Содержание к диссертации
Введение
Глава I Создание трансдермальных терапевтических систем как перспективное направление современной фармацевтической технологии 12
1.1. Трансдермальные терапевтические системы и преимущества их применения 12
1.2. Типы трансдермальных терапевтических систем 14
1.3. Строение кожи и пути трансдермальной доставки лекарственных веществ 16
1.4. Требования к действующим веществам, применяемым в трансдермальных терапевтических системах 19
1.5. Методы модификации трансдермальной доставки лекарственных веществ 20
1.5.1. Физические методы модификации 21
1.5.2. Химические методы модификации 22
1.5.3. Биохимические методы модификации 23
1.5.4. Увеличение эффективности действия систем трансдермальной доставки при их нанесении на очаг патологии 25
1.6. Механизмы действия энхансеров, применяемых в системах трансдермальной доставки 25
1.7. Краткий обзор рынка трансдермальных терапевтических систем 28
1.8. Природные флаволигнаны - перспективные объекты для трансдермальной доставки 29
Выводы к главе 1 33
Глава II. Материалы и методы 34
2.1. Материалы, использованные в работе з
2.2. Методы, используемые в работе 36
2.2.1. Определение растворимости веществ 36
2.2.2. Количественное определение действующих веществ 36
2.2.3. Приготовление матриксных трансдермальных систем на желатиновой основе 36
2.2.3.1. Приготовление систем со свободными силимарином и силикристином 36
2.2.3.2. Приготовление систем с липосомными формами силимарина и силикристина 37
2.2.3.3. Сушка матриксных трансдермальных систем на желатиновой основе 37
2.2.3.4. Определение эффективности консервантов и их количественное определение 37
2.2.4. Приготовление матриксных трансдермальных систем на основе полиакриламидного геля 37 2.2.5. Дозирование матриксных трансдермальных систем на желатиновой и полиакриламидной основах 38
2.2.6. Приготовление трансдермальных систем резервуарного типа 38
2.2.7. Оценка качества трансдермальных систем с флаволигнанами 39
2.2.7.1. Подлинность 39
2.2.7.2. Термическая стабильность 40
2.2.7.3. рН водных вытяжек 41
2.2.7.4. Однородность дозирования 41
2.2.7.5. Органические растворители 41
2.2.7.6. Микробиологическая чистота 41
2.2.7.7. Стабильность и установление сроков годности 42
2.2.7.8. Маркировка 43
2.2.8. Исследование высвобождения действующих веществ из трансдермальных систем in vitro через полупроницаемую мембрану 43
2.2.9. Испытания биологической безопасности трансдермальных систем в экспериментах in vivo 44
2.2.10. Определение высвобождения действующих веществ in vivo 45
2.2.10.1. Методика постановки эксперимента 45
2.2.10.2. Фотометрическое определение высвобождения действующих веществ 46
2.2.10.3. Определение содержания силимарина и силикристина в плазме крови с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).. 46 V
2.2.11. Исследование антигепатотоксической активности
трансдермальных терапевтических систем 48
2.2.11.1. Методика постановки острого эксперимента на животных 48
2.2.11.2. Изучение биохимического состава сыворотки крови экспериментальных животных 49
2.2.11.3. Изучение морфологии печени экспериментальных животных 50
2.2.12. Статистическая обработка экспериментальных данных 50
Глава III. Разработка технологии получения трансдермальных лекарственных форм флаволигнанов 51
3.1. Обоснование выбора основ для трансдермальных систем с флаволигнанами 51
3.2. Приготовление трансдермальных систем на желатиновой основе 51
3.2.1. Подбор состава основы 52
3.2.2. Подбор способа введения действующих веществ 53
3.2.3. Подбор параметров сушки 55
3.3. Приготовление трансдермальных систем на полиакриламидной основе 56
3.4. Дозирование матриксных трансдермальных систем 57
3.5. Приготовление трансдермальных систем резервуарного типа.. 5 8
3.6. Упаковка трансдермальных систем 59
3.7. Технология приготовления матриксных трансдермальных систем на желатиновой и полиакриламидной основах и трансдермальных систем резервуарного типа 59
3.8. Оценка качества трансдермальных систем 62
3.8.1. Оценка качества 62
3.8.2. Описание 62
3.8.3. Масса системы 63
3.8.4. Устойчивость на изгиб 63
3.8.5. Термическая стабильность 63
3.8.6. Определение рН водного извлечения 64
3.8.7. Однородность дозирования 64
3.8.8. Органические растворители 64
3.8.9. Микробиологическая чистота 64
3.8.10. Оценка стабильности и определение сроков годности трансдермальных систем 65
3.9. Исследование высвобождения действующих веществ из трансдермальных систем in vitro 67
Глава IV. Исследование безопасности и эффективности трансдермальных систем с флаволигнанами 72
4.1. Исследование биологической безопасности трансдермальных систем с силимарином и силикристином 72
4.2. Исследование высвобождения действующих веществ in vivo... 73
4.3. Оценка антигепатотоксической активности трансдермальных систем с флаволигнанами 77
4.3.1. Биохимические исследования сыворотки крови животных 80
4.3.2. Морфологическое исследование печени 80
4.3.2.1. Макроскопический анализ 80
4.3.2.2. Микроскопический анализ 82
Выводы 86
Список использованной литературы
- Методы модификации трансдермальной доставки лекарственных веществ
- Краткий обзор рынка трансдермальных терапевтических систем
- Приготовление трансдермальных систем резервуарного типа
- Технология приготовления матриксных трансдермальных систем на желатиновой и полиакриламидной основах и трансдермальных систем резервуарного типа
Введение к работе
доктор фармацевтических наук Громакова Алла Ивановна
Актуальность темы.
В современных условиях, вследствие постоянной подверженности организма человека неблагоприятным воздействиям окружающей среды, несбалансированного питания и различным стрессовым факторам, одной из причин развития патологий является оксидативный стресс. Он развивается в результате несоответствия прооксидантных и антиоксидантных ресурсов клеток организма, и, как следствие, накопления в них свободных радикалов. Обезвреживание большинства токсических веществ и свободных радикалов посредством их превращения в малотоксичные метаболиты происходит, главным образом, в печени. Однако часто от повреждающего действия обезвреживаемых печенью веществ страдает и собственная антирадикальная защита этого органа (Подымова, 2005). Это приводит к снижению активности метаболических процессов, протекающих в печени, и, как следствие, нарушению ее функций. Поэтому поиск и разработка новых препаратов, направленных на усиление антирадикальной защиты организма является в настоящее время актуальной задачей.
Известно, что высоким потенциалом антирадикальной защиты организма и, в частности, печени, обладают производные природных полифенольных соединений – флаволигнаны. Наиболее изученными и хорошо зарекомендовавшими себя в клинической практике являются флаволигнаны растения из семейства розоцветных расторопши пятнистой (Сокольская, 2000, Цаприлова, 2008, Corchete, 2008). Сумма флаволигнанов из расторопши пятнистой (силимарин) и ее индивидуальные компоненты обладают высокой антиоксидантной активностью и на сегодняшний день применяются в качестве эффективных гепатопротекторных средств. Изучены и многие другие положительные эффекты флаволигнанов на организм, в частности противовоспалительный, гипохолестеролэмический, кардиопротективный, нефропротективный, детоксикационый, антиангиогенный и др. (Луценко, 2006, Самигуллина, 2002).
Однако полностью раскрыть высокий терапевтический потенциал флаволигнанов из Расторопши пятнистой не позволяет их низкая растворимость в биологических жидкостях, следствием которой являются низкая биодоступность и невозможность применения их в инъекционных лекарственных формах. В связи с этим разработка новых лекарственных форм и путей введения флаволигнанов, обеспечивающих эффективность их действия в организме представляется актуальной задачей.
В последние годы возможности применения многих лекарственных препаратов для лечения и профилактики различных заболеваний значительно расширились благодаря разработке новых форм и способов введения лекарственных веществ. Наиболее перспективными на сегодняшний день являются лекарственные формы, повышающие качество жизни пациента за счет удобства применения необходимых ему препаратов. За счет использования современных технологических приемов, материалов и рационального подбора составов новые лекарственные формы способны обеспечивать контролируемое, прогнозируемое высвобождение действующих веществ и высокую эффективность терапии (Граник, 2001, Харкевич, 2005).
Одной из наиболее динамично развивающихся областей в сфере создания таких препаратов является разработка трансдермальных терапевтических систем (ТТС). ТТС представляют собой альтернативный (иногда аналогичный внутривенному введению) способ введения лекарственных веществ, традиционные пути введения которых являются неэффективными из-за низкой биодоступности действующего вещества, его нестабильности в желудочно-кишечном тракте, узкого терапевтического коридора или короткого периода полувыведения. Именно благодаря этим качествам ТТС могут стать перспективными лекарственными формами флаволигнанов.
В настоящее время на российском фармацевтическом рынке представлен небольшой ассортимент трансдермальных терапевтических систем, отсутствуют ТТС с лекарственными веществами, обладающими антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами, регулярное и дозированное поступление которых в организм человека может обеспечивать профилактику и лечение многих заболеваний. В связи с вышеизложенным задача разработки новых отечественных ТТС с флаволигнанами является актуальной.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилась разработка и экспериментальное исследование различных систем для трансдермальной доставки суммы флаволигнанов расторопши пятнистой силимарина (СМ) и его индивидуального компонента силикристина (СК).
Основные задачи работы:
-
Разработать составы и технологию получения трансдермальных лекарственных форм суммы флаволигнанов расторопши пятнистой силимарина и ее индивидуального компонента силикристина.
-
Разработать методики оценки высвобождения флаволигнанов из трансдермальных систем in vitro и in vivo.
-
Исследовать in vitro функциональные свойства трансдермальных лекарственных форм флаволигнанов различной конструкции и подобрать их оптимальные составы.
-
Изучить биологическую безопасность трансдермальных лекарственных форм флаволигнанов.
-
Исследовать возможность и особенности трансдермального транспорта флаволигнанов в кровоток.
-
Оценить антигепатотоксическую активность разработанных трансдермальных лекарственных форм флаволигнанов in vivo.
-
Разработать проекты нормативной документации на трансдермальные лекарственные формы флаволигнанов: проект ФСП и лабораторный регламент.
Научная новизна работы. Впервые разработаны матриксные и резервуарные системы для трансдермальной доставки в организм суммы флаволигнанов расторопши пятнистой (силимарина) и ее индивидуального компонента силикристина.
Впервые созданы трансдермальные терапевтические системы с липосомными формами лекарственных веществ.
Разработаны методики изучения параметров высвобождения из трансдермальных систем in vitro и in vivo и изучены различные показатели высвобождения для разработанных трансдермальных систем.
Впервые показана возможность доставки флаволигнанов в кровоток посредством трансдермальных систем.
Продемонстрировано, что разработанные трансдермальные системы с флаволигнанами обладают терапевтической эффективностью и оказывают антигепатотоксический эффект.
Практическая значимость работы. Разработанные трансдермальные терапевтические системы с флаволигнанами расторопши пятнистой отличаются от существующих на сегодняшний день препаратов из Расторопши пятнистой инновационным способом введения действующих веществ. Высокие показатели высвобождения действующих веществ и терапевтическая эффективность трансдермальных систем с флаволигнанами позволяют рассматривать разработанные препараты в качестве перспективных источников поступления в организм мощных природных антиоксидантов-флаволигнанов как для профилактических целей, так и для терапии различных заболеваний.
Внедрение результатов исследования в практику. В соответствии с материалами диссертационной работы разработан проект ФСП на трансдермальную терапевтическую систему с липосомным силикристином и лабораторный регламент на производство трансдермальных терапевтических систем с липосомным силикристином № ЛР 04868244-04-2010.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 – в рецензируемых журналах ВАК.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на XVI и XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2009-2010), на V Международном форуме «Интегративная медицина – 2010» (г. Москва, 2010).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, материалов и методов, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 172 источника, из которых 99 – зарубежные.
Методы модификации трансдермальной доставки лекарственных веществ
Одной из основных функций кожи является создание многослойного труднопреодолимого барьера, который предотвращает проникновение чужеродных веществ и микроорганизмов в его внутреннюю среду организма [121].
Площадь, поверхности кожи среднестатистического взрослого человека составляет около 2 м , а объем регионарного сосудистого русла приближается к 1/3 общего кровотока. Эти параметры показывают, что кожа является одним из наиболее доступных органов человеческого организма для- доставки лекарственных веществ в кровоток [17, 73, 77, 121].
Механизмы проникновения веществ- через кожу отличаются сложностью и многообразием. Вопрос о механизмах проникновения различных веществ через кожу долгое время был предметом спора исследователей. Всю историю изучения проницаемости кожи для различных веществ можно подразделить а 3 периода.
В первый период (до 1900 г) считалось, что кожа человека не проницаема для веществ из внешней среды. Затем в период разработки нового биологического оружия перед Второй мировой войной (1935-1946 гг) исследователи стали допускать возможность проникновения многих веществ через неповрежденную кожу. Несмотря на это введение лекарственных веществ в организм через неповрежденную кожу до 70-х годов XX века использовали крайне редко и только для локального воздействия на патологический очаг. В этот период при создании новых накожных препаратов уже начинали использоваться такие термины, как «проницаемость», «проникновение» «всасывание - и «чрескожная абсорбция» [19, 26, 37]. В настоящее время не вызывает сомнений, восприимчивость кожи человека к действию целого ряда лекарственных веществ различной природы. Достоверно установлено, что через неповрежденную кожу проникают касторовое, подсолнечное и эфирные масла, витамины, алкалоиды, стероидные гормоны, антисептики, различные анальгетики, натрия хлорид, йод и др.
Основными путями проникновения веществ через кожу является трансэпидермальный (через эпидерму, или между/сквозь клетки рогового слоя), трансфолликулярный и трансгландулярный (через стенки фолликул и протоки сальных и потовых желез, соответственно) (рис. 3) [17, 77, 91].
Трансэпидермальный путь
Через волосяные фолликулы и сальные железы проникает 0,01-0,1 % от всех проходящих через роговой слой веществ, при этом вещества растворяются в воде и жирах, подвергаясь при этом сложным физико-химическим изменениям [151, 153, 154]. Гидрофильные вещества активнее проникают через потовые железы [17, 139, 149]. Основным путем проникновения в кожу большинства лекарственных веществ (около 90%) является трансэпидермальный путь. При трансэпидермальном проникновении веществ осуществляется постоянная диффузия действующего вещества через роговой слой кожи в дерму. Скорость диффузии, как правило, пропорциональна концентрации действующего вещества на поверхности кожи.
При проникновении через кожу вещества сначала должны преодолеть роговой слой кожи, а также верхние слои эпидермиса, которые являются труднопреодолимым барьером на пути их проникновения в дерму, а затем в кровоток. От их прочности и состояния этого барьера зависит резорбционная функция кожи.
Роговой слой - самый наружный слой эпидермиса (рис. 4). Он образован плоскими тонкими роговыми пластинками, лежащими друг над другом несколькими плотно прилегающими друг к другу рядами из корнеоцитов (кератиноцитов) - мертвых клеток, заполненных фибриллярным белком кератином (роговым веществом) и образующих роговые «чешуйки» толщиной 0,2-0,4 мкм и около 40 мкм в диаметре. Корнеоциты соединены между собой корнеодесмосомами, связывающими их в прочную сеть. На поверхности рогового слоя корнеоциты лежат неплотно и постепенно отторгаются (рис. 4).
Непроницаемым роговой слой делает липидный матрикс, в который «погружены» корнеоциты; он состоит в основном из биполярных молекул жирных спиртов церамидов, холестерина и жирных кислот, образующих систему мультиламеллярных бислоев. Одним из путей проникновения вещества во внутренние слои кожи является преодоление липидных (церамидных) каналов между корнеоцитами [145]. Площадь этих каналов очень мала, и проходить через них могут в основном амфифильные вещества. При этом кератиновый слой выполняет функции «депо», из которых ЛВ постепенно проникают в глубинные слои кожи, а затем доходят до дермы к капиллярной сети кровеносных сосудов, попадают в кровоток и транспортируются к органам-рецепторам, где и реализуют свое действие [151, 158, 166].
Краткий обзор рынка трансдермальных терапевтических систем
Сушку трансдермальных систем осуществляли на стеклянной . подложке, предварительно- обезжиренной спиртом, в термостате с принудительной вентиляцией при 27,5С до остаточной влажности 421,25%. Влажность полученных аппликационных систем определяли гравиметрическим методом [13 , 14].
Основой для систем- служил 10% полиакриламидный гель,. полученный по модифицированной методике5 [41]. В качестве основы для приготовления полиакриламидного геля использовали 50% раствор ДМСО. После завершения процесса полимеризации из полученной массы с помощью лекала, имеющего форму окружности, вырезали системы диаметром 2,5 см. Насыщение гелей действующими веществами проводили, выдерживая их в растворах СМ или СК в 50% ДМСО с концентрацией веществ 20 мг/мл в течение 24 ч. Объем растворов для насыщения систем составлял 3 мл. Количество вещества, попавшего в гель, определяли по разнице его концентраций в растворе для насыщения перед началом и по окончании процесса.
После завершения процесса сушки с помощью лекала, имеющего форму окружности, вырезали трансдермальные системы (диаметр 25,0±1,0мм, толщина 4,0±0,5 мм), которые использовали в последующих экспериментах. Конечное содержание действующих веществ в полученных трансдермальных системах составляло 20,0±2,0 мг.
В качестве полупроницаемой мембраны использовали диализную трубчатую мембрану из SMC (синтетически модифицированной целлюлозы) производства Sigma-Aldrich Fine Chemicals (США), изготовленную в виде трубки с наружным диаметром 2,7 см, размерами пор 2,5-2,8 нм, пропускающих вещества до 12 000 Да. Из трубчатой мембраны формировали диализные капсулы, наполняли их растворами действующих веществ в 70% ДМСО с концентрацией 20 мг/мл и герметизировали специальными клипсами. Содержание действующих веществ в каждой диализной капсуле составляло 20±2 мг. 2.2.7. Оценка качества трансдермальных систем с флаволигнанами
Для установления подлинности флаволигнанов в трансдермальных системах желатиновые системы предварительно растворяли в ДМСО, из систем на полиакриламиднои основе многократно экстрагировали действующие вещества ДМСО, после чего полученные растворы объединяли, из систем резервуарного типа отбирали растворы действующих веществ. Все полученные растворы подвергали качественному анализу на наличие флаволигнанов, предварительно избавившись от ДМСО диализом в воду очищенную. Полученные после диализа растворы упаривали досуха и перерастворяли в этиловом спирте, после чего подтверждали подлинность флаволигнанов тремя независимыми методами: по качественной цианидиновой реакции, методом ТСХ и методом УФ-спектроскопии.
Цианидиновая реакция. Полученные после диализа растворы упаривали досуха и к 1—2 мг исследуемого образца, растворенного в 1 мл этилового спирта, прибавляли 5 капель концентрированной хлористоводородной кислоты (НС1) и 5-10 мг магния. Образовывалось красно-малиновое окрашивание (флавоноиды).
Тонкослойная хроматография (ТСХ). Аликвоту перерастворенного в этиловом спирте извлечения из трансдермальных систем наносили на хроматографические пластины с Kieselgel 60 (Merck, Германия). В качестве подвижной фазы использовали хлороформ:метанол в соотношении 10:1. В качестве контроля использовали силимарин (Sigma, США) и силикристин (ChromaDex, США). Детектирование проводили в УФ-свете на хроматографическом облучателе УФС 254/365 (Сорбполимер, Россия) и в парах кристаллического йода.
УФ-спектроскопия. При подтверждении подлинности фотометрическим методом для растворов силимарина максимум спектра УФ-поглощения составлял 300 нм, минимум — 257 нм, для спектра силикристина максимум спектра УФ-поглощения составлял 288 нм.
Приготовление трансдермальных систем резервуарного типа
Это явление можно объяснить менее высокой диффузионной способностью желатиновых систем, а также низким содержанием пенетраторов в таких системах. С другой стороны, пониженное содержание пенетраторов и наличие в составе желатиновых систем смягчающих компонентов позволяет им найти применение для людей, кожа которых склонна к раздражениям и аллергическим реакциям, для более мягкого воздействия и доставки действующих веществ в низких дозах.
Следует также отметить, что в экспериментах in vivo силимарин высвобождался в кожу из всех исследуемых систем более интенсивно, чем силикристин (рис. 23), несмотря на то, что в модельных экспериментах по высвобождению веществ через полупроницаемую мембрану силикристин высвобождался активнее силимарина (рис. 22).
Вероятно, более высокая, чем у силимарина, проникающая способность молекулы силикристина в экспериментах in vitro связана с ее большей гидрофильностью. Силимарин же, по-видимому, лучше проникает в более гидрофобную кожу, чем в водный раствор. При сравнении результатов экспериментов по высвобождению действующих веществ через полупроницаемую мембрану и в кожный покров было также отмечено, что силикристин из матриксной ПААГ-системы и из ТТС резервуарного типа в кожу в значительно меньшем количестве, чем высвобождается через полупроницаемую мембрану в диализный раствор (из ПААГ-системы в кожу за 24 ч проникает 1,15±0,15 мг, а в диализную среду 4,05±0,23 мг силикристина; из резервуарной системы в кожу высвобождается 0,76±0,06мг, а при диализе - 3,17±0,22мг вещества) (рис.22, рис. 23). Эти результаты, а также более эффективное по сравнению с силикристином высвобождение силимарина in vivo могут быть обусловлены большей гидрофильностью молекулы силикристина вследствие измененной конформации. Силимарин же, из-за присутствия в его составе различных стереоизомеров способен легче проходить в липидное межклеточное вещество кожи, чем через поры полупроницаемой мембраны, омываемой водным диализным раствором. Возможно также, что ДМСО, входящий в состав систем, оказывает более активное пенетрирующее действие в биологических тканях (растворяя вещества, препятствующие доставке терапевтического агента через кожные поры и каналы [122, 150]), чем в модельном эксперименте с полупроницаемой мембраной, где ДМСО способствует выходу действующего вещества в основном за счет увеличения растворимости этого вещества в диализной среде. Более высокое количество вещества, высвобождающееся в кожу, по сравнению с количеством, высвобождающимся через полупроницаемую мембрану, может быть также обусловлено тем, что экспериментальное высвобождение через мембрану суммарно за 24 ч проводилось в 240 мл диализной среды, а в организме человека за этот период времени действующее вещество могло распределиться в гораздо большем объеме биологических жидкостей и в тканях.
В процентном отношении из каждой системы в кожу за 24 ч высвободилось 0,5±0,1, 4,2±0,3, 15,7±2,6 и 10,7±2,1 % силимарина и 0,25, 2,8, 5,52 и 3,8% силикристина от их исходного количества в желатиновых системах со свободным и липосомным веществом, ПААГ-системах и системах резервуарного типа, соответственно. В целом, процент эффективно высвобождающегося вещества из ПААГ-систем и целлофановых капсул сопоставим по данным показателям с существующими на рынке трансдермальными системами [109, ПО, 126].
Подтверждение наличия и оценку количественного содержания СМ и СК в плазме крови осуществляли с помощью метода ВЭЖХ. Содержание силимарина в плазме крови экспериментальных крыс оценивали по содержанию силибинина (изомеров А и В), составляющего более 70% от общего количества флаволигнанов, входящих в состав силимарина [147]; содержанием в плазме других компонентов силимарина пренебрегали. Время удерживания диастереоизомеров силибинина в выбранных условиях составило 15,99 мин (силибинин А) и 16,99 мин (силибинин В) (рис. 24 а). Время удерживания на колонке силикристина при заданных условиях хроматографирования составляло 4,96 мин (рис. 25 а).
Достоверно наличие действующих веществ в плазме крови было установлено в случае применения желатиновых систем с липосомными формами СМ и СК, ПААГ-систем и резервуарных систем. Данные хроматографического разделения плазмы крови экспериментальных крыс после применения ПААГ-систем с силимарином и силикристином представлены на рис. 24 б и рис. 25 б. Пики на хроматограммах образцов плазмы крови совпадали по времени удерживания с пиками стандартных образцов силибинина (изомеров А и В) и силикристина. Наличие силибинина и силикристина в собранных с колонки пиках подтверждалось также методом ТСХ. Коэффициенты распределения веществ в исследуемых пробах совпадали с коэффициентами распределения веществ в стандартных растворах (рис. 24 в, 25 в). Концентрация силибинина в плазме после нанесения ПААГ-систем составляла 43,03±5,22 нг/мл (силибинин А - 12,06±2,07 нг/мл, силибинин Б - 30,97±3,15 нг/мл), силикристина — 52,10±2,37 нг/мл. После нанесения трансдермальных систем на желатиновой основе с липосомными формами силибинина и силикристина 37,42±4,17 нг/мл (силибинин А - 9,87±1,89 нг/мл, силибинин Б - 27,55±2,65 нг/мл), силикристина — 47,46±2,07 нг/мл. После нанесения диализных ТТС концентрация силибинина и силикристина в плазме составляла соответственно 25,41±2,14 нг/мл (силибинин А — 7,15±0,87 нг/мл, силибинин Б - 18,27±1,76 нг/мл) и 31,87±1,98 нг/мл.
Технология приготовления матриксных трансдермальных систем на желатиновой и полиакриламидной основах и трансдермальных систем резервуарного типа
В ходе морфологического исследования печени, окрашенной гематоксилином:эозином с применением микроскопического анализа на препаратах печени нелеченой группы животных (рис. 27 б) наблюдали картину выраженного токсического гепатита. Отмечался лизис гепатоцитов, сильная внутри- и междольковая лейкоцитарная инфильтрация, множественные фибротические очаги и некроз в отдельных участках долек. Практически на всех препаратах печени животных этой группы наблюдалось нарушение балочной структуры печеночных долек и сильное расширение печеночных сосудов, характерное для острого воспалительного процесса. Признаки повреждения паренхимы печени носили мозаичный характер: некоторые печеночные дольки были повреждены в меньшей степени. Мелкокапельная и крупнокапельная жировая дистрофия гепатоцитов занимала преимущественно центральные участки долек. Патоморфологическое исследование печени животных групп, подвергавшихся после введения токсиканта накожному нанесению трансдермальных систем с СМ и СК, свидетельствовало о снижении токсического эффекта CCU под воздействием исследуемых ТТС. Достоверной разницы в антигепатотоксическом эффекте СМ и СК при изучении морфологии печени отмечено не было. Однако выраженность этого эффекта зависела от типа наносимых ТТС.
Более заметное восстановление структуры печени наблюдалось при применении матриксных ТСС на желатиновой основе с липосомными формами СМ и СК (рис. 27 в). На препаратах печени животных групп, подвергавшихся накожному нанесению желатиновых ТТС с липосомными формами СМ и СК, структура печени была практически не нарушена, цитоплазматические и ядерные изменения гепатоцитов практически отсутствовали. Отмечалась лишь слабо выраженная лейкоцитарная инфильтрация долек. Таким образом, структура печени животных этих групп более других имела сходство с интактной печенью (рис. 27 а).
Гистологическая картина срезов печени животных групп, подвергавшихся после введения токсиканта накожному нанесению матриксных ПААГ-систем с СМ и СК (рис. 27 г) также свидетельствовала об антигепатотоксическом эффекте применяемых ТТС, однако этот эффект был менее выражен, чем в случае применения желатиновых ТТС с липосомными СМ и СК. На препаратах печени группы было заметно патологическое расширение сосудов, фибротические изменения, незначительная внутридольковая и значительная междольковая лейкоцитарная инфильтрация.
Наименее выраженный антигепатотоксический эффект относительно других типов систем в эксперименте проявляли ТТС с СМ и СК резервуарного типа (рис. 27 д). Рис. 27. Микрофотографии парафиновых срезов печени интакных мышей (а) и мышей с экспериментальным токсических гепатитом (б, в, г): б - гепатит в отсутствие лечения; в - накожные аппликации ТТС с липосомными формами СМ и СК на желатиновой основе; г - накожные аппликации ПААГ-систем с СМ и СК; д - накожные аппликации резервуарных ТТС с растворами СМ и СК.
При микроскопическом изучении гистологических препаратов печени, окрашенных Суданом III, в единичных препаратах печени интактной группы обнаруживались мелкокапельные включения жира в некоторых дольках. На микропрепаратах печени мышей с нелеченным токсическим гепатитом наблюдалось очаговое крупно- и мелкокапельное ожирение гепатоцитов; в то же время, в печени животных групп, получавших ТТС с СМ и СК различных типов, обнаруживались единичные мелкокапельные включения жира, редко - скопления нескольких капель жира и их слияния. Полученные данные свидетельствуют о том, что накожное применение ТТС с СМ и СК на очаге патологии предотвращает развитие жирового перерождения печени, обусловленного влиянием токсического агента.
В целом, данные биохимических и морфологических исследований свидетельствуют о снижении выраженности печеночной патологии у животных с острым токсическим гепатитом при применении исследуемых препаратов, причем наиболее заметная динамика позитивных изменений уровней маркеров гепатита наблюдалась в группах с накожным нанесением трансдермальных систем с липосомными формами СМ и СК на желатиновой основе. Такие результаты могут быть связаны с большой тропностью липосомных частиц этих веществ к клеткам печени, а также с тем, что фосфолипиды, входящие в состав липосом, оказывают репарирующее действие на клеточные мембраны и защищают их от повреждения токсикантами.
Таким образом, патоморфологическое исследование печени с применением микроскопического анализа согласуется с данными макроскопического осмотра и биохимических исследований сыворотки крови и свидетельствует о том, что флаволигнаны СМ и СК при их трансдермальной доставке посредством матриксных и резервуарных ТТС способны оказывать антигепатотоксический эффект. Наиболее выражен этот эффект в случае применения матриксных ТТС с липосомными формами СМ и СК на желатиновой основе: под воздействием таких систем заметно уменьшаются проявления воспалительного процесса в гепатоцитах и происходит восстановление структуры печени.
На основании исследования безопасности и терапевтической эффективности разработанных трансдермальных лекарственных форм флаволигнанов можно сделать заключение о том, что все типы систем могут применяться для трансдермальной доставки флаволигнанов и обладают терапевтической эффективностью.
