Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Патогенетические механизмы развития нефро- и ангиопатий при сахарном диабете 12
1.2. Микроциркуляторные нарушения при сахарном диабете. Роль NO в их патогенезе:.\ 25
1.3. ПОЛ и АОЗ при сахарном диабете. Возможные пути коррекции нарушений 33
Глава 2. Материалы, методы и структура исследования 44
2.1. Материал и структура исследования 44
2.2. Методика воспроизведения аллоксанового диабета (АД) 45
2.3; Характеристика модели аллоксанового диабета 45
2.4. Патофизиологические методы исследований .'46
2.4.1. Исследование кровотока в магистральных сосудах - брюшной аорте (БА), нижней полой вене (НПВ), почечных артериях (ПА) и
микроциркуляторном звене 46
2.5. Исследование системы гемостаза 47
2.5.1. Метод электрокоагулографии 47
2.5.2. Исследование агрегации тромбоцитов 50
2.5.3. Агрегатография тромбоцитов 54
2.6. Биохимические методы исследований.' 55
2.6.1. Методика определения натрия и калия в моче и плазме крови. 55
2.6.2. Количественное определение креатинина в моче и плазме крови 57
2.6.3. Расчет показателей водо- и электролитовыделительной функции почек производили по формулам Ю.В.Наточина 57
2.6.4. Определение активности Na ,К -АТФ-азы в гомогенатах, митохондриальной и микросомальной фракциях коркового и мозгового вещества почечной ткани 58
2.6.5. Изучение степени переокисления в мембранах эритроцитов и в почечной ткани 59
2.6.6. Выделение эритроцитов и определение в них концентрации малонового диальдегида 59
2.6.7. Изучение состояния антиоксидантной системы (АОС) по активности каталазы (КФ 1:11:1:6) 60
2.6.8., Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) (КФ 1.15.1.11.) методом аутоокисления адреналина 61
Глава 3. Собственные данные 63
3.1. Состояние микро- и макрогемодинамики, системы гемостаза при экспериментальном сахарном диабете 63
Глава 4. Показатели функционального состояния почек при экспериментальном сахарном диабете 75
4.1. Изменения водо- и электролитовыделительной функции почек у крыс с аллоксановым диабетом 75
4.2. Состояние активности №+,К+-АТФазы в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани, митохондриальнои и микросомальнои фракциях при аллоксановом диабете 85
Глава 5. Перекисное окисление липидов и активность антиоксидантной системы при аллоксановом диабете 90
5.1. Перекисное окисление липидов при аллоксановом диабете 90
5:2. Состояние антиоксидантной системы защиты организма при аллоксановом диабете 95
Глава 6.. Изменение активности про- и антиоксидантных систем, показателей ДН, макро- и микрогемодинамики, и системы гемостаза* на фоне корригирующей терапии при экспериментальном сахарном диабете 98J
Заключение 113'
Общие выводы 128
Список литературы 130
Приложения 158
- Патогенетические механизмы развития нефро- и ангиопатий при сахарном диабете
- Характеристика модели аллоксанового диабета
- Состояние микро- и макрогемодинамики, системы гемостаза при экспериментальном сахарном диабете
- Изменения водо- и электролитовыделительной функции почек у крыс с аллоксановым диабетом
Введение к работе
Диабетическая ангио- и нефропатия являются не только частым осложнением СД, но и его интегральным патогенетическим звеном, частота и выраженность которого коррелирует с длительностью заболевания и степенью метаболических нарушений. Микроциркуляторные изменения носят органоспецифический характер и отмечаются в различных областях. Так, поданным Дедова И.И., Сунцова Ю.И., Кудряковой СВ. и др., 1997, из 82,7% обследованных больных СД, ретинопатия у 61,1%, нейропатия — 50,5%, диабетическая нефропатия - 28,2%. При экспериментальном» сахарном диабете отмечается нарушение кровоснабжения! нервов и уменьшение плотности сосудов (Schratzberger Р, Walker DH, Ritting К, Bahlmann FH et al 2001). Диабетическая нефропатия - одно из наиболее тяжелых последствий СД, снижающее качество и продолжительность жизни больных (Дедов И.И., Шестакова М.В., Бондарь И.А., Юїимонтов В.В., Королева Е.А. и др., 2003) и занимающее первое место среди других ангиопатий. Каждый второй больной СД типа 1 и каждый четвертый больной СД типа 2 умирает от острой и хронической почечной недостаточности (Сунцов Ю.И., 1998; Дедов И.И., 2003).
При экспериментальном сахарном диабете на ранних стадиях его развития и в клинике у больных отмечаются функциональные нарушения основных процессов- мочеобразования и почечного плазмотока, трансканальцевого транспорта электролитов и изменение ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), которая урегулирует секрецию альдостерона (Dj Loreto V, Moreno HS, Puche RC et al, 2004; AwadAS, Huang A, Ye H, Duoung ET, Bolton WK, Linden J, Okusa MD, 2005; Pfab T, Thone-Reineke C, Theilig F et al, 2006; Caden MP, Lautenslager OS, HIKLE et al, 2007; Hartner A, Cordasic N, Klanke В et al, 2007). Активация РААС и повышение в крови ангиотензина II сопровождается почечной гипертензией и клеточной пролиферацией (Hartner А, Cordasic N, Klanke В et al, 2007). У больных с диабетической нефропатией в доклинической стадии развития патологического процесса определяется увеличение систолической скорости кровотока на фоне повышения активности РААС. Нарушение кровотока и его неоднородность Карпов Р.С., Кошельская О. А., Ефимова Е.В. и др., 2001, рассматривают как один из допплерографических признаков начальной нефроантиопатии.
В развитии структурно-функциональных аномалий, лежащих в основе диабетических ангио- и нефропатий и ассоциированных с ними патологий (изменения свертывающей системы крови, артериальной гипертензии), участвует множество взаимосвязанных между собой процессов. Одним из таких нарушений является дисбаланс окислительно-восстановительных процессов и усиление неконтролируемых свободно-радикальных реакций (СРО), называемые окислительным стрессом (Baynes JW, 1991; Tesfamariam В, 1994; Van Damn PC, Van Asbeck BS, Erkelens, 1995).
Проявляются системные метаболические расстройства, характер и направленность которых позволяют предполагать, что повышение интенсивности СРО мембранных фосфолипидов, приводит к накоплению токсических продуктов окислительной деструкции липидов, изменению проницаемости сосудов вследствие дисфункции эндотелия, нарушению функциональной способности мембранных структур, активности мембранных ферментов клеточного метаболизма (Колесниченко Л.С., Мантарова Н.С., Шапиро Л.А., 1989; Гонский Я.И., Корда М.М., Клищ И.Н., Фира Л.С., 1996; Васильева О.В., Мобицкий О.Б., Клебанова Г.К., Владимиров Ю.А., 1998).
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) в мембранах тромбоцитов способствует повышению функциональной активности кровяных пластинок и освобождению тромбоцитарных факторов (Кретова Е.Ю., Кондратьев Е.И., Суханова Т.А., 2004; Токманова А.Ю., Староверова Д.Н., Анциферов М.Б., 2004; Remuzzi С et al, 1992; Natsumoto Н, Nakao Т, 2000). Воздействие длительной гипергликемии на эндотелиальные клетки приводит к увеличению продукции фибринолитических факторов, более активной агрегации тромбоцитов, спазму сосудов и повреждению эндотелия капилляров (Волкова А.К., Недосугова Л.В., Рудько И.А. и др., 2000; Кретова Е.Ю. и др., 2004; Kawamori R, Jmano Е, Watarai Т et al, 1994; Levin O Neal s, 2000). Эти данные подтверждают наличие у больных с диабетическими ангиопатиями перманентного внутрисосудистого свертывания крови с участием тромбоцитарного компонента гемостаза, что и определяет риск развития тромбозов (Бондарь Т.П., Муратова А.Ю., Пол-Тарабатько Н.П., 2004; Хаютина Т.Л., Балаболкин М.И., Коновалова Г.А. и-др., 2004).
Учитывая, важную роль в развитии диабетических ангиопатий окислительного стресса, необходимой составляющей патогенетической терапии является применение антиоксидантов (АО) (Кулагин О.Л., 2000; Кокорева Е.В., 2002; Yin X, Zhang Y, Yu J et al, 2006). Исследование ангиопротекторных эффектов препаратов АО у больных с диабетическими ангиопатиями свидетельствует о перспективности данного направления. (Бобырева ЛІЕ., 1997, 1998; Машков-Ю.И., 2001; Янькова В.И., Иванова И.Л., Федореев С.А., Кулеш Н.И., 2002; Чугунова Л.А., Шамхалова И.Ш., Шестакова М:В., 2004) и о повышении факторов АОЗ и угнетении процессов ПОЛ.
Наряду с общеизвестными АО — а-токоферол, а-липоевая кислота и др., в литературе имеются- данные об успешном использовании растительных экстрактов — фитоадаптогенов (Кулагин О.Л. и др., 2001; Янькова В.И. и др., 2002). Вместе с тем, отсутствуют исследования, посвященные изучению сопряженных систем СРО и факторов АОЗ клеток, обуславливающих нарушения макро- и микроциркуляции в периферических сосудах и структурах нефрона, сопровождающихся нарушениями в системе гемостаза, при экспериментальном сахарном диабете, а также патогенетическая их коррекция.
Актуальность настоящего исследования заключается в комплексном изучении патогенетических механизмов развития сосудистых осложнений СД, их корреляционных взаимоотношений на молекулярном, клеточном и органо-системном уровнях организации, что позволит экспериментально обосновать новые подходы к оптимизации лечения и профилактики диабетических ангиопатий.
Цель исследования: изучить патофизиологические и биохимические особенности нарушений взаимосвязанных систем СРО и ферментов АОЗ клеток, обуславливающих изменения макро- и микроциркуляции, системы гемостаза, активности мембраносвязанных ферментов почечной ткани и их роль в патогенезе диабетических ангиопатий. Обосновать новые методы коррекции нарушенных механизмов регуляции, повысить эффективность лечения и профилактики сосудистых осложнений СД в эксперименте.
Задачи исследования:
1. Исследовать характер изменений макро- и микрогемодинамики у крыс с экспериментальным сахарным диабетом допплерографически.
2. Изучить возможную роль изменений плазменного коагуляционного и тромбоцитарного гемостаза в сочетании с нарушениями тканевой перфузии в развитии экспериментальных диабетических ангиопатий.
3. Изучить при экспериментальном сахарном диабете нарушения стандартных молекулярно-клеточных механизмов оксидативного стресса: мембранных механизмов трансканальцевого транспорта ионов, роль перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиокислительной системы клеток (АОС) в патогенезе диабетических нефро- и ангиопатий.
4. Исследовать корреляционные взаимосвязи микроциркуляции, коагуляционных и биохимических метаболических нарушений при экспериментальном сахарном диабете, выделив зависимости, способствующие сосудистым осложнениям.
5. Используя новые знания патофизиологических и биохимических механизмов патогенеза диабетических ангиопатий, результатов корреляционного анализа, обосновать и разработать новые технологии профилактики и коррекции, используя современные антиоксиданты и мембранопротекторные вещества.
Научная новизна. Впервые использован комплексный подход к анализу механизмов развития экспериментальных диабетических нефро- и ангиопатий с применением корреляционного анализа. Выявлены новые звенья патогенеза, вскрыто участие нарушений метаболизма арахидоновой кислоты и АОС в нарушении эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов, макро- и микрогемодинамики, включая почечные артерии. Показана роль системных нарушений коагуляционного и тромбоцитарного гемостаза в развитии диабетических сосудистых осложнений. На основании этих знаний разработан новый методологический подход к коррекции- выявленных нарушений. Доказано положительное влияние антиоксидантов и мембранотропных веществ на состояние почечной и общей гемодинамики, активность мембранных ферментов почечных канальцев, а. также ПОЛ и АОЗ клеток при экспериментальном сахарном диабете.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты дают новые знания, углубляют и расширяют представления о патогенетических механизмах развития сосудистых осложнений сахарного диабета, обосновывают новую, более эффективную технологию коррекции системных нарушений с применением современных антиоксидантов, мембранотропных веществ- и фитоадаптогенов.
Практическая ценность результатов — в патофизиологическом обосновании нового методологического подхода к профилактике и лечению диабетических ангиопатий.
Основные положения выносимые на защиту.
1. При экспериментальном сахарном диабете развиваются нарушения микро-и макрогемодинамики, что приводит к ангиопатиям. Уменьшается-перфузия тканей (жидкостный обмен), снижаются средняя и систолическая скорости кровотока и повышается диастолическая скорость кровотока. Изменения гемодинамики в микроциркуляторном русле и магистральных сосудах (БА, почечные артерии) сопровождаются нарушениями коагуляционного и тромбоцитарного звеньев гемостаза и торможением системы фибринолиза.
2. Нарушаются водо- и электролито-выделительная функции почек, вследствие угнетения трансмембранного транспорта воды и электролитов. Снижение уровня канальцевой реабсорбции Na обусловлено падением активности №,К-АТФ-азы почечной ткани. 3. При экспериментальном сахарном диабете повышается интенсивность ПОЛ в гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани, изменяющее состояние липидного матрикса мембран клеток структур нефрона. Нарушается АОЗ клеток.
4. Коррекция нарушений ПОЛ и АОС клеток антиоксидантами в сочетании с мембранотропными веществами приводит к снижению степени выраженности диабетической нефропатии, нарушений гемодинамики и системы гемостаза.
Апробация диссертации. Материалы диссертации докладывались на: 61-ой межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Владикавказ, 2006); научно-практической конференции южного Федерального округа с международным участием «Экстремальная медицина. Проблемы экстремальньж состояний» (Владикавказ, 2006); научной конференции молодых ученых СОГМА) (Владикавказ, 2007); IV региональной научно-практической.? конференции «Новые технологии в рекреации здоровья населения» (Владикавказ, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе в рекомендованном ВАК РФ рецензируемом журнале // «Вестник новых медицинских технологий», т. 15, №1, 2008, с.40-41. •
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 150 страницах, включая! библиографию. Состоит из введения; обзора литературы, описания материалов и методов, исследования; четырех глaв изложения результатов исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, общих выводов и списка использованной литературы и приложений. Библиографический указатель включает 242 источника литературы, из них 155 отечественных и 87 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 13 таблицами.
Патогенетические механизмы развития нефро- и ангиопатий при сахарном диабете
В последние два десятилетия в литературе накоплен значительный экспериментальный и клинический материал, свидетельствующий о роли свободных радикалов в патогенезе многих заболеваний, в том числе, диабетических ангиопатий (Биленко М:В:, 1989; Рябов 17.А., Пасечник WR., Азизов;ЮМ:, 1991; Абдрашитова НіФ:,.ФархутдиновУ.Р:, Гибитова ДїМІ и= др., 1996; Смирнов А\В1, Криворученко Б.И!, Зарубина И:В:, Калинкам Е.А.,. 1996; Бобырева,ЛІЕ, 1997, 1998; Ефимов, А.Є., 1989; Кондратьев/ Я;Ю: и соавт., 1998; Мазуров В!И;, Столов С.ВЇ, Линецкая Н.Зі, Балдуева И.А., 2001; Слепова 0:С, Герасименко BUT., Захарова ККЭ , Новикова-Билак Т.Иі, 200І; СалтыковгБ.Б., ПауковВ.С, 2002; Князева!ЛіА.,.2005; GrangerDN-.Hbllwarthj ME, Parks DA, 1986; Halliwell B; 1987; De Groot H, Eittauer Av 1989;: Zimmermam В J;. Ganger DN, 1994). Результаты, многих исследований- и, в частности, DCCT (The diabetes control and Complication . Triot) свидетельствуют о» том, что гипергликемия является одной из основных причин развития? поздних сосудистых, осложнений диабета. Хроническая гипергликемияї инициирует развитие изменений;; в сосудистой стенке с помощью нескольких механизмов:: путем активации полиолового пути метаболизма глюкозы, гликозилированияі различных, белков, усиления биосинтеза компонентов-, в базальноюмембране эндотелиальных клеток (CaglieroE., Roth Т., Roy SLet.al;. 1991), окислительного стресса (Балаболкин М:И;, Клебанова- Е:М., 2000; Токмакова: АЛО., Староверова ЩШ, 2005; Гарагон С.Фі, 2005; Кондратьев Я:Ю: и соавт., 1998; ДедовИ:И:, Шестакова МІВ;, 2003):
Процессы ПОЛ представляют собой цепную реакцию и включают инициирование, удлинение, разветвление, обрыв цепей окисления. Основная роль в инициировании перекисных реакций принадлежит активным формам кислорода (АФК), таким как супероксидный ион-радикал, гидроксильный радикал, синглетный кислород, пероксид водорода.
Свободно-радикальное окисление липидов является неотъемлемой частью многих жизненно важных процессов, таких как перенос электронов флавиновыми ферментами, обновление состава липидов; биомембран; окислительное . фосфорилирование ВІ митохондриях, деструкция ксенобиотиков, в ЭЙР; фагоцитоз (Василенко В:Х., Фельдман СБ., Хитров И:К., 1989;: Оборин A.Hv 1995; Маянскийі АН:, Маянский Д.Н;, 1989;: HalliwelllB 1989; Torrielli MV, Dianzani MU, 1984): В ходе реакций свободно-радикального окисления1 образуются продукты,, являющиеся предшественниками; простагландинов, тромбоксанов и, простациклина,. лейкотриенов (БурлаковаЕ.Бг, ХраповаНІР., 1985; Halliwell В; 1989; MeadiJF, 1984): Изменение липидного состава цитоплазматических мембран является условием активности липид-зависимых мембраносвязанных ферментов, к которым» относятся многие ферментные системы-организма.
Вместе с тем, избыточное образование продуктов ПОЛ оказывает повреждающее действие на уровне клеток и сосудистого эндотелия.
Данные литературы, свидетельствуют о том что свободно-радикальное окисление (СРО) играет существенную роль в развитии ангио-, нефро- и. нейропатии при сахарном диабете (БиленкоМШ!,. 1989; Рябов-F. А., Пасечник И;Н., Азизов Ю.М!,; 1991;. Абдрашитова Н;Ф;, Фархутдинов У.Р., Еибитова Д:М: и др., 1996; Смирнов. А.В;, Криворученко Б:И1, Зарубина И.ВЇ, Калинка Е.А, 1996; Строков И.А., Смирнова В Ю , Мясоедов СИ., 1997; Halliwell В; 1987; De Groot Н, bittauerА, 1989; Granger BN, Kwientys PR, Perry MA, 1993; Zimmerman BJ- Ganger DN, 1994). Проблема сосудистых осложнений СД становится всё более актуальной, т.к. количество больных по данным экспертов ВОЗ ежегодно увеличивается на 5-7 %, а каждые 10-15 лет — удваивается (Дедов И.И., 1998; Северина А.С., Шестакова В., 2001; Аметов
A.C., 2002, Балаболкин М.И., 2002). Диабетическая нефропатия — одно из наиболее тяжелых последствий СД, снижающее качество и продолжительность жизни больных (Дедов И.И., Шестакова В., 2000, Бондарь И.А., Климентов В.В., Королева Е.А. и др.. 2003; Бондарь И.А., Климонов ВІВ:, 2005) и занимающее первое место среди других ангиопатии. Каждый второй больной СД типа 1 и каждый четвертый больной СД типа 2 умирает от острой или хронической почечной недостаточности (Дедов И.И., Сунцов Ю.И., Кудрякова СВ. и др., 1998; Дедов И.И., 2003). При СД нарушения- внутрипочечной гемодинамики могут наблюдаться при отсутствии клинико-лабораторных признаков поражения почек, что провоцируется гормонально-метаболическими нарушениями (Кутырина И.М., Тареева И.Е., Шестакова М.В., Зверев К.В., 1995).
В условиях гипергликемии глюкоза беспрепятственно проникает в эндотелиальные клетки сосудов- вызывая в них патологические биохимические реакции. Эндотелий уязвим: дляг воздействия как системной, так и внутриорганнои или тканевой гипертензии, развивающейся в микроциркуляторном русле. Все перечисленные факторы (гипергликемия, системная и внутрикапиллярная гипертензия, цитокины) могут вызывать глубокие повреждения эндотелиальных клеток сосудов при СД, провоцируя секрецию вазоактивных и гормональноактивных веществ, способных ускорять процессы диабетической ангиопатии (Шестакова М.В., Северина И.С., Дедов И.И: и др., 1995; Григорян О.Р., 2005; Григорян О.Р., Гродницкая Е.Э., 2005; Pfab Т, Thone-Reineke С, Theilig F et al, 2006).
Характеристика модели аллоксанового диабета
Животных брали- в опыт по окончании остротоксического периода действия аллоксана, т.е; спустя 14 дней с момента развития экспериментального сахарного- диабета. Исследования? проводили в хронической стадии аллоксанового диабета (АД)..
Эксперименты проводили в хронических; и: острых- опытах, в одно и тожевремя. суток; сезоны года — весной; осенью и зимой:
Для; исследования; водо-выделительной функции почек? т.е. спонтанного диуреза (в хронических экспериментах) животных помещали в обменные клетки. Мочу собирали в течение 6 часов. Опорожнение мочевого пузыря в конце эксперимента вызывали рефлекторно путем сжатия основания хвоста. В моче определяли концентрацию креатинина, натрия, калия.
Для определения в плазме крови вышеуказанных веществ (креатинина, натрия, калия) животных забивали с помощью гильотины (путем перерезки сонной артерии). Кровь забирали с применением гепарина.
Остальных животных использовали в острых опытах для исследования интенсивности процессов ПОЛ в. эритроцитах, в» клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани. Антиокислительную систему клеток определяли по активности ферментов СОД и каталазы. В другом варианте опытов изучали активность. Ыа,К-АТФазы в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани, а также в митохондриях и микросомах. Исследования проводили при АД средней тяжести — глюкоза от 10 до 20 ммоль/л. (2 гр).
Для изучения1 активности Na+,K+-ATOa3bi в гомогенатах почечной ткани крыс непосредственно перед началом исследования наркотизировали тиопенталом натрия, вводимым внутрибрюшинно в дозе 20 мг/ЮОг массы тела. Затем вскрывали брюшную полость и после наложения зажима на почечную артерию извлекали почки из забрюшинного пространства, которые помещали в ступки со льдом (t=+4C).
Для изучения ПОЛ и АОС клеток у животных под тиопенталовым наркозом- забирали- образцы крови из сердца, с использованием в качестве антикоагулянта 2,8% раствора ЭДТА, и ткани почек.
Изучали перфузию в различных точках локации тканей (жидкостный обмен) прозвучиванием датчиком 10 МГц , работающим по принципу «слепого» допплера ультрзвукового портативного допплерографа ММ-Д-Ф фирмы «Минимакс» СП(б) у наркотизированных животных. В качестве точек локации мы использовали 6 основных: Ткани слева и справа от основания хвоста - ХЛ и ХП; Область передних лап (правая передняя - ПП, и левая передняя - ЛП); Область задних лап (правая задняя - ПЗ, и левая задняя - ЛЗ). Кроме того, мы оценивали среднее значение для показателей МЦ по всем точкам перфузии, т.к. во всех интактных тканях должны происходить однонаправленные изменения. Исследовали характер кровотока в магистральных сосудах (БА - брюшной аорте, НПВ - нижней полой вене, ПА — почечных артериях справа и слева). Мы также оценивали среднее значение для показателей МЦ по артериям. Показатели МЦ: М - средняя скорость кровотока; S - систолическая скорость кровотока; D - диастолическая скорость кровотока; Pi - пульсаторный индекс (индекс Гослинга) - индекс пульсации, отражает упругоэластические свойства сосудов и меняется с возрастом; GD - градиент давления; Рассчитывали по формуле реографический индекс (Ri).
Состояние микро- и макрогемодинамики, системы гемостаза при экспериментальном сахарном диабете
Микро- и макроангиоп атии при сахарном диабете в настоящее время остаются главным осложнением, приводящим к инвалидизации пациентов за счет целого ряда нарушений функций жизненно-важных систем. Токсическое действие глюкозы на сосудистую стенку и форменные элементы крови приводит к« целому ряду нарушений микроциркуляции, реологических свойств крови и состояния гемостаза. Экспериментальные исследования и сегодня остаются одним из основных способов исследования, патогенеза ангиопатий, так как клинические наблюдения проходят на фоне использовании лекарственных средств, что не всегда позволяет адекватно оценить полученные результаты и разобраться в механизмах развития патологического процесса в конкретных случаях. Поэтому в данной главе мьь изучали развитие нарушений в сосудах микро- и макроциркуляторного русла, сопровождаемых изменениями в системе гемостаза.
Исследования проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 200-220 грамм, находящихся на стандартном пищевом рационе со свободным доступом к воде, и естественным световым режимом в зимний сезон года. Экспериментальный. сахарный диабет (ЭСД), характеризующийся инсулиновой недостаточностью (ИЗСД), вызывали путем подкожного введения 5% водного раствора аллоксана в дозе 150-180 мг/кг (Соколоверова И.М. 1962; Шестакова С.А. 1979). Аллоксановая интоксикация, повреждая (Р-клетки островков Лангерганса, уже через 48-72 часа характеризовалась повышением уровня сахара в крови (забор крови осуществляли из хвоста (микроколичество), и определяли уровень гликемии глюкооксидазным методом). Состояние микроциркуляции и изменения в системе гемостаза оценивали через 2 недели после начала введения аллоксана, когда у животных формировался хронический аллоксановый диабет, при этом уровень глюкозы крови был в среднем — 21,74±0,59 ммоль/л.
Исследовали характер кровотока в магистральных сосудах — брюшной аорте (БА), нижней полой вене (НИВ), почечных артериях (ПА) и микроциркуляторном звене. Изучали перфузию тканей (жидкостный обмен) в различных точках локации (конечности, основание хвоста), которые оценивали суммарно (Козлов/В.А. и др., 2000). Кровоток регистрировали ультразвуковым портативным допплерографом ММ-Д-Ф фирмы «МИНИМАКС» (СПб) у наркотизированных животных. Использовали датчик с частотой 10 МГц, работающий по принципу «слепого» допплера. Регистрировали параметры кровотока: среднюю (М), систолическую (S) и диастолическую (D) скорости кровотока, пульсовой индекс (PI), градиент, давления (GD), рассчитывали по формуле реографическии индекс (R1).
В рамках оценки системы гемостаза (СГ) использовали агрегацию тромбоцитов и данные электрокоагулографии. Исследование агрегации тромбоцитов у интактных животных и крыс с экспериментальным сахарным диабетом (ЭСД) провены турбидиметрическим методом Борна с применением агрегометра класса Solar (Беларуссия). Использовали-стандартные индукторы. - АДФ в двух концентрациях (10 мкг/мл и 1 мкг/мл) и коллаген (20 мг/мл) фирмы «Технология - Стандарт» (Барнаул): Оценивали следующие показатели агрегатограммы: степень агрегации (СтА) — максимальный уровень светопропускания плазмы после внесения индуктора агрегации, %; время начала агрегации (ВАН) - время начала подъема кривой агрегации (мин/сек); время агрегации (ВА) — время максимальной степени агрегации (мин/сек); скорость агрегации (СкА) — изменения светопропускания плазмы после внесения индуктора (%/мин).
Статистическую обработку результатов производили методом вариационной статистики, принимая во внимание коэффициент вариации динамических рядов, и оценивали корреляцию, учитывая ее достоверность по стандартным таблицам (Л.С Каминский), с использованием компьютерной программы статанализа Microsoft Excel.
При анализе перфузии тканей при ЭСД во всех точках локации выявлено снижение средней скорости кровотока (М) (в среднем — на 20%) преимущественно за счёт снижения систолической скорости кровотока (S) -на 15%, при повышении диастолической скорости кровотока (D) на 10% (табл.1, рис.1). Географические показатели характеризуются повышением Индекса Гослинга, отражающего повышение упругоэластических свойств (плотности) сосудистой стенки и снижением градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла. Индекс Пурселло (реографический индекс — RI), который отражает общее периферическое сосудистое сопротивление, повышается (рис.1).
Изменения водо- и электролитовыделительной функции почек у крыс с аллоксановым диабетом
Диабетическая нефропатия — одно из наиболее тяжелых последствий СД, снижающее качество и продолжительность жизни больных (Дедов И.И., Шестакова В., 2000; Бондарь И.А., Климонтов В.В., Королёва Е.А. и др., 2003) и занимающее первое место среди других ангиопатий. Каждый второй больной СД типа 1 и каждый четвертый больной СД типа 2 умирает от острой или хронической почечной недостаточности (Дедов И.И., Сунцов Ю.И., Кудрякова СВ. и др., 1998; Дедов И.И. 2003).
В условиях гипергликемии глюкоза беспрепятственно проникает в эндотелиальные клетки сосудов, вызывая в них патологические биохимические реакции. Эндотелий уязвим для воздействия как системной, так и внутриорганной или тканевой гипертензии, развивающейся- в микроциркуляторном русле. Нарушается функциональное состояние почек при СД типа 1 и при экспериментальном аллоксановом и стрептозотоциновом сахарном диабете у собак и крыс (Dj Loreto V, Moreno HS, Puche RC et al, 2004; Pfab T, Thone-Reineke C, Theilig F et al, 2006; Awad AS et al, 2005; Caden MP, Lawtenslager OJ, Hud E et al, 2007).
Нарушения почечной гемодинамики и микроциркуляции в. нефроне приводят к понижению клиренса инулина, креатинина, НААГ, что сопровождается трансканальцевыми- изменениями воды и электролитов. В этих механизмах нарушения водо- и электролитовыделительной- функции почек играют патогенетическую роль процессы ПОЛ, изменяющие фосфолипидный состав цитоплазматических мембран и активность мембраносвязанных ферментов.
Поэтому в этой главе описываются исследования по изучению водо- и электролитовыделительной функции почек в зависимости от тяжести экспериментального сахарного диабета, активность Na,K-ATO-a3bi — основного- компонента натриевого насоса, состояние ПОЛ и АОЗ клеток у крыс с экспериментальным аллоксановым сахарным диабетом. Все подопытные животные были разделены на 3 группы в зависимости от степени гипергликемии: 1. контрольная группа 2. животные с экспериментальным ЄД легкой степени тяжести (глюкоза крови - до 10 ммоль/л) 3: животные с экспериментальным- ЄД средней- степени- тяжести; (глюкоза крови от 10 до 15 ммоль/л).
Анализ полученных результатов показал, что вхронической стадии АД уже при уровне гипергликемии до 10 ммоль/л, отмечается статистически достоверное (р 0;001) увеличение спонтанного диуреза с 0,14±0,Г6І; мл/час/100; г веса в контрольной группе до 0 32±0,06; мл/час/ЮО" г веса, в; опытной, а при5АДсредне№степени:тяжести величина диуреза повьішаетсяїс 0,14±0,16 мл/час/ЮО, г веса до 0,27±0,03 мл/час/ЮО г веса (р 0;001) (табл. №4; рис.№6.1.). Следовательно, при экспериментальном сахарном диабете имеет место І статистически достоверное увеличение величины спонтанного диуреза.
Для выяснения, механизма увеличения экскреции; воды в условиях инсулиновой недостаточности у крыс,.мы исследовали;состояние основных процессов мочеобразования. При аллоксановом» диабете легкой; степени-тяжести. (Г группа), отмечается тенденция к снижению КФ (р 0,05), а у животных . с экспериментальным сахарным диабетом средней- тяжести (II группа) не обнаружено- достоверных изменений процессов клубочковой фильтрации (р 0,05). Поскольку определяющим величину диуреза фактором является уровень канальцевой реабсорбции воды, нами исследовался этот показатель, который выявил высоко достоверное снижение уровня канальцевой реабсорбции? воды как при АД легкой, так. и средней степени тяжести сахарного диабета (Таблица №4, рисунок №6).
