Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Эритропоэтин. Негемопоэтические свойства гормона 14
1.2. Ишемическое прекондиционирование 19
1.3. Механизмы ишемического прекондиционирования 21
1.4. Роль оксида азота в реализации эффектов ишемического прекондиционирования 26
1.5. Дистантное ишемическое прекондиционирование 28
1.6. Фармакологическое прекондиционирование 29
1.7. Средства, препятствующие развитию процесса прекондиционирования 34
1.8. Эндотелиальная дисфункция как предиктор ряда сердечно-сосудистых заболеваний 37
1.9. Функции эндотелия и механизмы развития эндотелиальной дисфункции 38
1.10. Развитие эндотелиальной дисфункции 42
1.11. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции 46
Глава 2. Материалы и методы 48
2.1. Обоснование доз исследуемых препаратов 48
2.2. Моделирование коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у кроликов и оценка величины зоны некроза 50
2.3. Исследование противовоспалительного действия по методу И.А. Ойвина 54
2.4. Методика исследования противовоспалительного действия на модели формалинового отека стопы мышей 55
2.5. Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота, оценка эндотелио- и кардиопротективного действия рекомбинантного эритропоэтина 57
2.6. Определение биохимических показателей при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции 60
2.7. Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.. 62
2.8. Статистико-математические методы исследования 63
Глава 3. Результаты собственных исследований 64
3.1. Результаты исследования влияния рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда 64
3.2, Исследование противовоспалительного действия рекомбинантного эритропоэтина и ишемического прекондиционирования на моделях формалинового отека стопы мышей и по методу И.А. Ойвина 73
3.2.1. Исследование противовоспалительного действия рекомбинантного эритропоэтина и ишемического прекондиционирования по методу И.А. Ойвина 73
3.2.2. Исследование противовоспалительного действия рекомбинантного эритропоэтина и ишемического прекондиционирования на модели формалинового отека стопы мышей 78
3.3. Исследование эндотелио- и кардиопротективной активности рекомбинантного эритропоэтина при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 80
Заключение 91
Выводы 106
Список литературы 108
- Эритропоэтин. Негемопоэтические свойства гормона
- Функции эндотелия и механизмы развития эндотелиальной дисфункции
- Результаты исследования влияния рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда
- Исследование эндотелио- и кардиопротективной активности рекомбинантного эритропоэтина при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
Введение к работе
Актуальность исследования. Эритропоэтин (ЕРО) - индуцибельный гипоксией гормон, который является существенным для нормального эритропоэза в костном мозге. Введение рекомбинантного эритопоэтина -эффективный и безопасный терапевтический подход к лечению анемии, связанной с хронической почечной недостаточностью (Collins A.J., 2003). Однако рецепторы ЕРО также широко распространены в сердечно-сосудистой системе, включая эндотелиальные, гладкомышечные и другие типы клеток, а негемопоэтические эффекты рекомбинантного эритропоэтина становятся все более и более очевидными. В настоящее время эритропоэтин рассматривают как мощный защитный тканевой цитокин. Появляются сведения о том, что у рекомбинантного эритропоэтина есть потенциально благоприятное воздействие на сердечно-сосудистую систему. Кроме того, ЕРО увеличивает число функционально активных предшественников эндотелиальных клеток, стимулируя таким образом ангиогенез (Smith K.J., Bleyer A.J., Little W.C., 2003).
Многочисленные фундаментальные исследования последних лет подтвердили роль дисфункции сосудистого эндотелия в патогенезе многих сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Доказано, что ключевую роль в патогенезе атеросклероза, артериальной гипертонии и ишемической болезни сердца играет именно эндотелиальная дисфункция (ЭД) (Астанина И.А., 2004; Белоусов Ю.Б., 2004). При этом ЭД проявляет себя либо в виде спазма артерий, либо в виде отсутствия реакции в ответ на воздействие физиологических или фармакологических стимулов, тогда как нормальные сосуды реагируют дилатацией. Такая патологическая реакция эндотелия считается начальным этапам развития атеросклероза с вовлечением не только крупных артерий, но и сосудов микроциркуляторного русла (Bell D.M., 2001; Berk B.C., 2002). При этом тяжесть течения атеросклероза всегда коррелирует с ЭД (Vasa М, 2002), а стандартная терапия ССЗ не устраняет ЭД, при этом сохраняется повышенный риск развития осложнений (Галенко А.С., Шуленин С.Н., 2006; Spicket C.V., 2007).
Нарушенная NO-зависимая вазодилатация и парадоксальная вазоконстрикция эпикардиальных сосудов приобретают особое клиническое значение для развития ишемии миокарда в условиях умственного и физического стресса или холодовой нагрузки. Учитывая тот факт, что перфузия миокарда регулируется резистивными коронарными артериями, тонус которых зависит от вазодилататорной функции коронарного эндотелия, даже при отсутствии атеросклеротических бляшек дефицит NO в коронарном эндотелии способен привести к миокардиальной ишемии.
Поиск эффективных средств коррекции нарушенной эндотелиальной функции у больных с инфарктом миокарда остается одним из важных направлений современной кардиологии. В связи с этим интерес к изучению физиологического феномена, названного прекондиционированием, со стороны как экспериментальной, так и практической медицины огромен.
Свидетельством этому являются многочисленные публикации (Simon R.P., 2003; Ostadalova I., 2002; Perez-Pinzon M.A., 2007), в том числе в ведущих мировых научных изданиях (Becker К., 2009). Метод прекондиционирования нашел широкое применение в кардиохирургии (Parsa С.J., 2007), сосудистой хирургии, операциях на почках и головном мозге (Ren С, Gao X., 2008; Siddiq A., Aminova L.R., 2009; Tramontano A.F., 2003).
Обнаружено, что устойчивость тканей к ишемии может повышаться в результате прекондиционирования, вызванного короткими эпизодами ишемии - реперфузии. При этом появляется «временное терапевтическое окно» для проведения хирургических вмешательств. Показано, что ишемическое прекондиционирование является общебиологическим механизмом и реализуется за счет активации АТФ-зависимых калиевых каналов (К+АТФ-каналы) в ответ на выделение аденозина, брадикинина, опиоидов и др. (Gross G.J., 2001). Свидетельством естественного механизма реализации является система многоуровневого иерархического дублирования, включающая нейрогенный, гуморальный и внутриклеточный компоненты, связанные с дыханием в митохондриях. Последнее указывает на существование универсальной «фармакологической мишени» для запуска феномена прекондиционирования.
Интригующим с точки зрения практического использования и,
одновременно малоизученным является феномен дистантного
прекондиционирования, суть которого состоит в том, что кратковременные
эпизоды ишемии одного органа (почки, брыжейки, нижней конечности)
повышают устойчивость других органов к тяжелым ишемическим
повреждениям (Dave K.R., 2006). Наибольшее развитие данная концепция
получила в работах, посвященных изучению реакции сердца и головного мозга.
Однако предполагаемый механизм реализации феномена
прекондиционирования указывает на возможность его универсального использования в хирургии для защиты органов в условиях редуцированного кровообращения и, возможно, стимуляции неоангиогенеза.
В фармакологическом аспекте одним из наиболее перспективных гуморальных агентов, принимающих участие в реализации феномена прекондиционирования, является эритропоэтин. Предпосылкой к этому является, то, что период полувыведения его значительно выше, чем других гуморальных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, «временное терапевтическое окно» должно быть существенно шире. Не исключается возможность использования эритропоэтина как специфического активатора фактора роста эндотелия сосудов для стимуляции неоваскулогенеза (Van der Meer P., 2005).
В лаборатории кардиофармакологии НИИ экологической медицины КГМУ ранее проводились исследования влияния рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования (ДИП) на выживаемость кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез. Полученные результаты позволили сделать заключение о том, что применение рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического
прекондиционирования увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на ножке и показатели микроцикуляции в ишемизированной контрлатеральной конечности за счет уменьшения очага некроза и стимуляции неоваскулогенеза.
Отдельно, вселяют оптимизм сведения об эндотелио- и кардиопротективных эффектах как прекондиционирования, так и эритропоэтина, что, несомненно, требует дальнейшего углубленного изучения.
Таким образом, изложенное свидетельствует об актуальности исследования механизмов протективного действия и возможности использования дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина как универсального пути оптимизации выживания ишемизированных тканей.
Цель исследования: провести оценку эффективности применения рекомбинантного эритропоэтина при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.
Задачи исследования:
-
Изучить влияние рекомбинантного эритропоэтина на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у лабораторных кроликов.
-
Изучить влияние дистантного ишемического прекондиционирования на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у лабораторных кроликов.
-
Оценить эффективность комбинации рекомбинантного эритропоэтина и ишемического прекондиционирования на модели коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у лабораторных кроликов.
-
Изучить механизмы реализации эффектов рекомбинантного эритропоэтина через активацию системы синтеза оксида азота и АТФ-зависимые калиевые каналы по механизму ишемического прекондиционирования.
-
Изучить противовоспалительные эффекты рекомбинантного эритропоэтина на модели формалинового отека стопы у мышей и влияние на сосудистую проницаемость по методу И.А. Ойвина.
6. Изучить эндотелио- и кардиопротективные эффекты рекомбинантного
эритропоэтина при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота.
Научная новизна исследования. В результате выполнения исследования
впервые предложены эффективные способы уменьшения зоны некроза при
моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда с помощью
рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического
прекондиционирования. Обоснована возможность применения
рекомбинантного эритропоэтина в субэритропоэтических дозах как средства для фармакологического прекондиционирования при состояниях, сопровождающихся ишемическими нарушениями и эндотелиальной
дисфункцией. В экспериментах на лабораторных мышах и лабораторных кроликах-альбиносах доказаны противовоспалительные эффекты рекомбинантного эритропоэтина.
Показано, что положительный эффект рекомбинантного эритропоэтина обусловлен их конечным действием на митохондриальные К+лтФ-каналы, eNOS и iNOS. Механизмы реализации кардиопротективного действия ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина обусловлены их влиянием на нитроксидэргическую систему, сосудистую проницаемость и АТФ-зависимые калиевые каналы. Это позволяет рассматривать эритропоэтин как основной триггер в развитии положительного протективного эффекта дистантного прекондиционирования.
Изучена возможность коррекции L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции рекомбинантным эритропоэтином в субэритропоэтических дозах и показаны его эндотелио- и кардиопротективные эффекты.
По результатам проведенных экспериментальных исследований получен 1 патент РФ на полезную модель, получено 1 положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение, подано 3 заявки на получение патента РФ.
Практическая значимость. В работе экспериментально обоснована эффективность применения дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования для профилактики и коррекции ишемических нарушений в миокарде.
Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина в субэритропоэтических дозах для профилактики и коррекции ишемических нарушений в миокарде.
Внедрение результатов научных исследований. Результаты работы используются в лекционных курсах кафедры фармакологии ГОУ ВПО КГМУ, кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ГОУ ВПО БелГУ и кафедры фармакологии, клинической фармакологии и фармации медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет».
Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых (Курск, 2009-2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2010), XVI и XVII национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2010). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии; травматологии; ортопедии и военно-полевой хирургии; клинической фармакологии; внутренних болезней № 2; анатомии человека; биоорганической химии; инфекционных болезней и эпидемиологии; мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф; нормальной физиологии
им. профессора А.В. Завьялова; общей химии; фармакогнозии и ботаники; НИИ Экологической медицины КГМУ.
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе три из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Положения, выносимые на защиту.
-
Рекомбинантный эритропоэтин достоверно, по сравнению с контрольной группой, уменьшает величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда. Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом, неселективная блокада NO-синтазы с помощью L-NAME, селективная блокада индуцибельной NO-синтазы с помощью аминогуанидина полностью нивелирует корригирующий эффект дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда.
-
Рекомбинантный эритропоэтин достоверно, по сравнению с контрольной группой, оказывает противовоспалительное действие при моделировании формалинового отека стопы мышей и изучении сосудистой проницаемости по методу И.А. Ойвина, которое реализуется по механизму дистантного ишемического прекондиционирования с вовлечением АТФ-зависимых калиевых каналов, eNOS и iNOS.
3. Рекомбинантный эритропоэтин, вводимый подкожно в дозе 50 МЕ/кг
на первые, третьи и пятые сутки эксперимента, оказывает эндотелио- и
кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной
эндотелиальной дисфункции, выражающееся в уменьшении коэффициента
эндотелиальной дисфункции, снижении адренореактивности, предотвращении
исчерпания миокардиального резерва, нормализации биохимических маркеров
и морфологических показателей функции сосудистого эндотелия, которые
реализуются по механизму дистантного ишемического прекондиционирования
с вовлечением АТФ-зависимых калиевых каналов, eNOS и iNOS.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 272 источника, из которых 53 отечественных и 219 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 31 рисунок.
Эритропоэтин. Негемопоэтические свойства гормона
Более 100 лет назад (в 1906 году) французские ученые Carnot и De Flandre первыми высказали предположение о возможном существовании в организме гормонального фактора, контролирующего эритропоэз, и назвали его гемопоэтином (эритропоэтином) [91]. В чистом виде гормон был выделен лишь в 1977 году, а в 1985 году Lin F.K. с соавт. и Jacobs К с соавт. клонировали ген эритропоэтина и экспрессировали его на клетках яичника китайского хомячка [172, 181]. В связи с синтезом эритропоэтического фактора роста - рекомбинантного эритропоэтина in vitro появилась новая возможность эффективно и безопасно регулировать эритропоэз. Исследования последних лет значительно расширили область применения ЭПО. Интенсивно изучаются возможности использования ЭПО в неврологии, кардиологии, гематологии, онкологии и в других областях клинической медицины [80, 124, 152, 210].
Эритропоэтин является кислым гликопротеидом, состоит из цепи 165 аминокислот и карбоангидратной части и активно гликозилирован [16, 21, 91]. Последняя состоит из одного О- и трех N-связанных олигосахаридов, на концах которых находятся сиаловые группы, обеспечивающие биологическую активность всей молекулы, гормон имеет молекулярную массу 30400 дальтон; время биологического полураспада у человека - 6-8 часов. У здоровых людей уровень эритропоэтина в плазме варьирует в пределах 0,01-0,03 МЕ/мкл. Запасов его в организме не обнаружено. Уровень гормона в сыворотке низкий, но относительно стабильный. Образование не индуцируется посредством нервной или гуморальной регуляции [139, 141].
Главным фактором, регулирующим продукцию эритропоэтина, является гипоксия [91]. В условиях гипоксии количество циркулирующего в плазме гормона возрастает примерно в 1000 раз и достигает 5-30 ед/мл [16, 91, 141]. В ответ на снижение кислорода фактор индукции гипоксии (HIFla) активирует его выработку [16].
Стимулируют биосинтез эритропоэтина также некоторые гормоны гипоталамо-гипофизарной системы: тиреоидные и некоторые стероидные гормоны [21, 141].
Функции эритропоэтина осуществляются через специфические поверхностные рецепторы эритропоэтина (рЭПО). Ген для рЭПО (19pl3.2/EPOR) обнаружен на хромосоме 19 у человека; в локусе 19р13.3-р13.2; он кодирует белок, состоящий из 507 аминокислот и содержащий одну связанную с мембраной область. ЭПО связывается с двумя молекулами рЭПО. Это приводит к гомодимеризации рецептора с последующей активацией нескольких путей сигнальной трансдукции (передачи сигнала) [262]. В целом, считается, что рЭПО относится к семейству цитокиновых рецепторов. При связывании гормона с его рецептором, последний через активацию 1ак2-тирозинкиназы приводит к запуску различных внутриклеточных путей, обеспечивающих функцию клеток эритроидного ряда.
Экспрессия рЭПО идентифицирована не только на клетках гемопоэтических линий, но также и в других тканях, например в эпикарде и перикарде [111, 121, 130]. Октрытие рЭПО на мезангиальных клетках и в миокарде, фибробластах мышечной ткани и нейронов позволило изучить неэритропоэтические функции гормона [84, 117, 121, 126, 234]. В дополнение ко всему, гормон, как было показано, является промоутером пролиферации эндотелиальных клеток, эмбриональных стволовых клеток печени и гладкой мускулатуры [121, 130, 131]. Данные о широком распространении рЭПО в тканях, позволяют обоснованно предполагать, что недостаток в системе гормон-рецептор может приводить к различным биологическим проявлениям [16].
Перспективы применения эритропоэтина в клинике объясняются его плеотропными эффектами. Он способствует антиапоптозу эндотелия и нервной ткани [119, 120, 125, 152, 156] редуцированию гипертрофии левого желудочка (ЛЖ), увеличению толерантности к физической нагрузке у больных с хронической сердечной недостаточностью (ХСН) [54, 85, 123, 259].
ЭПО может быть главным фактором при коррекции анемии не только из-за редкости возникновения побочных реакций на него, но также из-за того, что он вызывает образование и высвобождение молодых клеток из костного мозга в кровь. Кривая диссоциации кислорода у этих клеток сдвинута вправо относительно нормальных клеток, вызывая высвобождение повышенного количества кислорода в ткани, чем это происходит в норме [135].
В опытах на сердцах крыс показано, что лечение ЭПО приводит к улучшению коронарной перфузии, внося значимый вклад в уменьшение конечного диастолического давления в левом желудочке (ЛЖ) и улучшению его систолической функции [85]. Такой эффект связывают с активацией эндотелиальной N0 синтазы и АКТ (протеинкиназа В), которая медиирует фосфорилирование, приводя к длительной NO-зависимой вазодилатации [94]. Увеличение активных форм АКТ приводит к защите миокарда от ишемии in vivo [62]. АКТ (протеинкиназа В) - серин-треонин киназа, которая активируется фосфатидилинозитол-3-киназой и играет важную роль в обеспечении жизнедеятельности клетки - блокирует каспазы, функция которых - обеспечение программы апоптоза [103]. Сигнальная система фосфатидилинозитол-3-киназа/АКТ существует для защиты миокарда от ишемического прекондиционирования, подобно инсулиновому фактору роста 1 и инсулину [205]. ЭПО активирует АКТ и увеличивает длительность функционирования эндотелиальных клеток [94] и кардиомиоцитов [127] при кислородном голодании.
Применение ЭПО при инфаркте миокарда (ИМ) показало, что уменьшение инфарктной зоны обусловлено вовлечением в процесс сосудистых клеток предшественников [121] которые способствуют регенерации ткани.
Parsa CJ. et al. (Колледж Медицины, Филадельфия) показали, что предварительная обработка ЭПО миобластов, выделенных из сердец крыс, уменьшает перекисный апоптоз приблизительно на 50% (р 0,05). Кроме того, это защищает миобласты от повреждения в течение 12 ч аноксии (р 0,010). Авторы изучали эффект ЭПО in vivo, вводя его кроликам до индуцирования инфаркта миокарда (ИМ). Через 6 ч после ИМ в группе ЭПО выявлялось гораздо меньше апоптотических клеток, чем в группе контроля, получавшей физиологический раствор (р 0,001). Через 3 дня после ИМ размер зоны инфаркта в группе ЭПО был достоверно меньше, чем в группе контроля (р=0,004). При этом показатель гематокрита не изменялся. Однократное введение малой дозы ЭПО не повышало риск тромбоза и смертности. При введении ЭПО сохранялся инотропный резерв при неизмененных частоте сердечных сокращений и конечно-диастолическом давлении в левом желудочке [54].
В доступной литературе обнаружены противоречивые данные о взаимоотношении ЭПО и артериальной гипертензии (АГ). Так Kobusiak Prokopowicz М (2002) [177] акцентирует внимание на том, что ЭПО активирует тканевую ренин-ангиотензин-альдостероновую систему (РААС) и синтез эндотелина и серотонина, и таким образом может проявлять направленный вазопрессорный эффект и минимизирует эффект оксида азота на гладкомышечные клетки сосудов. Авторы проводили исследование 174 пациентов в возрасте 17-79 лет (средний возраст 54±15 лет) с АГ (контрольную группу составили 11 здоровых человек) и показали, что уровни ЭПО в плазме крови коррелировали с диаметром МЖП (г=0,519), концентрацией ренина в плазме крови (г=0,424). У пациентов с тяжелой АГ ЭПО коррелировал с содержанием калия в крови и уровнем 24-часовой микроальбуминурией (г=0,574 и г=0,465, соответственно) и отрицательно с креатинином (г=-0,768). Гипертензивная реакция - наиболее частое осложнение при лечении пациентов ЭПО. Нередко отмечается развитие тромбозов, возможно и обострение пролиферативной диабетической ретинопатии [272].
Во многих исследованиях было показано протективное действие эритропоэтина на ишемию - реперфузию в различных органах и тканях, включая головной мозг [90], спинной мозг [97], мышечную ткань сосудов [264], сердце [90, 120]. Причем даже однократное введение после инфаркта миокарда или другого ишемического события (операция на сердце, острый коронарный синдром) обеспечивает как немедленную, так и пролонгированную кардиопротекцию за счет сохранения жизнеспособного миокарда в период ишемии - реперфузии [264]. Авторы считают, что ЭПО можно назначать за день до ангиопластики, поскольку он не увеличивает вязкость крови, а также при тяжелой стенокардии и угрозе инфаркта миокарда [118].
Функции эндотелия и механизмы развития эндотелиальной дисфункции
В настоящее время известно, что эндотелий сосудов играет важную роль в регуляции таких процессов, как дилатация и констрикция сосудов, адгезия тромбоцитов, рост гладкомышечных клеток сосудов и др. [15, 22, 33, 45, 140]. Функции эндотелия складываются как баланс регуляторных субстанций, определяющих целостную работу системы кровообращения, среди которых основными являются:
вазорегуляторная (секреция вазоактивных агентов ):
- вазодилататоры (оксид азота, простациклин, брадикинин);
- вазоконстриктори (эндотелии-1, простагландины, тромбоксан, ангиотензин, эндопероксиды);
участие в механизме свертывания крови и фибринолизе:
- атикоагулянтные факторы (NO, простациклин, тромбомодулин, тканевой активатор плазминогена);
- прокоагулянтные факторы (тромбин, ингибитор активатора плазминогена);
регуляция факторов роста:
- секреция эндотелиального фактора роста, тромбоцитарного фактора роста, фактора роста фибробластов, ангиотензина II;
- секреция гепариноподобных ингибиторов роста;
адгезия лейкоцитов:
- секреция молекул адгезии, селектинов
ферментативная активность:
- секреция АПФ, протеинкиназы С
регуляция факторов воспаления:
- секреция NO
- фактор некроза опухоли, супероксидные радикалы.
Рассматривая функции эндотелия, можно говорить об очень сложном механизме взаимодействия антагонистических медиаторов, а также о регуляции ими различных физиологических эффектов. Многие традиционные факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний сопровождаются нарушением нормальной функции эндотелиальных клеток. В широком смысле, эндотелиальная дисфункция может быть определена как неадекватное (увеличенное или сниженное) образование в эндотелии различных биологически активных веществ. В последнее время сложилось более узкое представление об эндотелиальной дисфункции как о состоянии эндотелия, при котором имеется недостаточная продукция оксида азота. Поскольку оксид азота принимает участие в регуляции практически всех функций эндотелия, а кроме того, является фактором, наиболее чувствительным к повреждению, такое представление о дисфункции эндотелия вполне корректно [6, 27, 58, 60].
N0 является одним из наиболее мощных вазодилататоров. Проникая из эндотелиальных клеток (ЭК) в гладкомышечные клетки сосудистой стенки, он активирует растворимую гуанилатциклазу, что ведет к повышению уровня цГМФ, активации цГМФ-зависимых протеинкиназ (PKG), снижению концентрации кальция, расслаблению сосудов. Кроме того, он опосредует сосудорасширяющие эффекты эндотелийзависимых вазодилататоров (ацетилхолина, брадикинина, гистамина и др.), тормозит образование эндотелиального сосудосуживающего фактора эндотелина-1 и высвобождение норадреналина окончаниями симпатических нейронов, препятствует осуществлению чрезмерных эффектов других вазоконстрикторов (ангиотензина, тромбоксана А2). Благодаря этому NO принимает активное участие в регуляции сосудистого тонуса и кровотока, уровня артериального давления (АД), системной и региональной гемодинамики [24, 195].
N0 стимулирует синтез эндотелиального фактора роста [204] и ангиогенез [102], но тормозит пролиферацию [260] и миграцию [209] гладкомышечных клеток (препятствуя тем самым образованию неоинтимы и гиперторофии сосудов) [179], уменьшает (в небольших концентрациях) или увеличивает (в больших концентрациях) апоптоз [175], подавляет синтез внеклеточного матрикса, поддерживая всем этим нормальную структуру сосудистой стенки.
NO обладает противовоспалительным и антитромбогенным эффектами: тормозит транскрипцию провоспалительного ядерного фактора каппа-В (NF-kB) [72, 74] путем индукции и стабилизации NF-kB ингибитора ІкВ-а, блокирует стимулируемую цитокинами экспрессию адгезивных молекул эндотелия ICAM-1, VCAM-1, Е-селектин [202] и хемотаксических пептидов моноцитов [208], уменьшает прилипание, инфильтрацию, агрегацию нейтрофилов и моноцитов, превращение последних в макрофаги [207], тормозит агрегацию и адгезию тромбоцитов [193], экспрессию активирующего тромбоциты фактора [186].
N0 обладает антиоксидантными свойствами [218], препятствует патогенным влияниям липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) [162].
Таким образом, широкий спектр биорегуляторных эффектов сосудистого N0 указывает на то, что снижение его уровня под влиянием тех или иных факторов должно вызывать существенные изменения функций эндотелиоцитов и системы кровообращения в целом. Эти нарушения включают: снижение эффектов эндотелийзависимых вазодилататоров и повышение вазоконстрикторных влияний, рост АД, нарушения системной и региональной гемодинамики, функций сердца, увеличение адгезивных молекул эндотелия, агрегации тромбоцитов; прилипание их и лейкоцитов к сосудистой стенке; пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток с образованием неоинтимы, синтез внеклеточного матрикса и др. [23].
В организме человека NO образуется из аминокислоты L-аргинина под влиянием трех изоформ NO-синтетазы: двух конститутивных — эндотелиальной и нейрональной и одной индуцируемой:
нейрональная (nNOS);
индуцируемая - выделяется из эндотелия и макрофагов при патологических состояниях (при воспалении); ее экспрессию стимулируют некоторые цитокины и эндотоксины (iNOS);
эндотелиальная - участвует в синтезе NO эндотелием и регуляции сосудистого тонуса (eNOS).
Все они осуществляют соединение молекулярного кислорода с атомом азота в терминальной гуанидиновой группе L-аргинина. При этом, помимо NO, одновременно образуются соответствующие количества L-цитролина, который затем вновь рециклируется, пополняя внутриклеточные запасы L-аргинина. Эти три изоформы NOS имеют сходную структуру и осуществляют свое действие при наличии множества кофакторов, в том числе флавинов, NADPH, тетрагидробиоптерина [79, 174, 179, 217].
eNOS и nNOS являются Са2+- зависимыми изоформами, они обратимо связываются с кальмодулином и синтезируют относительно небольшие количества N0, который действует как интрацеллюлярный мессенджер. iNOS, наоборот, связывается с кальмодулином необратимо; ее активность не 9-І зависит от Са [23].
Именно оксид азота, продуцируемый изоформой eNOS, является физиологически значимым вазодилататором, ингибитором агрегации и адгезии тромбоцитов, ингибитором пролиферации и миграции гладкомышечных клеток. Снижение продукции и/или биодоступности NO, синтезирующегося в эндотелиальных клетках, считают одной из основных причин дисфункции эндотелия, имеющей место при таких патологических состояниях, как дислипидемия, гиперхолестеринемия, сахарный диабет 2 типа, артериальная гипертония, сердечная недостаточность и др. [22, 33].
Результаты исследования влияния рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда
Наложение лигатуры на нисходящую ветвь левой коронарной артерии у крыс в контрольной группе животных приводило к развитию некроза миокарда, размер которого составил 27,3±1,2 % от площади среза миокарда левого желудочка. Соответственно размер интактного миокарда составил 72,7±1,2 % (табл. 3.1, рис. 3.1, 3.2).
Применение местного прекондиционирования путем пережатия левой коронарной артерии за 30 минут до моделирования инфаркта миокарда привело к достоверному уменьшению площади некротизированного миокарда до 11,8±0,8% (табл. 3.1, рис. 3.2).
Применение дистантного прекондиционирования путем пережатия бедренной артерии, фармакологического прекондиционирования путем внутривенного введения рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг и их сочетания за 30 минут до моделирования коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда привело к достоверному уменьшению площади некротизированного миокарда (табл. 3.1, рис. 3.3, 3.4, 3.5, 3.12). Наибольшая протективная активность обнаружена при сочетанном применении эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования, и показатель площади некротизированного миокарда в данной группе животных составил 7,4±0,6% (табл. 3.1, рис. 3.5, 3.12).
Неселективная блокада NO-синтазы с помощью внутривенного введения L-NAME в дозе 25 мг/кг и селективная блокада индуцибельной NO-синтазы (iNOS) с помощью внутривенного введения аминогуанидина в дозе 100 мг/кг на фоне моделирования инфаркта миокарда, применения рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования привела к блокированию эффектов ишемического и фармакологического прекондиционирования. Величина зоны некроза в группе животных, получавших L-NAME и рекомбинантный эритропоэтин на фоне моделирования инфаркта миокарда, составила 25,3±0,8%, в группе животных, получавших L-NAME и дистантное прекондиционирование, -23,5±1,2%, аминогуанидин и рекомбинантный эритропоэтин - 28,6±2,9%, аминогуанидин и дистантное прекондиционирование - 22,8±2,0% (табл. 3.2, рис. 3.6, 3.7, 3.8,3.9, 3,12).
Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов с помощью внутрибрюшинного введения глибенкламида дозе 0,4 мг/кг на фоне моделирования инфаркта миокарда, применения рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования привела к блокированию эффектов ишемического и фармакологического прекондиционирования. Величина зоны некроза в группе животных, получавших глибенкламид и рекомбинантный эритропоэтин на фоне моделирования инфаркта миокарда, составила 21,2±1,1%. В группе животных, получавших глибенкламид и дистантное прекондиционирование, -24,2±1,5% (табл. 3.2, рис. 3.10, 3.11, 3.12).
Исследование эндотелио- и кардиопротективной активности рекомбинантного эритропоэтина при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
Согласно дизайну исследования, в контрольной группе животных эндотелиальную дисфункцию моделировали ежедневным в течение 7 суток внутрибрюшинным введением L-NAME в дозе 25 мг/кг.
Рекомбинантый эритропоэтин вводили подкожно в дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки от начала эксперимента за 30 мин до L-NAME. По протоколу на восьмые сутки наркотизированное животное брали в эксперимент.
Болюсное внутривенное введение АХ в течение 3-5 секунд приводило к резкому падению артериального давления достигающего пика у интактных животных для систолического давления (САД) 84,3±4,4, для диастолического давления (ДАД) - 38,7± 2,8 и для среднего артериального давления (СрАД) 53,9±2,7 мм рт. ст. При этом в течение первых 2-3 секунд развивалась резкая брадикардия до 130-150 ударов в минуту. Восстановление артериального давления (АД) происходило в среднем за 42,2±0,8 секунд после нормализации сердечного ритма. ЭНВД характеризовалась снижением САД до 83,0±3,7, ДАД до 42,1±4,4 и СрАД до 55,7±3,5 мм рт. ст. с последующим полным восстановлением в среднем в течение 45,1 ±1,0 секунд. Блокада NO-синтазы с помощью длительного, ежедневного, в течение 7-суток внутрибрюшинного введения L-NAME в дозе 25 мг/кг вызывало артериальную гипертензию (САД — 190,3±6,7, ДАД - 145,0±3,9, СрАД - 160,1±4,6 мм рт. ст.) и приводила к меньшему снижению показателей АД после введения АХ (САД до 110,6±5,2, ДАД до 82,8±6,6, СрАД до 92,1±6,1 мм рт. ст.) и НП (САД до 88,7±4,7, ДАД до 50,8±4,2 и СрАД до 63,4±4,1 мм рт. ст.) по сравнению с интактными животными.
Влияние рекомбинантного эритропоэтина на исходные показатели артериального давления у наркотизированных крыс с моделированием L-NAME-индуцированной патологии представлено на рисунке 3.21 и в таблице 3.5.
Одновременное введение L-NAME и рекомбинантного эритропоэтина привело к снижению показателей значений АД, по сравнению с группой L-NAME: САД - 132,3±6,4, ДАД - 103,0±6,6 мм рт. ст. Также отмечалось потенцирование снижения показателей артериального давления в ответ на введение АХ (табл. 3.3).
Принципиальная разница в ЭЗВД и ЭНВД у интактных животных и животных с введением ингибитора NO-синтазы L-NAME закономерно привела нас к необходимости выведения специального показателя, характеризующего степень эндотелиальной дисфункции, являющегося отношением площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение НП к площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение АХ.
Мы рассчитывали это отношение у каждого животного интактной группы и крыс после моделирования блокады NO-синтазы и получили разницу данного показателя в 5 раз - соответственно 1,1 у интактных и 5,4 у животных, получавших L-NAME.
Таким образом, для дальнейшей оценки влияния АХ и НП при ЭЗВД и ЭНВД нами использовано это отношение, как показатель коррекции эндотелиальной дисфункции. Так, в группе, где на фоне введения L-NAME вводился рекомбинантный эритропоэтин, это отношение соответствовало значению 1,8±0,2 (рис. 3.22, табл. 3.6).
Таким образом, в результате проведенных исследований обнаружено выраженное эндотелиопротективное действие рекомбинантного эритропоэтина на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.
При переводе животных на управляемое дыхание обнаружено, что исходные показатели сократимости левого желудочка у животных, получавших рекомбинантный эритропоэтин, имели наиболее близкие значения к интактным животным (табл. 3.7).
Для оценки функциональных возможностей миокарда на фоне использования рекомбинантного эритропоэтина у животных с моделированием L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота проводились нагрузочные пробы (рис. 3.22, 3.24, табл. 3.8).
Проба на адренореактивность. Как представлено на рисунке 3.23, применение рекомбинантного эритропоэтина не только полностью предотвращало повышение адренореактивности у животных с моделированием L-NAME-индуцированной патологии, но и снижало абсолютные цифры ЛЖД на пробе с введением адреналина. Так, в группе L-NAME + эритропоэтин ЛЖД составило 198,3±15,1, L-NAME - 247,3±4,8, а у интактных 199,2±8,3 мм рт. ст.
При проведении пробы на нагрузку сопротивлением (рис. 3.23) применение рекомбинантного эритропоэтина привело к предотвращению падения показателя исчерпания миокардиального резерва. Как видно на рисунке 3.24, значение прироста ЛЖД от 5 к 25 секунде пережатия восходящей аорты в группе с моделированием L-NAME-индуцированного дефицита N0 составило 66,0%. У интактных животных - 82,7%, при введении эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг - 84,1%. Последнее указывает на сохранение значительного сократительного резерва у животных, которым вводили рекомбинантный эритропоэтин в субэритростимулирующей дозе.
![Применение адреноблокаторов у больных Q инфарктом миокарда и их влияние на эндотелиальную дисфункцию [Электронный ресурс]](/i/i/4297/179746.png "Применение адреноблокаторов у больных Q инфарктом миокарда и их влияние на эндотелиальную дисфункцию [Электронный ресурс] Яковлева Мария Сергеевна")
