. При изучении действия тиопентала натрия, натрия оксибутирата, фенотропила, мелатонина использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Достоверными считались различия показателей при p 0,05 (уровень значимости = 5 %). Результаты представлены в виде: среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего (M ± m). Для оценки достоверности различий параметрических показателей применяли t-критерий Стьюдента, критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали меньшим или равным 0,05. При проведении сравнительного анализа были вычислены медианы, а результаты экспериментов представлены в виде относительных величин (% от мезора), достоверность различий вычисляли при помощи непараметрического критерия Крускала-Уоллиса. Значимыми считали различия p 0,05. Для выявления биологических ритмов исследуемых параметров применяли групповой косинор-анализ с использованием программы Cosinor v.2.4 for Excel 2000/XP. Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
Особенности и закономерности циркадианных ритмов чувствительности к термическому раздражению и двигательной активности мелких лабораторных животных и влияние на них психотропных препаратов с разнонаправленным действием
Анализ литературных данных позволяет предположить о наличии биологических ритмов различных функциональных процессов и патологических реакций у любого живого организма, в том числе и лабораторных животных. При условии соблюдения в виварии нармального фотопериодизма биологические ритмы у лабораторных животных будут принимать естественную периодичность, что даст возможность воссоздать модели естественного функционирования, для дальнейшей оценки влияния на них препаратов с преимущественно угнетающим (тиопентал натрия, натрия оксибутират), стимулирующим (фенотропил) и адаптогенным (мелатонин) типом действия.
Изучение временной организации реакции мышей на термическое раздражение на фоне введения психотропных препаратов (тиопентал натрия, натрия оксибутират, фенотропил, мелатонин)
С биологической и физиологической точки зрения термин «реакция» означает закономерный ответ организма на внешнее раздражение. По своему содержанию указанный термин отвечает понятию рефлексия, которое относится к нему как «вид» к «роду». Поэтому реакции уже могут быть названы поведенческим понятием, но они ещё не являются рефлексами в полном смысле слова. Подлинно рефлекторный характер поведенческие реакции животных приобретают тогда, когда осуществляются посредством функционального состояния нервной системы.
Таким образом, предположительно, следует общепринятую категорию жизненных явлений, названных реакциями, наряду с безусловными и условными рефлексами животных рассматривать как более примитивные формы поведения типа тропизмов, так и поведенческие акты самого высшего порядка у животных, являющиеся рефлекторными по происхождению.
Для оценки состояния временной (циркадианной) организации чувствительности и особенностей реакций мышей на термическое раздражение изначально проводили исследования без применения фармакологических препаратов. В эксперименте сформировали 6 групп мышей по 10 особей в каждой группе. Первичная регистрация реакции мышей на термическое раздражение была произведена для каждой группы в строго определённое время без пересечения с оставшимися группами. Так, в первой группе животных исследования начинали в 19:00, во второй – в 23:00, в третьей группе – в 03:00, в четвёртой группе эксперимент стартовал в 07:00, для пятой группы время первичной регистрации было определено в 11:00, и в шестой группе мышей начинали эксперимент в 15:00. Последующие исследования повторяли через каждые четыре часа для каждой группы соответственно с обязательной экспозицией периода от последнего времени регистрации не менее 12 часов. Такой порядок эксперимента позволяет избежать формирования и закрепления у мышей условного рефлекса на раздражение.
Метод оценки спонтанной двигательной активности и ориентировочно-исследовательских реакций крыс
На основании проведённых исследований нами выявлено, что используемая доза натрия оксибутирата (50 мг/кг 20 % водного раствора) не изменяет ритм чувствительности мышей, при этом величина мезора и амплитуда ритма становятся достоверно выше после введения препарата. Кроме того, именно на фоне введённого 20 % раствора натрия оксибутирата в дозе 50 мг/кг массы особи мы отметили синхронизацию ритма с образованием чётких пиков максимальной и минимальной чувствительности. Даже после окончания воздействия натрия оксибутирата, полученная структура ритма сохраняется, акрофаза и батифаза ритма совпадают с таковыми в структуре ритма интактных животных и приходятся на 15:00 и 03:00 соответственно, однако амплитуда ритма увеличивается. При этом разница мезоров ритма чувствительности лабораторных мышей к термическому раздражению по структуре 4х измерений у интактных животных (мезор 4,06 с ± 0,46 с) и животных, которым был введен 20 % раствор натрия оксибутирата в дозе 50 мг/кг (мезор 5,17 с ± 0,55 с), незначительна.
Таким образом, для натрия оксибутирата характерным явилось проявление хроноспецифического анальгезирующего эффекта, так как нами зафиксирована различная степень изменения параметров чувствительности мышей к термическому раздражению. Время реакции на термическое раздражение варьировало от (12,10 ± 1,61) с в 03:00 до (34,10± 3,05) с в 15:00. Хронозависимый эффект натрия оксибутирата для показателей чувствительности мышей к термическому раздражению может быть описан с помощью синусоидной модели. Наличие синусоидного ритма позволило использовать для оценки результатов данного исследования статистическую обработку по программе «Косинор». Популяционный косинор-анализ позволяет выявлять степень межгрупповой и межиндивидуальной синхронизации ритмов. Сущность данного метода состоит в том, что выделяются первые гармоники разложения ритма параметров на ряд Фурье и рассматриваются средние значения амплитуды колебаний и фазы максимума (акрофаз) [29, 63]. Групповой косинор-анализ свидетельствует о том, что натрия оксибутират в дозе 50 мг/кг в целом на структуру ритма скорости реакции лабораторных мышей на термическое раздражение не изменяет (рис.6). Изменение местоположения фазово-амплитудной пары изученного ритма приводит к достоверному смещению локализации доверительного эллипса. При этом увеличивается амплитуда ритма и уменьшается разброс циркадианных акрофаз ритма (первоначально Phimin 12.25, Phimax 16.70; после введения натрия оксибутирата Phimin 12.70, Phimax 13.39), что может свидетельствовать о положительном влиянии натрия оксибутирата на синхронизацию ритма скорости реакции лабораторных мышей на термическое раздражение.
Рис.6. Результаты группового косинор-анализа суточного ритма скорости реакции лабораторных мышей на термическое раздражение до и после применения натрия оксибутирата в дозе 50 мг/кг
Полученные данные позволяют предположить, что использование натрия оксибутирата может увеличивать вариабельность реакций, в частности увеличивать или уменьшать время реакции лабораторных мышей на термическое раздражение в зависимости от периода суток и фазы циркадианного ритма чувствительности мелких лабораторных животных к термическому раздражению.
Использование препаратов, угнетающих функциональное состояние ЦНС (на примере тиопентала натрия и натрия оксибутирата), приводит к проявлению анальгезирующего действия препаратов, достоверно увеличивается мезор и амплитуда ритма чувствительности лабораторных мышей к термическому раздражению, при этом структура ритма остаётся синхронна естественному ритму. Известно, что реакция организма на боль является многокомпонентной. Невозможно представить себе существование человека или животных без ощущения боли, которое в свою очередь формирует комплекс защитных адаптивных реакций, направленных на устранение повреждающего фактора. Болевое раздражение и реакция на него организма включает моторные, сенсорные, вегетативные и гуморальные проявления, а также эмоциональный компонент. Болевое ощущение может быть следствием активации ноцицептивной системы на фоне механического воздействия, термического раздражения, а также действия ряда биохимических веществ – медиаторов воспаления. От ноцицепторов нервный импульс направляется по восходящим (афферентным) проводящим путям, обеспечивающим проведение ноцицептивных сигналов к подкорковым структурам и к коре головного мозга. Таким образом, болевая реакция сложный многоуровневый, иерархически организованный ответ на какой-то раздражитель. Восприятие боли зависит не только от структуры ноцицептивной системы, но и от динамики проведения ноцицептивного потока на разных уровнях ЦНС. Вещества, обладающие психодепрессивным воздействием способны потенцировать анальгезирующий эффект, повышать выносливость к боли [65]. При этом остаётся интересным вопрос о влиянии на болевую реакцию препаратов с преимущественно стимулирующим действием на функциональное состояние ЦНС и изменении этого влияния под воздействием фактора времени. Есть основания предполагать о наличии выраженного хронотропного действия ноотропных препаратов на организм. В качестве исследуемого препарата неслучайно был выбран фенотропил, являясь ноотропом, он обладает нейромодулирующим эффектом, стимулирующим действием на ЦНС, повышает физическую работоспособность и устойчивость, организма к стрессу в условиях повышенных психических и физических нагрузок, при утомлении. Несмотря на широкое применение фенотропила в клинической практике, остаются недостаточно изученными вопросы влияния препарата на суточные ритмы организма человека и животных. Аналогично предыдущим экспериментам, первоначально была произведена оценка естественного ритма болевой чувствительности к термическому раздражению мелких лабораторных животных, в ходе которой зафиксирована суточная изменчивость реакции мышей к термическому раздражению. После внутрибрюшинного введения фенотропила в виде водного раствора из расчёта 100 мг/кг массы особи реакция мышей на термическое раздражение была неодинакова в различные периоды суток. При этом значительно изменилась и структура ритма. Для всех этапов измерений характерно снижение латентного периода реакции мышей на термическое раздражение, увеличение амплитуды ритма, однако мезор ритма уменьшился. На графическом отображении показателей времени реакции мышей на термическое раздражение при первоначальных посадках на фоне фенотропила в различное время суток (рис.7) видно, что происходит практически полная десинхронизация ритма чувствительности к термическому раздражению. С появлением двойных пиков в структуре ритма, а также зачастую полной инверсией ритма.
Мезор ритма чувствительности к термическому раздражению на фоне применения фенотропила в целом имел тенденцию к уменьшению. Исходный мезор времени реакции естественного ритма составил 3,92 ± 0,44 секунд. Мезор реакции после воздействия на организм животных фенотропила в дозе 100 мг/кг массы особи составил 3,44 ± 0,42 секунд.
Изучение временной организации двигательной активности мелких лабораторных животных при термическом раздражении на фоне введёния психотропных препаратов разнонаправленного действия (тиопентала натрия, натрия оксибутирата, фенотропила, мелатонина)
Живой организм - это сложная, многофункциональная саморегулирующаяся система, характеризующаяся сложной организацией взаимодействия внутри себя и с окружающей средой, и поддерживающая постоянство таких взаимодействий.
Гомеостаз обеспечивается рядом каскадных реакций, в основе которых лежит несколько механизмов: эндокринный, гуморальный, нейрофизиологический, иммунологический и хронобиологический. Изменения в окружающей среде сопровождаются перестройкой взаимодействий внутри организма, обеспечивающей защиту организма от любых неблагоприятных воздействий, так называемый приспособительный синдром. Одним из вариантов запредельного воздействия неблагоприятных факторов на организм и последствием приспособительного синдрома является возникновение стрессовой реакции. Стресс – особое состояние организма, которое возникает в ответ на действие чрезвычайных раздражителей, угрожающих гомеостазу, и характеризующиеся мобилизацией неспецифических приспособительных реакций для обеспечения адаптации к действующему фактору [93]. То есть стресс, как стандартная адаптационная реакция, способствует сохранению гомеостаза в биосистеме. Другой составляющей частью в процессах адаптогенеза выступает ритмичность – особое свойство, способствующее поддержанию постоянства взаимодействия внешней и внутренней среды живых систем. Цикличность присуща большинству физиологических функций и процессов в организме человека и животных. Изменения внешней среды на организм приводит к перестройке естественных ритмических процессов и запуску антистрессорных реакций живого организма. Способность лекарственных средств изменять ритмическую организацию физиологических систем и функций организма подтверждена множеством исследований. Открытым остаётся вопрос о влиянии фармакопейных препаратов на активность первичных и вторичных осцилляторных мозговых структур, участвующих во временной организации эмоционального поведения, познавательных реакций и двигательной активности, а также на особенности временной организации функционального состояния организма. Живой организм настроен на определённые ритмы и отклонения от этих ритмов вызывает стресс. Поведение животных чувствительно к стрессорному воздействию. Изучение ориентировочно-исследовательских реакций и локомоторной активности лабораторных животных позволяет оценить действие лекарственных препаратов на развитие стрессовой реакции и адаптивные возможности организма. Одной из экспериментальных моделей стресса в лабораторных условиях является тестирование животных в «открытом поле». Особенности поведения крыс в открытом поле можно рассматривать как прогностические критерии устойчивости к эмоциональному стрессу.
В этой серии опытов мы использовали крыс-самцов популяции Wistar массой 250 350 г, содержавшиеся при естественном фотопериоде в условиях вивария на сбалансированном пищевом рационе.
Методика «Открытое поле» используется как скрининговый тест по выявлению гипоталамических пейсмейкерных биологических мотиваций, а следовательно является адекватной моделью для выявления и фиксации биологических флюктуаций функций нервной системы живых организмов и влияния на них различных групп психотропных фармакопейных препаратов. Существующие в литературе данные о том, что методику «открытое поле» можно рассматривать в качестве модели эмоционального стресса, позволили нам провести эксперимент с новыми условиями «открытого поля» в виде стрессовой ситуации в результате механического воздействия (внутрибрюшинная инъекция). После создания механической травмы (инъекция), животное помещали под колпак на 15 секунд с целью адаптации особи к новым условиям, далее в течение трёхминутной экспозиции производили подсчёт следующих показателей: горизонтальной двигательной активности (количество пересечённых квадратов), исследовательской активности – вертикальной двигательной активности (количество стоек), обследований отверстий (количество обследованных «нор»); тревожности животного – показателей груминга (количество умываний животного). Первоначально оценили состояние естественных ритмов активности животных, то есть провели суточные исследования животных в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном введении изотонического раствора натрия хлорида. Зарегистрированные ритмы приняли за контроль. В дальнейшем результаты, полученные при воздействии препаратов на организм животных, сравнивали с контролем и между собой.
В связи со сложными взаимоотношениями между поведенческими реакциями лабораторных животных регистрация показателей ориентировочно-исследовательского поведения выполнена нами пятикратно с повторным помещением животных на площадку «открытого поля» с интервалом в 30 в течение 2,5 часов. Для оценки циркадианных флюктуаций изучаемых параметров регистрацию мы проводили семикратно в различное время суток, а именно в 19:00, 23:00, 03:00, 07:00, 11:00, 15:00 и заключительно в 19:00 с целью анализа адаптивных изменений поведенческих реакций животных и исключения случайного характера перестроек.
В результате проведённых исследований латентного времени реакции ухода с центрального круга в группах животных после внутрибрюшинного введения изотонического раствора натрия хлорида (принятых за контроль), мы обнаружили, что зарегистрированные показатели подвержены суточным изменениям. Более того, для разных групп крыс была характерна различная динамика и интенсивность изменения изучаемых параметров. Отмеченная в предыдущих опытах тенденция различной чувствительности и активности лабораторных животных в зависимости от времени суток, чётко прослеживается и в настоящем эксперименте. На представленных на рис.16 графических отображениях суточной динамики латентного времени лабораторных крыс видно, что наиболее высокая реакция ухода с центра круга «открытого поля» животных данного вида у различных опытных групп в разное время начала эксперимента проявилась в вечерние (23:00) и ночные часы (03:00), в то время как минимум зарегистрирован в дневное время (15:00).
