Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Свойства и терапевтический потенциал флаволигнанов силимарина из расторопши пятнистой (обзор литературы) 13
1.1. История применения расторопши пятнистой в медицине 13
1.2. Химический состав расторопши пятнистой 17
1.3. Структура и физико-химические свойства флаволигнанов силимарина 19
1.4. Терапевтический потенциал силимарина при различных патологиях 22
1.4.1. Гепатопротекторная активность силимарина 22
1.4.1.1. Патогенез заболеваний печени 22
1.4.1.2. Особенности повреждения печени под действием алкоголя 26
1.4.1.3. Особенности повреждения печени токсинами грибов 28
1.4.1.4. Механизмы гепатопротекторного действия силимарина 29
1.4.2. Терапевтический потенциал силимарина в профилактике и лечении заболеваний поджелудочной железы 34
1.4.3. Противоопухолевая активность силимарина 36
1.5. Пути увеличения биодоступности флаволигнанов силимарина 43
Заключение к главе 1 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 48
2.1. Определение наличия флаволигнанов в плодах расторопши пятнистой 48
2.1.1. Цианидиновая реакция (проба Синода) 48
2.1.2. Тонкослойная хроматография (ТСХ) 48
2.2. Количественное определение суммы флаволигнанов в плодах расторопши пятнистой 48
2.3. Количественное определение силикристина в плодах расторопши пятнистой 48
2.4. Выделение суммы флаволигнанов из плодов расторопши пятнистой 49
2.5. Количественное определение флаволигнанов 51
2.6. Выделение силикристина из суммы флаволигнанов расторопши пятнистой 51
2.7. Качественный анализ силикристина 52
2.7.1. Тонкослойная хроматография 52
2.7.2. Хромато-масс-спектрометрический метод 52
2.8. Количественное определение силикристина в субстанции 53
2.9. Определение растворимости силикристина в очищенной воде 53
2.10. Определение температуры плавления силикристина 53
2.11. Определение посторонних примесей в субстанции силикристина 54
2.12. Получение липосомной формы силикристина 54
2.13. Определение степени включения силикристина в липосомы 55
2.14. Изучение липосомных частиц с помощью электронной микроскопии 56
2.15. Определение размеров липосомных частиц 56
2.16. Определение остаточного растворителя хлороформа в лиофилизате липосомного силикристина 57
2.17. Определение посторонних примесей в лиофилизате липосомного силикристина 57
2.18. Количественное определение силикристина в лиофилизате липосом 58
2.19. Определение сроков годности субстанций 59
2.20. Исследование антитоксической активности образцов in vitro 60
2.20.1. Определение скорости монооксигеназных реакций, катализируемых цитохромом Р450 60
2.20.2. Определение скорости реакции конъюгации 2,4-динитрохлорбензола с глутатионом, катализируемой глутатионтрансферазой 61
2.21. Получение нековал ентного комплекса силикристина с полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ-силикристин) 61
2.22. Исследование гепатозащитной активности препаратов in vivo 62
2.22.1. Постановка эксперимента 62
2.22.2. Определение маркеров гепатита в сыворотке крови экспериментальных животных 62
2.22.3. Микроскопическое исследование морфологии печени экспериментальных животных 64
2.23. Статистическая обработка результатов 64
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 65
3.1. Выделение суммы флаволигнанов и силикристина из плодов расторопши пятнистой 65
3.1.1. Выделение суммы флаволигнанов из плодов расторопши пятнистой 65
3.1.2. Выделение силикристина из суммы флаволигнанов расторопши пятнистой 69
3.1.3. Стандартизация силикристина 69
3.2. Получение липосомной формы силикристина и исследование ее биологической активности in vitro 76
3.2.1. Получение липосомной формы силикристина 76
3.2.2. Стандартизация субстанции липосомного силикристина 78
3.3. Изучение антитоксической активности липосомного силикристина
в экспериментах in vitro 81
3.3.1. Изучение влияния липосомной формы силикристина и свободного силикристина на скорость реакций микросомального окисления, катализируемых цитохромом Р450 81
3.3.2. Изучение влияния липосомной формы силикристина и свободного силикристина на скорость реакции конъюгации, катализируемой глутатионтрансферазой 84
3.4. Исследование гепатозащитных свойств липосомной формы силикристина в экспериментах in vivo 88
3.4.1. Влияние липосомной формы силикристина и свободного силикристина на активность ферментов-маркеров гепатита и содержание общего билирубина в сыворотке крови экспериментальных животных 88
3.4.2. Влияние липосомной формы силикристина и свободного силикристина на морфологию печени 91
3.5. Увеличение био доступности и гепатозащитной активности силикристина с помощью
полиэтиленгликоля 93
3.5.1. Влияние препарата ПЭГ-силикристин на активность ферментов АсАТ, АлАТ, ЩФ и содержание общего билирубина в сыворотке крови экспериментальных животных 94
3.5.2. Влияние препарата ПЭГ-силикристин на морфологию печени 97
Общие выводы 100
Список литературы 101
Приложения 130
- Структура и физико-химические свойства флаволигнанов силимарина
- Пути увеличения биодоступности флаволигнанов силимарина
- Выделение силикристина из суммы флаволигнанов расторопши пятнистой
- Изучение влияния липосомной формы силикристина и свободного силикристина на скорость реакции конъюгации, катализируемой глутатионтрансферазой
Введение к работе
Актуальность темы. Разработка и создание профилактических и терапевтических средств, способных обеспечить надежную защиту человека от различных заболеваний, является актуальной задачей современной медицины и биотехнологии. В рамках решения поставленной задачи особое внимание уделяется выбору действующих веществ, а также оценке их фармакокинетических и технологических характеристик, поскольку знание данных параметров позволяет избрать необходимую стратегию для создания эффективных лекарственных препаратов.
В последние годы при разработке лекарственных препаратов в качестве действующих начал все чаще используют биологически активные вещества растительного происхождения. Это обусловлено тем, что растительные компоненты, будучи сходными по структуре с регуляторными молекулами человеческого организма, оказывают мягкое комплексное терапевтическое действие и имеют широкий терапевтический диапазон [ПО]. В настоящее время внимание многих исследователей привлекают природные полифенольные антиоксиданты и прежде всего флаволигнаны расторопши пятнистой, обладающие высоким потенциалом терапевтического действия [65]. Расторопша содержит силимарин, представляющий собой смесь флаволигнанов, включающую в себя силибинин (70-90%), изосилибинин, силидианин, силикристин, изосиликристин и 2,3-дегидросилибинин [61]. На сегодняшний день широко изучена и клинически доказана гепатопротекторная активность силимарина [82]. На основе флаволигнанов расторопши пятнистой созданы такие гепатопротекторные препараты, как «Гепадестал», «Карсил», «Легалон», «Силимар» и др. Сравнительно недавно у силимарина обнаружены новые лечебно-профилактические свойства. В литературных источниках имеются сведения о том, что силимарин обладает гипохолестеролемическим, кардиопротективным и нейропротективным действием, а также проявляет выраженную противоопухолевую и антиангиогенную активность [170]. Кроме того, изучена терапевтическая эффективность силимарина при отравлениях токсинами бледной поганки [152]. В последнее время также появляются сообщения о свойствах индивидуальных флаволигнанов силимарина. Исследований в этой области проведено еще немного, однако уже имеются данные о том, что индивидуальные флаволигнаны проявляют более выраженную активность по сравнению с силимарином [2]. Таким образом, благодаря многообразию свойств и высокой активности, силимарин и индивидуальные флаволигнаны могут рассматриваться в качестве перспективных действующих веществ для создания лекарственных препаратов, способных найти широкое применение в клинической практике при терапии различного рода заболеваний.
Несмотря на высокий потенциал силимарина в профилактике и лечении многих заболеваний, флаволигнаны, входящие в его состав, практически нерастворимы в воде и масле, что обусловливает их низкую биодоступность и препятствует проявлению максимальной терапевтической эффективности. Кроме того, низкая растворимость силимарина в воде делает невозможным его применение в инъекционной форме, отличающейся от других лекарственных форм относительно быстрым наступлением эффекта, прогнозируемой биодоступностью и действующей концентрации лекарственного вещества в плазме крови, а также возможностью достижения эффекта при более низкой дозировке действующего вещества [10].
Для достижения необходимого терапевтического эффекта некоторые производители гепатопротекторов на основе флаволигнанов расторопши прибегают к увеличению дозировки силимарина в лекарственной форме. Однако данный подход наряду с увеличением эффективности имеет и ряд недостатков. К ним относятся — нерациональное использование биологически активного вещества, увеличение массы лекарственной формы, неудобство применения и развитие нежелательных побочных эффектов. Поэтому для увеличения эффективности лекарственных препаратов на основе силимарина целесообразным является использование стратегии повышения биодоступности флаволигнанов.
Различными научными коллективами предпринимались попытки повышения биодоступности флаволигнанов посредством их химического модифицирования и комплексообразования с определенными агентами [164, 17]. Несмотря на успешные результаты в этой области, создание растворимых форм флаволигнанов с повышенной биодоступностью остается важной научно-практической задачей. Решение данной задачи может быть достигнуто средствами нанотехнологии.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилась разработка наносомных форм индивидуального флаволигнана силикристина.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Разработка метода выделения суммы флаволигнанов из плодов расторопши пятнистой с повышенным содержанием силикристина.
Выделение индивидуального флаволигнана силикристина из суммы флаволигнанов.
Разработка и получение липосомной формы силикристина.
Изучение антитоксической активности липосомной формы силикристина in vitro с использованием микросомальной биотест-системы.
Изучение гепатозащитной активности липосомной формы силикристина в экспериментах in vivo на мышах с модельным острым токсическим гепатитом.
6. Разработка и получение нековалентного комплекса силикристина с полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ-силикристин) и изучение его гепатозащитной активности в экспериментах in vivo. '
Научная новизна работы. Разработан метод получения очищенной суммы флаволигнанов с повышенным содержанием силикристина из плодов расторопши пятнистой. Впервые получены липосомная форма силикристина и нековалентный комплекс ПЭГ-силикристин. Определены форма, поверхность и средний размер липосомных частиц силикристина. Показано, что липосомная форма силикристина оказывает активирующее влияние на ферменты системы детоксикации организма и проявляет более высокую по сравнению со свободным силикристином антитоксическую активность в отношении ферментов цитохрома Р450 и глутатионтрансферазы.
Продемонстрировано, что липосомная форма силикристина и нековалентный комплекс ПЭГ-силикристин по сравнению со свободным флаволигнаном могут применяться в инъекционной форме и проявляют более высокую гепатозащитную активность.
Практическая значимость работы. Разработан метод выделения суммы флаволигнанов, отличающийся от существующих на сегодняшний день методов исключением использования дорогостоящих и токсичных органических растворителей на стадии экстракции и позволяющий получать очищенную сумму флаволигнанов с повышенным содержанием силикристина. Проведена стандартизация силикристина и липосомного силикристина. Высокая гепатозащитная активность полученных препаратов и возможность использования в инъекционной форме позволяют рассматривать их в качестве перспективных средств для терапии заболеваний печени.
Внедрение результатов исследований в практику. На основании проведенных исследований разработаны проекты ФСП на субстанции силикристина ,и липосомного силикристина. Разработан лабораторный регламент на получение липосомного силикристина.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 печатных работ.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на VI Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии» (г. Москва, 2008), XV конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2008), I фитотерапевтическом съезде (г. Москва, 2008).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков и 9 таблиц. Список литературы включает 270 источников, из которых 126 - зарубежные.
Основные положения, выносимые на защиту:
Разработка метода выделения суммы флаволигнанов из плодов расторопши пятнистой с повышенным содержанием силикристина.
Метод выделения из суммы флаволигнанов индивидуального флаволигнана силикристина и результаты изучения его физико-химических свойств.
Получение липосомной формы силикристина, проявляющей более высокую по сравнению со свободным силикристином антитоксическую активность in vitro и гепатозащитную активность in vivo.
Получение инъекционной формы силикристина на основе ПЭГ 6000, обладающей повышенной гепатозащитной активностью.
Структура и физико-химические свойства флаволигнанов силимарина
Родиной расторопши пятнистой является Западная и Центральная Европа. Это растение встречается в центральных и южных районах европейской части стран СНГ, а также на юге Западной Сибири, в Центральной и Средней Азии, в Украине и на Кавказе. Чаще всего расторопша растет по обочинам дорог, в сорных местах, на сухих и засоленных почвах.
Для медицинских целей расторопшу культивируют на Северном Кавказе и в Самарской области. Расторопша относится к хладостойким и засухоустойчивым растениям [56, 65, 79].
В мировой фитотерапии расторопша пятнистая по праву занимает одно из почетных мест как лекарственное растение с универсальными фармакологическими свойствами. О ее целебных свойствах известно с древних времен. Первое упоминание о расторопше пятнистой встречается в преданиях Древней Греции. В те времена корневище этого растения использовали для лечения желудочных заболеваний и как средство регуляции менструального цикла. Кроме того, верили в его способность защищать от инфекционных заболеваний. Древнегреческая поэтесса Сафо (ок. 630—572 г.г. до н.э.) использовала корневище расторопши как средство, усиливающее половую активность [74]. Описание расторопши пятнистой и указания об ее медицинском применении встречаются у греческого ученого Теофраста (ок. 372— 287 г.г. до н.э.) в книге «Исследование о растениях» [124, 262]. В его труде расторопша названа белой колючкой и размещена среди чертополохов. Упоминание о расторопше встречается в трактате «De materia medica» («О лекарственных веществах») греческого травника Диоскорида Педания (ок. 40-90 г.г.). В своем медицинском справочнике он рекомендовал молочный чертополох при многих заболеваниях [18,21, 127]. Римский натуралист Гай Плиний Секунд (Плиний Старший) (ок. 23—79 г.г.) описал чертополох молочный как желчегонное терапевтическое средство [42,111,131]. Расторопша пятнистая отмечена в числе лечебных средств при различных заболеваниях в трудах классика античной медицины Галена из Пергама(ок. 130-200 г.г.) [90,92,116]. В Средние века римским императором Карлом Великим (ок. 742-814 г.г.) был принят закон, согласно которому все монастыри были обязаны выращивать на своих землях лекарственные растения. Всего в указе было перечислено 89 трав, среди которых упоминается расторопша. В те времена ее использовали для лечения желудочных заболеваний, грудных и кожных болезней, водянки, задержки мочеиспускания, цинги и атрофии десен, при желтухе, чахотке [125]. Персидский врач и философ Авиценна (980-1037 г.г.) в работе «Алканон» рекомендовал отвар расторопши (бозовард) при подагре, слабости желудка и кровохаркании; принятие внутрь корня — при хроническом поносе и в качестве мочегонного средства; полоскание рта отваром корней — при зубной боли; повязки из корня — на слизистые опухоли [47]. В труде «Алвохия» Авиценна описал применение расторопши при радикулите, судорогах, болях в бедре и пояснице [76]. Кроме того, он рекомендовал чертополох как эффективное противоядие при укусах змей [71, 260]. Письменное упоминание о расторопше встречается в «Альманахе лекарственных средств» настоятельницы женского монастыря в немецком городе Бингене - Хильдергарды (1098-1179 г.г.). Настоятельница вела дневник, в котором суммировались медицинские знания того времени [248]. Английским ботаником А.Николасом Калперером (1616-1654 г.г.) в книге «Полный травник» было описано эффективное действие чертополоха при лечении печени и селезенки [71, 88]. Упоминание об этом растении встречается во всех русских справочниках о лекарственных растениях. В настоящее время в народной медицине используются практически все части растения (цветы, плоды, листья, корневище, семена), а также продукты их переработки (порошок плодов, жмых плодов, масло плодов, сок листьев, отвар и настой). Отвары и настои из семян, а также плоды, жмых, масло и мед, собранный с плантаций расторопши, рекомендуют применять при гепатите, желчнокаменной болезни, холестазах, болезнях селезенки, аллергии, при ушибах и растяжениях, при отравлениях токсическими веществами; сок листьев используется в сезонной терапии астенических состояний, анемии, гиповитаминозов, хронических заболеваний пищеварительной системы и опорно-двигательной системы [37, 73]. В гомеопатии зрелые плоды назначают при заболеваниях печени, желчного пузыря, селезенки [129]. В традиционной медицине в России к применению разрешены плоды расторопши пятнистой, сырье включено в Государственый реестр и предложено в качестве гепатопротекторного средства [33]. Расторопша пятнистая также используется в качестве пищевого ингредиента. Ее добавляют в кондитерские изделия, хлеб [56], безалкогольные [14] и алкогольные напитки [29, 77], салаты. Несмотря на то, что использование расторопши пятнистой известно с давних времен, ее химический состав и терапевтическая эффективность при лечении заболеваний определены относительно недавно.
Пути увеличения биодоступности флаволигнанов силимарина
Печень выполняет важнейшие функции (гомеостатическую, барьерную, метаболическую, депонирующую, экскреторную) и является органом, от бесперебойного функционирования которого зависит здоровье всего организма [93,121]. Повреждение этого органа факторами экзогенного и эндогенного происхождения могут приводить к развитию широкого спектра патологий. В России заболеваемость органов пищеварительного тракта занимает одну из лидирующих позиций в структуре общей заболеваемости и по статистическим данным составляет около 2500 на 100 тыс. населения, из которых 15-20% приходится на патологии печени [103,268]. В связи с этим поиск, создание и изучение механизмов действия новых эффективных терапевтических средств для профилактики и лечения заболеваний печени является актуальной задачей современной медицины.
Патогенез заболеваний печени Наиболее распространенной патологией печени является гепатит. Гепатит относится к воспалительным заболеваниям и может протекать как самостоятельное заболевание, так и являться вторичным симптоматическим проявлением различных инфекций и интоксикаций. По течению заболевания различают острые и хронические гепатиты [26]. К острым гепатитам относится группа заболеваний печени инфекционной, токсической и аллергической природы, заканчивающихся в большинстве случаев выздоровлением, но иногда возможен исход в острую (подострую) дистрофию, хронический гепатит и цирроз печени (необратимое замещение паренхиматозной ткани соединительной тканью) [113]. Хронические гепатиты представляют собой длительно текущие (более 6 мес.) заболевания печени воспалительно-дистрофического характера с умеренно выраженным фиброзом (уплотнение соединительной ткани с появлением рубцовых изменений) и преимущественно сохраненной дольковой структурой печени [9, 105].
Причиной развития гепатита могут быть вещества различного химического строения как природного, так и синтетического происхождения, а также такие биологические агенты, как вирусы и бактерии [93]. Гепатотоксические вещества на молекулярном уровне способны вызывать повреждение клеточных мембран, нарушение ионного баланса, оксидативный стресс, повреждение органелл и структурных компонентов клетки, стимуляцию апоптоза и др. [27,43,62, 181].
Первым барьером токсического действия на клеточном уровне является цитоплазматическая мембрана [27]. Гепатотоксины способны повреждать мембрану и нарушать компартментацию метаболизма, вызывая некротическую гибель клетки [4, 108]. Некроз клеток сопровождается выходом в кровь внутриклеточных ферментов и веществ, участвующих в метаболизме. При гепатитах характерно увеличение в сыворотке крови ферментов аланинаминотрансферазы и особенно аспартатаминотрансферазы. Поскольку клетки печени участвуют в конъюгации билирубина с глюкуроновой кислотой и экскреции его в желчные каналы, то в результате некроза гепатоцитов в сыворотке крови наблюдается увеличение уровня общего билирубина [1,115]. Повреждение мембран митохондрий может приводить к разобщению функционирования комплексов цепи переноса электронов (дыхательной цепи), в результате которого возникает дефицит АТФ, и, как следствие, гибель клетки [5, 54]. Для нормального функционирования клетке необходимо поддержание постоянного ионного баланса. Под воздействием гепатотоксических веществ происходит нарушение ионного баланса клеток печени, приводящее к повышению концентрации ионов Na+ и Са2+ и снижению уровня К+ в клетке [123,269]. Резкое повышение внутриклеточного уровня Са2+ как за счет его поступления из внешней среды, так и выхода из эндоплазматического ретикулума вызывает неконтролируемую активацию ферментов (гидролаз), разрушающих нуклеиновые кислоты, липиды и другие биологические молекулы [70, 71]. Другим ключевым фактором повреждения гепатоцитов является оксидативный стресс, характеризующийся превышением внутриклеточного уровня активных форм кислорода (АФК) и азота над возможностями устранения их системами антиоксидантной защиты [126,243]. К АФК относятся Н202 (перекись водорода), ОН" (гидроксильный радикал), 02 (супероксиданион), NO (оксид азота (II)), 02 (двухатомная молекула кислорода, которая обладает двумя неспаренными электронами с одним и тем же спином в двух раздельных орбиталях) [46]. Оксиданты вызывают окислительную модификацию биологически важных молекул — нуклеиновых кислот, белков и липидов [184]. Под воздействием гидроксильного радикала происходит окисление оснований ДНК, их модификация, разрыв цепей ДНК, что способствует возникновению рака, апоптозу и наследственным заболеваниям [45, 219]. Гепатотропные яды как непосредственно, так и через образование активных форм кислорода способны инактивировать SH-группы в серосодержащих аминокислотах, что приводит к инактивации ферментов, сшивке белков, изменению их пространственной структуры, дефициту жизненно необходимых серосодержащих аминокислот и нарушению работы ионных насосов [109, 139].
Выделение силикристина из суммы флаволигнанов расторопши пятнистой
Различные гепатотоксины способны индуцировать апоптоз в клетках печени, в результате которого происходит самоустранение индивидуальных клеток [72, 104].
Ряд лекарственных препаратов и ксенобиотиков вызывают избирательное поражение эндотелиальных синусоидальных клеток, что приводит к вено-окклюзионной патологии печени, характеризующейся сужением внутрипеченочных вен, нарушением оттока крови и развитием ишемии печени. Ишемия зачастую приводит к гибели клеток [93, 119].
Повреждение печени также может являться следствием активации иммунной системы [101, 177]. Под воздействием цитотоксических агентов, вирусов и бактерий в гепатоцитах нарушаются процессы нормальной секреции цитокинов - наблюдается увеличение продукции интерферона-у и фактора некроза опухоли [133]. Интерферон-у вызывает активацию фагоцитов, а фактор некроза опухоли участвует в механизмах некроза ткани [100, 167]. Фагоциты атакуют патогены смесью оксидантов и свободных радикалов [30], однако при высоком уровне продуцирования активные формы кислорода и азота способны вызывать различные повреждения клеток печени [126]. Кроме того, при различных гепатитах клетки Купфера секретируют провоспалительные цитокины - интерлейкины 1, 6 и 8, фактор некроза опухолей [137]. Интерлейкин-6 стимулирует синтез белков общей фазы воспаления [197]; интерлейкин-1 и фактор некроза опухоли принимают участие в некротических реакциях [66, 162]; интерлейкин-8 является хемоаттрактантом и участвует в миграции нейтрофилов в очаг воспаления [106]. Нейтрофилы вырабатывают активные формы кислорода, которые направлены на уничтожение фагоцитированных патогенов [155]. Избыточная секреция активных форм кислорода нейтрофилами приводит к повреждению клеточных мембран [45].
Под воздействием активных форм кислорода, эндотоксинов и др. происходит активация системы комплемента и секреция клетками Купфера хемоаттрактантов [158]. Хеммоаттрактанты (интерлейкин-8, лейкотриен В4) вызывают инфильтрацию нейтрофилов из кровеносных сосудов в паренхиму печени. Активированные нейтрофилы, взаимодействуя с эндотелиальными клетками сосудов, облегчают миграцию лейкоцитов [53,68]. Как уже было отмечено ранее, нейтрофилы относятся к биологическим источникам активных форм кислорода, способных поражать нормальные клетки организма.
Повреждение и разрушение клеток печени может происходить также в результате аутоиммунных реакций, вызванных рядом токсических веществ. При этом клетки организма начинают вырабатывать антитела к собственным нормальным клеткам [67, 226].
Особенности повреждения печени под действием алкоголя Основным местом метаболических превращений этанола является печень [99]. Превращение этанола в печени осуществляется тремя путями - NAD4-зависимой алкогольдегидрогеназой, каталазой и с помощью микросомальной этанолокисляющей системы. В результате метаболизма этанола происходит образование ацетальдегида, который затем превращается в уксусную кислоту и далее в ацетил-КоА [11, 89]. При высоком уровне алкоголя в крови происходит увеличение образования ацетальдегида, который является реакционно способным соединением. Ацетальдегид неферментативно ацетилирует SH- и ИНг-группы белков, липопротеинов и других соединений клетки, что приводит к нарушению ее нормального функционирования [142]. Так, ацетальдегид модифицирует глутатион - трипептид, играющий важную роль во внутриклеточной регуляции уровня промежуточных продуктов восстановления кислорода. Снижение уровня глутатиона приводит к повреждающему действию клеток активными формами кислорода и усилению перекисного окисления липидов [89].
Избыточное накопление NADH в процессе окисления этанола способствует ингибированию глюконеогенеза и развитию лактоацидоза. Кроме того, NADH подавляет цитратный цикл и приводит к активному синтезу кетоновых тел, жирных кислот и триацилглицеролов, тем самым способствует ожирению печени. Дополнительной причиной ожирения печени при алкоголизме является снижение синтеза фосфолипидов и апобелков, необходимых для формирования ЛПОНП, экспортирующих триацилглицеролы из печени в ткани [128].
В медицинской практике в качестве компонента комплексной терапии патологий печени, в том числе и алкогольного генеза, широкое распространение получили гепатопротекторы — лекарственные средства, улучшающие метаболические процессы в печени, повышающие ее устойчивость к патогенным воздействиям, а также способствующие восстановлению ее функций при различных повреждениях [48]. Некоторые гепатопротекторы, существующие на фармацевтическом рынке, представлены в таблице 1 [75, 95].
Несмотря на широкий ассортимент лекарственных средств, ни один из имеющихся в настоящее время на фармацевтическом рынке гепатопротекторов не удовлетворяет в полной мере предъявляемых к ним требований [221], поэтому поиск новых соединений, способных предупреждать и устранять повреждения печени, а также улучшение свойств известных соединений являются актуальной научно-практической задачей.
Изучение влияния липосомной формы силикристина и свободного силикристина на скорость реакции конъюгации, катализируемой глутатионтрансферазой
Другим, механизмом- гепатопротекторного действия силимарина является регуляция синтеза эйкозаноидов в клетках печени. Силимарин ингибирует активность фермента липоксигеназы [168], участвующего в образовании лейкотриенов. из арахидоновой кислоты, что препятствует развитию воспаления, проникновению нейтрофилов через кровеносную стенку в паренхиму печени и выработке . ими свободных радикалов [130, 170].
Силимарин« оказывает мембраностабилизирующее действие на клетки печени. Силимарин ингибирует активность цАМФ,- тем самым способствуя уменьшению избыточного поступления Caz+ в клетку и угнетению активации кальцийзависимых ферментов [38; 70].
Гепатопротекторное действие силимарина также реализуетсячерез стимуляцию биосинтеза белка гепатоцитами. Силимарин специфически стимулирует РНК-полимеразу І в клеточном ядре [239], что приводит к активации транскрипции генов и синтезу рРНК, способствующему увеличению числа рибосом и синтезу структурных и функциональных белков в клетках поврежденной печени.. Стимуляция-биосинтеза белка способствует регенерации ткани печени. При этом силимарин не оказывает влияния на скорость репликации и транскрипции генов в измененных клетках с максимальным уровнем синтеза ДНК, что исключает возможность, пролиферативного действия [231,240]. Силимарин также играет важную роль в регуляции синтеза жиров в печени. В ряде работ показано, что силимарин подавляет повышение уровня общих липидов и триацилглицеролов в печени и способствует активации Р-окисления жирных кислот [107]. Кроме того, силимарин может принимать участие в метаболизме холестерола. В экспериментальных работах продемонстрировано, что силимарин препятствует синтезу холестерола, ингибируя активность 3-гидроксиметилглутарил-КоА-редуктазы, а также способствует снижению уровня как свободного, так и входящего в состав ЛПНП холестерола [198, 237].
Силимарин оказывает положительное влияние на систему детоксикации организма. Обезвреживание экзо- и эндогенных веществ посредством системы детоксикации происходит путем химической модификации в два основных этапа -1 (модификация) и II (конъюгация). Силимарин проявляет активирующее влияние на ферменты I фазы обезвреживания ксенобиотиков — супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионтрансферазу [241]. Силимарин проявляет гепатопротекторное действие при отравлениях токсинами грибов Amanita phalloides, ингибируя образование посредством цитохрома Р45о токсичного метаболита аманита, вызывающего некроз клеток печени [188]. Кроме того, силимарин способен блокировать связывание токсинов грибов с соответствующими участками на клеточной мембране и транспортные системы, обеспечивающие их перенос через мембрану [245]. Многие патогенные бактерии экспрессируют фермент р-глюкуронидазу, отщепляющий глюкуроновую кислоту от токсического вещества и препятствующий его выведению из организма. Силимарин ингибирует активность Р-глюкуронидазы, способствуя тем самым образованию конъюгатов токсинов с глюкуроновой кислотой и выведению их из организма [196].
Силимарин оказывает желчегонное действие и может применяться при холестазе (застой желчи в желчном пузыре). Холекинетический эффект силимарина связан со снижением тонуса сфинктеров желчевыводящих путей [82].
Отмечено также, что силимарин способен оказывать влияние на иммунную систему. Ряд исследователей отмечает наличие у силимарина иммуномодулирующей активности, обусловленной уменьшением активности макрофагальных клеток, участвующих в презентации антигенов [249]. Продемонстрировано, что силимарин при алкогольной болезни печени способствует снижению цитотоксических лимфоцитов CD8+, продукции у-глобулинов и повышению скорости бласттрансформации лимфоцитов [51, 230].
Также показано, что силимарин влияет на процессы фиброгенезиса печени. Силимарин оказывает подавляющее действие в отношении клеток Купфера [159], которые под воздействием некоторых токсических соединений пролиферируют и превращаются в миофибробласты, способные к синтезу и отложению коллагеновых фибрилл в печени [207].
Таким образом, силимарин оказывает множественные эффекты в отношении гепатоцитов и обладает высоким потенциалом в профилактике и лечении заболеваний печени (рис. 6). В многочисленных исследованиях, посвященных изучению действия силимарина, показана его высокая эффективность при лечении больных с хроническими гепатитами и циррозами, токсическими поражениями печени, в том числе вызванными алкоголем, токсинами грибов, лекарственными препаратами, ядохимикатами, солями тяжелых металлов и др. [7, 44, 130].
