Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Современные представления о патогенезе артериальной гипертензии 10
1.1.1 Роль N0 в нейрогенном механизме регуляции артериального давления 13
1.1.2 Значение NO в гуморальном механизме регуляции артериального давления 19
1.1.3 NO-зависимые сосудистые механизмы регуляции артериального давления 25
1.2 Подходы к фармакотерапии артериальной гипертензии 31
Глава 2. Объем, материалы и методы исследования
2.1 Экспериментальная модель нефрогенной гипертензии 43
2.2 Протокол экспериментального исследования 43
2.3 Общеморфологические методы исследования 44
2.4 Метод гистохимического выявления NADPH -диафоразы 44
2.5 Морфометрическая обработка данных 46
2.6 Статистическая обработка данных 47
Глава 3. Экспериментальная модель нефрогенной гипертензии
Глава 4. Характеристика NO-ергических систем в норме и при развитии артериальной гипертензии 45
4.1 NO-ергическая функция гипоталамуса 52
4.2 Состояние NO-ергической функции продолговатого мозга. Ядро солитарного тракта, дорсальное ядро и п. ambiguous. 62
4.3 Изменение NADPH - диафоразы в эндотелии сосудов мышечного типа (внутренней сонной и базиллярной артерий) и эластического (аорты) типа 68
4.4 Динамика NO-ергической функции нейронов мозгового вещества надпочечников 70
Глава 5. NO - продуцирующая функция органов и тканей животных при коррекции экспериментальной артериальной гипертензии препаратами различных фармакологических групп
5.1 Изменение NO - ергической функции гипоталамуса при коррекции артериальной гипертензии иАПФ (эналаприлат), (3-блокатором (пропранолол) и блокатором кальциевых каналов (верапамил) 76
5.2 Коррекция NO - ергической функции нейронов продолговатого мозга при коррекции артериальной гипертензии гипотензивными препаратами 85
5.3 Динамика активности NADPH - диафоразы в эндотелии сосудов мышечного и эластического типа при коррекции артериальной гипертензии иАПФ (эналаприлат), Р-блокатором (пропранолол) и блокатором кальциевых каналов (верапамил) 91
5.4 Изменение активности NO-ергической функции нейронов мозгового вещества надпочечников при коррекции артериальной гипертензии иАПФ (эналаприлат), Р-блокатором (пропранолол) и блокатором кальциевых каналов (верапамил) 96
Заключение 99
Выводы 114
Список литературы 116
- Значение NO в гуморальном механизме регуляции артериального давления
- Метод гистохимического выявления NADPH -диафоразы
- Изменение NADPH - диафоразы в эндотелии сосудов мышечного типа (внутренней сонной и базиллярной артерий) и эластического (аорты) типа
- Коррекция NO - ергической функции нейронов продолговатого мозга при коррекции артериальной гипертензии гипотензивными препаратами
Введение к работе
Важнейшими патогенетическими звеньями в развитии артериальной гипертензии (АГ) являются увеличение активности симпато-адреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем, а также дисбаланс эндотелиозависимых механизмов (Шляхто Е.В., Конради А.О., 2003; Paul. L Huang., 2000; Rahn K.Y., 2000). Избыточная активность ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РАСС) приводит не только к задержке натрия и воды в организме, но и к изменениям органов-мишеней - сердца, почек, мозга и периферических сосудов (Манухина Е.Б., 2002; Guyenet G.,2006).
Открытие молекулы оксида азота (NO) позволило по-новому взглянуть на механизмы патогенеза АГ и наметить новые мишени фармакологического действия гипотензивных препаратов. Выявление роли NO в нейрогенной, гуморальной и эндотелиальной регуляции артериального давления (АД) открыло широкие перспективы для разработки новых подходов к фармакологической коррекции гипертензивного синдрома (Дупляков Д.В., Емельяненко В.М., 2001; Моисеева ОМ. и соавт., 2003; Покровский В.И., Виноградов В.А., 2005). Известно, что взаимодействие симпато-адреналовой и NO-ергической систем на разных уровнях нейро-эндокринного контроля АД имеет специфические черты и может проявляться развитием как антагонистических, так и синергических модулирующих эффектов (Shaohua Ye et al., 1997; 2006). Взаимомодулирующие отношения между РААС и системой синтеза NO имеют свои особенности в зависимости уровня их реализации, стадии развития гипертонической болезни и характера проводимой лекарственной терапии.
Изученные к настоящему времени эффекты NO-зависимой модуляции АД и фармакологического действия антигипертензивных средств ограничивается изучением регулирующего влияния NO на эндотелиальные механизмы регуляции сосудистого тонуса (Соболева Г.Н. и соавт., 2001; Галявич А.С, 2007). Кроме того, в доступных источниках представлены данные об NO-зависимых механизмах действия лишь некоторых гипотензивных препаратов (Галявич А.С, 2007). В этой связи детальное исследование NO-ергических процессов, протекающих на различных уровнях функциональной системы регуляции АД при его эндогенных и фармакологически индуцированных сдвигах, считается весьма актуальным, поскольку позволит выявить новые
патогенетические механизмы формирования гипертензивного синдрома и возможные мишени его лекарственной терапии. Кроме того, выявление NO-модулирующего компонента в спектре фармакологических эффектов известных антигипертензивных препаратов позволит объяснить некоторые особенности реализации их основных и побочных эффектов, а также наметить пути усовершенствования их химического состава путем включения селективных NO-модулирующих компонентов.
Цель исследования: определить значение нитроксидергического механизма в реализации фармакологических эффектов ингибитора ангиотензинпревращающего фермента (иАПФ), Р-адреноблокатора и блокатора кальциевых каналов при экспериментальной нефрогенной гипертензии.
Задачи исследования:
1. Установить гистохимическую локализацию NADPH - диафоразы (NADPH-d)
в ядрах гипоталамуса и продолговатого мозга, сосудах мышечного (внутренней
сонной и базиллярной артерий) и эластического (аорты) типа, нейронах
мозгового вещества надпочечников в условиях физиологической нормы и при
экспериментальной нефрогенной гипертензии.
2. Изучить характер изменений NO-ергической активности в указанных
клеточных элементах животных с экспериментальной нефрогенной
гипертензией под действием Р-адреноблокатора.
3. Определить активность NADPH-d в указанных структурах
экспериментальных животных под действием ингибитора АПФ.
4. Установить динамику NO-ергической активности в ядрах гипоталамуса и
продолговатого мозга, сосудах мышечного и эластического типа, нейронах
мозгового вещества надпочечников под влиянием блокатора кальциевых
каналов.
5. Обосновать значение центральных и периферических NO-ергических
механизмов в реализации фармакологических эффектов гипотензивных
препаратов при экспериментальной нефрогенной гипертензии.
Научная новизна
В условиях моделирования экспериментальной нефрогенной гипертензии у лабораторных животных установлена гистохимическая локализация NADPH-d и проведено гистохимическое исследование динамики активности фермента синтеза NO в центральных и периферических структурах, причастных к регуляции сердечно-сосудистой системы. Показано, что формирование АГ,
инициированное химической деструкцией части почечной паренхимы, сопровождается динамическими и селективными изменениями NO-ергической активности нейронов гипоталамуса, продолговатого мозга, мозгового вещества надпочечников, эндотелиальных клеток сосудов. Установлено NO-модулирующее действие антигипертензивных препаратов из группы ингибиторов АПФ, Р-адреноблокаторов и блокаторов кальциевых каналов. Полученные данные позволяют уточнить роль центральных и периферических NO-ергических механизмов в патогенезе нефрогенной гипертензии и значение NO в реализации фармакологических эффектов гипотензивных препаратов указанных групп.
Теоретическая и практическая значимость работы
В ходе работы получены новые факты, расширяющие представление о нейрохимических механизмах регуляции артериального давления. Показано значение центральных и периферических NO-зависимых механизмов в динамике развития экспериментального гипертензивного синдрома. Полученные в эксперименте данные о влиянии ингибиторов АПФ, Р-адреноблокаторов и блокаторов кальциевых каналов на NO-ергическую активность нейронов вазомоторных центров головного мозга, эндотелиальных клеток сосудов мышечного и эластического типа, нейронов мозгового вещества надпочечников позволяют обосновать значение NO-ергического механизма в реализации центральных и периферических эффектов гипотензивных препаратов, а также разработать патогенетические обоснованные подходы к коррекции нарушений АД.
Полученные в ходе работы данные используются в лекционном курсе и в материалах практических занятий на кафедрах общей и клинической фармакологии, гистологии, патологической физиологии и при базовой и последипломной подготовке врачей.
Положения, выносимые на защиту:
Регуляция артериального давления в условиях нефрогенной экспериментальной гипертензии обеспечивается центральными и периферическими NO-ергическими механизмами.
Фармакодинамические эффекты пропранолола, эналаприлата и верапамила в условиях экспериментальной артериальной гипертензии являются NO-зависимыми и реализуются как на уровне периферической, так и центральной регуляции.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2007, 2008, 2009, 2010); Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, сентябрь 2007, 2008, 2009, 2010); XVI и XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2009, 2010); обществе Специалистов по клинической фармакологии Приморского края (Владивосток, ноябрь 2010).
Материалы диссертации были доложены и обсуждены на заседании проблемной комиссии по морфологии, физиологии и биохимии и по фармакологии, клинической фармакологии и фармации. По результатам обсуждения диссертация была рекомендована к защите.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе в журналах, рекомендованные ВАК для публикации основных результатов диссертационных исследований: «Тихоокеанский медицинский журнал», Бюллетень Сибирского отделения РАМН.
Личный вклад
Автор участвовал в планировании, постановке цели и задач исследования. Подбор и анализ литературы, проведение экспериментов, статистическая обработка экспериментальных данных и их анализ осуществлялись непосредственно соискателем.
Структура и объем диссертации
Значение NO в гуморальном механизме регуляции артериального давления
В настоящее время доказано [195], что в патогенезе АГ большое значение имеет повышение активности симпатической нервной системы. Повышение тонуса симпатической нервной системы применительно к регуляции кровообращения может быть обусловлено только усилением активности центральных механизмов [105].
Известна роль высших вегетативных центров, локализованных в лимбико-ретикулярном комплексе, и симпатического отдела вегетативной нервной системы в развитии АГ [91, 212]. Согласно данным исследований, регуляторным комплексом, координирующим гомеостаз в состоянии покоя, при стрессе, а также в регуляции АД является гипоталамус и продолговатый мозг [101, 115, 149].
В гипоталамусе локализуются ядра (паравентрикулярное, супраоптическое), которые участвуют в регуляции АД и содержат следующие группы нейронов: - нейроны мелкоклеточной зоны паравентрикулярного ядра гипоталамуса, синтезирующие кортикортопин-релизинг-фактор (КРФ), который регулирует деятельность передней доли гипофиза. Он по аксонам достигает срединного возвышения дна III желудочка, откуда выделяется в кровоток и действует на высокоаффинные рецепторы типа 1 на АКТГ-продуцирующих клетках гипофиза [189]. КРФ-синтезирующие клетки могут встречаться в любом отделе гипоталамуса, но максимальное их скопление расположено вдоль стенок III желудочка. Здесь они входят в состав паравентрикулярного ядра и образуют его мелкоклеточную (дорсо-медиальную) часть, тогда как в венгро-латеральной зоне группируются крупные эндокриноциты. В нейронах гипоталамуса N0 и КРФ солокализованы [224] и активность местных NO-ергических механизмов регулирует уровень продукции релизинг-гормона [214].
Нейроны, высвобождающие гипофизо-тропные гормоны, рассеяны по различным гипоталамическим ядрам и в силу нейрохимического устройства и особенностей связей каждого из них, могут функционировать относительно независимо. Но поступление продуктов их нейроэндокринной деятельности к аденогипофизу осуществляется синхронно и достаточно ритмично. Это достигается за счет особого устройства портальной системы срединного возвышения III желудочка, куда направляют свои пептид-содержащие отростки нейроциты гипоталамуса.
Работа этого органа в значительной степени определяется активностью его NO-продуцирующих систем. В туберо-инфундибулярной системе NO регулирует секрецию гипофизарных релизинг-факторов. Хроническое ингибирование синтеза NO сопровождается дефицитом кортико-тропинов в нейросекреторных терминалях наружного капиллярного слоя срединного возвышения, что влечет за собой снижение выработки соответствующего гормонов в передней доле гипофиза [128]. В нейросекреторных терминалях NO воздействует на гуанилатциклазу или циклооксигеназу. Образующийся ц-ГМФ изменяет мембранный потенциал нейроэндокринных терминалей и мобилизует выброс гормона, а простагландин Е2 влияет на экзоцитоз пептидных гранул за счет мобилизации ионов Caz . - нейроны крупноклеточной зоны паравентрикулярного и супраоптического ядра гипоталамуса - вырабатывают гормон аргинин - вазопрессин и окситоцин. Вазопрессин и окситоцин, вырабатываемые крупноклеточными ядрами гипоталамуса, помимо участия в водно-солевом гомеостазе, регуляции уровня кровяного давления и контроля репродуктивной функции, интегрируют работу стрессовой оси за счет влияния на ее кортикотропную активность [152, 158].
Благодаря методам нейроиммуноморфологии, было показано, что у умерших больных, страдающих АГ, в супрахиазматическом ядре гипоталамуса уменьшается синтез вазопрессина, в паравентрикулярном ядре увеличивается выработка КРГ, а в промежуточном мозге уменьшается синтез NO [99].
Продолговатый мозг также играет важную роль в регуляции гемодинамики, ядра, которого участвуют в формировании бульбарного вазомоторного центра. Вазомоторный центр занимает обширную область продолговатого мозга, простираясь в дорсолатеральном направлении от дна IV желудочка до пирамид. В составе этого центра находится чувствительное ядро одиночного пути, состоящее из мелких и средних нейронов, с которых импульсы передаются и на двигательные ядра (гигантоклеточное, мелкоклеточное, центральное и околоцентральное) [105, 161].
Первыми исследованиями, доказавшими, что тонус сосудов и деятельность сердца зависят от активности нейронов, локализованных в области каудальных отделов мозгового ствола, явились эксперименты Ф. В. Овсянникова (1871). Перерезка спинного мозга на уровне шейных позвонков вызывает у спинальных животных резкое снижение сосудистого тонуса и нарушение регуляторных реакций, связанных с изменением просвета вен и артерий.
Высказывается предположение [166], что повышенная активность бульбарного вазомоторного центра при АГ связана с активацией преганглионарных симпатических нейронов спинного мозга, обеспечивая тем самым вазоконстрикторный эффект [104, 105]. В составе бульбарного отдела сосудодвигательного центра есть прессорные и депрессорные нейроны. Прессорная зона расположена в ростральном отделе, депрессорная зона - в каудальном отделе. Локальная стимуляция ростральных частей сосудодвигательного центра вызывает увеличение сосудистого тонуса, повышение кровяного давления и тахикардию. Стимуляция каудального отдела сосудистого центра, напротив, вызывает расширение сосудов, падение кровяного давления и брадикардию. Большое количество катехоламинсодержащих нейронов расположено в области ядра солитарного тракта - области, где локализованы нейроны, являющиеся вторичными афферентными нейронами барорефлекторной дуги [60, 104, 105, 115]. Имуноцитохимическими методами доказано, что часть из этих нейронов содержит адреналин. Ядра солитарного тракта контролируют многие сердечно-сосудистые, дыхательные и нейроэндокринные функции [143, 204, 221].
Метод гистохимического выявления NADPH -диафоразы
Экспериментальная часть исследования выполнена на 90 здоровых белых нелинейных крысах-самцах, массой 200-220 грамм. Исследование животных проводили в соответствии с Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977г.) и Стандарта отрасли "Правила проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации" ОСТ 42-511-99 (утв. Минздравом РФ 29.12. 1998г.). Животных содержали в виварии в соответствии с "Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» (от 6.04.1993г.), кормили в соответствии с нормами, утвержденными МЗ СССР от 10.03.1996г.№ 163.
Учитывая этический аспект производимого экспериментального исследования, мы пытались максимально сократить количество используемых в эксперименте животных, оставаясь в рамках статистически репрезентативной группы (по 5 животных в каждой экспериментальной точке). Все крысы были разделены на 4 экспериментальные группы по 20 в каждой.
В 1 экспериментальную группу были включены животные (группа АГ), не получавшие лекарственных препаратов. Начиная с 28 дня после операции, животным 2-4 групп проводили фармакологическую коррекцию: 2 группе ежедневно внутримышечно вводили препарат из группы неселективных Р" адреноблокаторов пропранолол (2 мг/кг, группа АГ+пропранолол), 3 группе внутрибрюшинно вводили ингибитор АПФ эналаприлат (0,3 мг/кг/6 часов, группа АГ+эналаприлат), 4 группе вводили внутримышечно блокатор кальциевых каналов верапамил (0,1 мг/кг, группа АГ+верапамил). Животных выводили из эксперимента на 7, 14, 28 и 42 сутки после начала фармакологической коррекции (по 5 крыс в каждой точке). Контролем служили животные сходного возраста, не подвергавшиеся фармакологическим и оперативным воздействиям (п=5). В качестве второго контроля использовались 5 ложнооперированных крыс, которым аналогичным способом в почки вводили физиологический раствор. Наблюдение за последней группой животных осуществлялось в течение 1 послеоперационной недели. Дальнейшего наблюдения они не требовали, поскольку гистохимический анализ их тканей, а также показатели артериального давления не отличались от таковых в интактной контрольной группе.
Эвтаназию животных проводили путем декапитации на фоне эфирного наркоза. Согласно поставленным задачам, изучение гистохимической активности NADPH-диафоразы проводилось на серийных срезах гипоталамуса и продолговатого мозга, мозгового вещества надпочечников и в сосудах мышечного и эластического типа. Исследуемый материал тотчас после извлечения 4 часа фиксировали в 4% забуференном растворе параформальдегида и обрабатывали для последующего общеморфологического и гистохимического исследования.
Для идентификации общего количества нейронов в исследуемых участках мозга и надпочечников использовалась окраска по Нисслю. Для этого каждый шестой срез, получаемый при изготовлении серии для проведения гистохимической реакции, окрашивали в 1% растворе толлуидинового синего, после чего срезы обезвоживали в спиртах и заключали в бальзам по традиционной прописи.
Изучение морфологического состояния паренхимы почек в месте инъекции формалина (с целью верификации точности инъекции) проводилось на срезах, окрашенных гематоксилином-эозином.
В своих исследованиях мы использовали метод на NADPH-диафоразу (NADPH-d), предложенный Hope, Vincent (1989), который основан на образовании нерастворимого осадка диформазана в присутствии экзогенного субстрата - нитросинего тетразолия (НСТ) и косубстрата - NADPH. Диафоразная активность лежит в основе гистохимической реакции, выявляющей локализацию NO-синтазы. В исследованиях Furukawa et al., 1995, Bassoulett et al., 1996, показано, что NADPH-диафораза солокализована со всеми тремя известными изоформами NOS - нейрональной, эндотелиальной и индуцибельной. В связи с этим реакция на NADPH-диафоразу позволяет судить о гистохимической локализации NOS. При исследовании нервной ткани метод на NADPH-d позволяет диагностировать морфологический тип нейронов за счет выявления тел и отростков [151].
В NO-продуцирующий тканевых элементах активность NADPH-диафоразы и NO-синтазы изменяется синхронно и однонаправлено, поэтому, плотность образующегося в результате гистохимической реакции диформазанового преципитата прямо пропорциональна молекулярной концентрации NOS, что позволяет не только установить ее гистохимическую локализацию, но и судить об активности фермента.
Исследуемый материал в течение 4 часов фиксировали в охлажденном, приготовленный на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) 4% растворе параформальдегида; затем сутки промывали при той же температуре в 30% забуферном растворе сахарозы. Из замороженных в криостате образцов изготавливали срезы аорты, магистральных сосудов, надпочечника (толщиной 25 мкм), срезы продолговатого мозга и гипоталамуса (толщиной 50 мкм), которые монтировали на предметные стекла. Высушенные срезы помещали в среду, состав и конечная концентрация которой были следующими: 50Мм трис-буфер (рН 8,0), 1 мМ NADPH («Sigma», США), 0,5 мМ нитросинего тетразолия («Sigma», США), и 0,2 % тритон X - 100 («ISN», США). Инкубацию проводили в течение 30 мин для срезов надпочечников и 1 час для остальных срезов при температуре 37С, после чего срезы ополаскивали в дистиллированной воде, обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам.
Изменение NADPH - диафоразы в эндотелии сосудов мышечного типа (внутренней сонной и базиллярной артерий) и эластического (аорты) типа
Заднее ядро блуждающего нерва, nucl. dorsalis nervi vagi, является основным моторным центром вагуса. Его холинергические нейроны находятся под мощным аутокринным влиянием NO, и модулируются NO-ергической активностью соседних клеток ядра солитарного тракта.
При реакции на NADPH-диафоразу в каудальной части заднего ядра блуждающего нерва в контрольной группе животных обнаружены крупные нейроны округлой формы, со средней степенью активности фермента 77,78±2,1 ЕОП. Это составляет 16% от общего числа нейронов.
Большинство же клеток каудальной части ядра выявлялись за счет неспецифического осаждения диформазана на их поверхности. Нейропиль умеренно прокрашен. Эти гистохимические особенности позволяли отчетливо дифференцировать заднее ядро блуждающего нерва от нейронов лежащего рядом ядра солитарного тракта. По мере приближения к ростральному полюсу становился более интенсивно окрашенным нейропиль; многочисленные округлые клетки, лежащие в его петлях, так же приобретали интенсивную окраску.
При формировании экспериментальной нефрогенной гипертензии (группа АГ) динамика активности NADPH-d проявлялась как в изменении числа позитивных нейронов, так и показателей их гистохимической активности. Наиболее выраженные изменения в состоянии фермента регистрировались к концу 1-ой неделе эксперимента. В этот период у животных группы АГ происходило статистически достоверное (р 0,001) уменьшение активности NADPH-диафоразы в 1,5 раза и уменьшение числа NADPH-d-позитивных нейронов в 2,5 раза, по сравнению с контрольной группой животных. Начиная со 2-й недели, число NADPH-d-позитивных нейронов постепенно увеличивалось. Максимальных значений количества NADPH-d-позитивных нейронов и показатели оптической плотности NADPH-диафоразы достигли к 6-ой неделе и составляли 5±0,3 и 127,68±3,98 ЕОП соответственно (рис. 13). Параллельно с этим у экспериментальных животных были зафиксированы стабильно высокие показатели системного систолического АД - до 180 мм.рт.ст.
Иммуногистохимические исследования свидетельствуют о том, что в эндотелии сосудов мышечного типа (внутренней сонной и базиллярной артерий), а также сосудов эластичного типа (аорты) реакция на диафоразу в норме выявляет конститутивную эндотелиальную NO-синтазу (eNOS) [180]. В физиологических условиях NO, синтезируемый конститутивной eNOS, участвует в поддержании адекватной вазодилатации, регуляции местного кровотока, предотвращении агрегации и адгезии тромбоцитов и эритроцитов, образования тромбов и сладжей.
В контрольной группе животных активность NADPH-d в эндотелиоцитах сосудов была расценена как высокая, - поскольку достигала во внутренней сонной артерии - 95,72±4,7; базиллярной артерии - 90,85±4,09; аорте - 81,8±2,4 ЕОП соответственно. При гистохимической идентификации диафоразы со стороны просвета сосуда формируется кольцо голубого, синего или ярко-фиолетового цвета, соответствующее локализации эндотелия (рис. 15 А). Интенсивность окраски эндотелиальных клеток свидетельствует о степени активности как NADPH-диафоразы, так и солокализованной NO-синтазы.
Развитие экспериментальной нефрогенной гипертензии сопровождалось выраженными изменениями NO-ергической функции эндотелия. С первой недели эксперимента в эндотелии сосудов мышечного типа головного мозга мы отметили следующие изменения состояния фермента: возникающая с 1 недели тенденция к снижению ферментативной активности NADPH-диафоразы сохранялась на протяжении всего срока наблюдения. Максимально низких значений показатели оптической плотности NADPH-диафоразы в эндотелиоцитах внутренней сонной и базиллярной артерий достигли на 6-ой неделе развития экспериментальной гипертензии и составляли 58,6±2,7 и 55,68±3,51 ЕОП соответственно (рис. 14; рис.15 Б).
В сосудах эластичного типа (аорте) достоверные изменения состояния фермента наблюдались лишь к 4 неделе развития экспериментальной гипертензии. Последующее стабильное снижение активности фермента приводило к двукратному снижению NO-ергической активности эндотелия - до 46,8±2,08 (ЕОП) (рис. 14). Таким образом, при развитии экспериментальной нефрогенной гипертензии у животных наблюдалось угнетение NO-продуцирующей функции в эндотелиоцитах сосудов.
В мозговом веществе надпочечников контрольных животных методом на NADPH-диафоразу выявлялась небольшая популяция нервных клеток, одиночные или сгруппированные в пучки нервные волокна, единичные хромаффиноциты мозгового вещества, а также фрагменты микроциркуляторного русла. Нейроны отличались от диафораза-позитивных хромаффинных клеток значительно более высоким уровнем гистохимической активности и мультиполярной формой клеточных тел, от которых отходили 2-5 первичных отростка. Плотность расположения нейронов в срезе площадью 5 мм2 достигала 2,88±0,21, что составляло 72% от общего числа нейронов, окрашенных по Нисслю. Гистохимическая активность диафораза-позитивных клеток 101,88±2,1ЕОП (рис. 16; рис. 17 А).
При формировании экспериментальной нефрогенной гипертензии (группа АГ) динамика активности NADPH-d носила фазовый характер и проявлялась как в изменении числа позитивных нейронов, так и показателей их гистохимической активности. Наиболее выраженные изменения в состоянии фермента регистрировались к концу 1 недели эксперимента. В этот период у животных группы АГ происходило статистически достоверное (р 0,001) повышение активности NADPH-диафоразы до 136,9±2,6ЕОП и увеличение числа NADPH-d-позитивных нейронов до 3,8±0,33 (до 95% от общего числа нейронов) (рис. 16). Нейроны были интенсивно окрашены, расположены по всему мозговому веществу надпочечников. Усиление активности фермента в нейронах сопровождалось и активацией биосинтетических процессов в их отростках, которые в мозговом веществе животных с АГ формировали густую фибриллярную сеть.
Коррекция NO - ергической функции нейронов продолговатого мозга при коррекции артериальной гипертензии гипотензивными препаратами
Многочисленные клинические и экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что использованные в нашей работе препараты не только эффективно снижают и контролируют уровень АД, но и оказывают благоприятное воздействие на состояние органов-мишеней: миокард, сосуды, почки [36, 62, 72, 80, 81]. В основе этого эффекта лежит способность препаратов восстанавливать баланс между двумя вазоактивными системами — ангиотензина II и N0.
В нашем исследовании показано, что в разной степени модулирующее влияние на сниженную при гипертензии NO-ергическую функцию эндотелия присуще всем изученным препаратам. При коррекции экспериментальной АГ максимальный эффект в отношении NO-продуцирующей активности эндотелия сосудов мышечного типа (внутренней сонной и базиллярной артерих) был отмечен у эналаприлата и верапамила. Нормализация NO-ергической функции эндотелия аорты успешно протекала при использовании всех препаратов.
До настоящего времени считалось, что способность иАПФ усиливать вазодилатирующие свойства сосудов связывают с их влиянием на функцию эндотелия, опосредованое брадикинином. Другим механизмом воздействия иАПФ на эндотелиальную функцию является блокада образования ангиотензина II (AT И), который рассматривается как индуктор оксидантного стресса. Экспериментально продемонстрировано увеличение образования активных форм кислорода (супероксид анион) под действием AT II. Механизмы действия AT II на продукцию супероксид аниона связаны со стимуляцией НАДФНУНАДН оксидаз. Таким образом, снижение AT II приводит к уменьшению оксидантного стресса, продукты которого снижают активность NO. Ангиотензин II во многом обладает противоположным действием по отношению к NO и в настоящее время признается практически его антагонистом. Ингибирование ангиотензинпревращающего фермента может восстанавливать баланс между двумя вазоактивнами системами -ангиотензина II и NO [36]. В нашем исследовании показано, что дополнительным эффектом иАПФ является нормализация NO-ергической функции эндотелия аорты и сосудов мышечного типа.
В экспериментальных и клинических исследованиях перспективными в коррекции дисфункции эндотелия оказались БКК, которые ограничивают сосудосуживающее влияние ангиотензин II и эндотелина - 1 путем уменьшения пула внутриклеточного Са2+ Были получены данные о том, что БКК дигидропиридинового ряда, такие как амлодипин, фелодипин улучшают эндотелийзависимую вазодилатацию за счет экспрессии NO [38, 67, 165, 219]. Считается, что основным механизмом увеличения NO на фоне применения БКК является их антиоксидантное действие, активности супероксиддисмутазы, уменьшение разрушения NO [38]. Полученные в нашей работе данные позволяют предположить, что верапамил, так же как БКК дигидропиридинового (амлодипин) ряда предотвращает реализацию феномена эндотелиальной дисфункции в эксперименте за счет нормализации синтеза NO эндотелиальными клеками.
Большое значение при патологии сердечнососудистой системы имеют изменения метаболической активности клубочковой и пучковой зон коры надпочечников, а также клеток хромаффинной ткани мозгового вещества. В совокупности эти элементы, а также модулирующие их неироэндокринные механизмы формировали сложную разветвленную систему регуляции АД.
В настоящей работе мы анализировали нитроксидергическую активность мозгового вещества надпочечников. Деятельность мозгового вещества надпочечников, секретирующего основное количество адреналина, находится под нейрогенным контролем со стороны центральной нервной системы и локальных интернейронов [128]. В нашем исследовании показано, что небольшая популяция NO-ергических медуллярных интернейронов достаточно активно реагируют на повышение АД и на проведение антигипертензивной терапии. Механизмы влияния NO на ткань мозгового вещества надпочечников при гипертензии и проведении гипотензивной терапии до настоящего времени остаются малоизученным и противоречивыми и касаются, в основном, анализа его ингибиторных [213], либо активирующих эффектов в моделях in vitro.
Наиболее выраженное торможение NO-ергической активности медуллярных интернейронов зафиксировано нами в мозговом веществе надпочечников. Введение экспериментальным животным лекарственных препаратов, сопровождаясь развитием гипотензивного эффекта, изменяло динамику биохимической реакции NO-ергических нейронов мозгового вещества надпочечников на развитие АГ. При этом NO-ергический "ответ" нейронов при использовании препаратов различных групп имел специфические черты, приводя к уменьшению числа NADPH-d-позитивных нейронов, их гистохимической активности или сочетанной реализацией обоих этих изменений. Все использованные в эксперименте средства из различных фармакологических групп ([3-адреноблокаторы, иАПФ и БКК) развивали антигипертензивное действие на фоне динамического, дифференцированого и селективного угнетения активности синтеза NO в этих клетках. Данные эффекты могут быть обусловлены спецификой функционирования внутриклеточных сигнальных каскадов в нервной ткани мозгового вещества надпочечников, или возникают вторично за счет изменения нейромедиаторного баланса в пресинаптических нервных цепях. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об участии центральных и периферических NO-ергических механизмов в реализации фармакологических эффектов пропранолола, эналаприлата и верапамила при эксперименальной нефрогенной гипертензии.
