Введение к работе
Актуальность проблемы. По существующим оценкам, в структуре заболеваемости туберкулёзом органов дыхания ведущей формой является инфильтративный туберкулёз, что позволяет рассматривать данное заболевание как одну из наиболее значимых медико-социальных проблем отечественного здравоохранения [Григорьева Е.А., 2006; Мишин В.Ю. и соавт., 2006; Волчегорский И.А. и соавт., 2008].
На протяжении последних десятилетий в комплексе методов современной терапии туберкулёза ведущее положение занимает комбинированная этиотропная химиотерапия с использованием препаратов первого ряда – изониазид, рифампицин, этамбутол, пиразинамид, стрептомицин, и (при лекарственно-устойчивом туберкулёзе лёгких) препаратов второго ряда – аминогликозиды, тионамиды, капреомицн, циклосерин, парааминосалициловая кислота и препараты группы фторхинолонов [Мишин В.Ю., Степанян И.Э., 2000; Мишин В.Ю., 2001; Chan E.D., Iseman M.D., 2002; Harries A. et al., 2002; Sterling T.R. et al., 2003; Мишин В.Ю., Чуканов В.И., 2004; Лазарева Н.Б. и соавт., 2008]. Однако с внедрением её стандартных режимов, рекомендованных ВОЗ, количество случаев терапевтических неудач все еще остается высоким [Мишин В.Ю. и соавт., 2003, 2006, 2007; Перельман М.И. и соавт., 2004; Al-Attiyah R., Mustafa A.S., 2008; Gonzalez-Juarrero M. et al., 2009]. В качестве одной из причин недостаточной эффективности химиотерапии туберкулёза лёгких рассматривается токсическое действие противотуберкулёзных препаратов (ПТП) на клетки макроорганизма [Мишин В.Ю. и соавт., 2003; Чуканов В.И. и соавт., 2004; Новицкий В.В. и соавт., 2009], в том числе и негативное влияние ПТП на клетки иммунной системы [Арцимович Н.Г., Настоящая Н.Н., 1994; Jimenez-Valera M. et al., 1995; Инсанов А.Б. и соавт., 1998; Calleja C. et al., 1998; Гольев С.С., 2000; Гельберг И.С. и соавт., 2002; Pahlevan A.A. et al., 2002; Gil D. et al., 2003; Jun Y.T. et al., 2003; Васильева О.А., 2009; Ерохина М.В. и соавт., 2009; Новицкий В.В. и соавт., 2009; Селицкая Р.П., 2009], что неблагоприятно отражается на течении воспалительного процесса.
Общеизвестно, что ключевое значение в реализации иммунного ответа играет межклеточная кооперация иммунокомпетентных клеток крови [Lasco T.M. et al., 2003; Коненков В.И. и соавт., 2005; Guyot-Revol V., 2006; Sawant K.V., McMurray D.N., 2007; Aktas E. et al., 2009]. Причиной дизрегуляции реакций противоинфекционной защиты при туберкулёзе являются нарушения структурно-метаболического и функционального статуса лимфоцитов и моноцитов, которые регистрируются не только в период активного развития инфекции, но и в период ремиссии. Так, ранее проведёнными исследованиями было показано, что у больных лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких после завершения курса интенсивной и поддерживающей терапии имеют место изменения морфологии, дисбаланс процессов пролиферации и апоптоза лимфоцитов, продукции иммунорегуляторных цитокинов мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro, нарушения адгезии, поглотительной и переваривающей функции клеток системы мононуклеарных фагоцитов [Серебрякова В.А. и соавт., 2006; Новицкий В.В. и соавт., 2006, 2007, 2009; Воронкова О.В., 2007; Филинюк О.В. и соавт., 2007].
Анализ данных литературы свидетельствует о том, что в настоящее время имеется сравнительно немного работ, посвященных оценке прямого (in vitro) влияния ПТП на показатели неспецифической резистентности и специфического иммунитета. Практически все научно-исследовательские работы аналогичного направления выполнены в экспериментах на животных, либо на периферической крови здоровых доноров. Вместе с тем, в доступной литературе сведения о прямом влиянии ПТП на иммунокомпетентные клетки у больных туберкулёзом лёгких практически отсутствуют. Следует подчеркнуть, что, несмотря на универсальный характер механизмов, лежащих в основе антиген-индуцированных изменений функциональной активности иммунокомпетентных клеток, определяющим фактором их ответной реакции на действие родственных повреждающих факторов (в том числе при медикаментозном воздействии) является фоновое состояние клеток и их адаптационная реактивность, резерв которой в условиях развивающегося инфекционного процесса претерпевает выраженное истощение.
Функционирование иммунной системы обеспечивается постоянной рециркуляцией иммунокомпетентных клеток и их взаимодействием, а сбалансированность иммунного ответа на антигенную агрессию непосредственно зависит от основных физиологических процессов, происходящих в самой иммунной системе, определяемых клональной пролиферацией, дифференцировкой и апоптозом клеток, интенсивностью внутриклеточного метаболизма, секрецией биомолекул, обеспечивающих кооперацию регуляторных и эффекторных клеток в процессе реализации иммунного ответа.
Учитывая глубокую дисфункцию иммунной системы, сопровождающую развитие туберкулёза лёгких, и высокую фармакологическую активность применяемых ПТП, исследование механизмов их прямого влияния на иммунокомпетентные клетки крови в условиях патологии представляет значительный интерес, поскольку именно уровень иммунологической реактивности организма при туберкулёзе оказывает существенное влияние на течение и исход заболевания.
В заключение следует отметить, что актуальность изучения особенностей влияния основных и резервных препаратов химиотерапии туберкулёза на метаболическую, функциональную активность и апоптоз лимфоцитов крови не вызывает сомнений, поскольку определяет возможность более глубокого понимания сути патогенеза иммунопатологических осложнений в условиях применения ПТП и может быть основой разработки способов эффективной направленной иммунокорригирующей терапии.
Цель исследования: выявить механизмы и особенности прямого (in vitro) действия основных и резервных препаратов противотуберкулёзной химиотерапии на иммунокомпетентные клетки периферической крови при туберкулёзе лёгких.
Задачи исследования:
-
Охарактеризовать прямое (in vitro) влияние препаратов химиотерапии туберкулёза лёгких основного (изониазид, рифампицин, этамбутол) и резервного (офлоксацин, парааминосалициловая кислота, капреомицин) ряда на реактивность мононуклеарных лейкоцитов, ферментативные свойства и апоптоз лимфоцитов крови у здоровых доноров и при инфильтративном туберкулёзе лёгких.
-
Провести сравнительную оценку цитопатических эффектов противотуберкулёзных препаратов in vitro у здоровых доноров и больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких.
-
Установить общие закономерности и особенности прямого (in vitro) иммунотропного действия основных и резервных противотуберкулёзных препаратов при лекарственно-чувствительном и лекарственно-устойчивом инфильтративном туберкулёзе лёгких.
-
Оценить in vitro препарат-индуцированные нарушения цитокинопродукции, ферментативной, пролиферативной и апоптотической активности лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров и больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких в зависимости от вида применяемых противотуберкулёзных препаратов.
Научная новизна. Проведено комплексное изучение прямого (in vitro) влияния ПТП основного (первого) и резервного (второго) ряда на реактивность мононуклеарных лейкоцитов, метаболизм и апоптоз лимфоцитов крови у больных с впервые выявленным инфильтративным туберкулёзом лёгких (до начала проведения им специфической терапии). Впервые показано, что основные и резервные ПТП способны in vitro оказывать модулирующее действие на антиген-индуцированную секрецию мононуклеарными лейкоцитами про- и противовоспалительных цитокинов, что проявляется как её активацией (IL-2 при действии рифампицина, IL-12 под влиянием изониазида, IL-10 в присутствии парааминосалициловой кислоты и TGF при действии офлоксацина, парааминосалициловой кислоты и капреомицина), так и угнетением (IL-2 под влиянием изониазида, IL-12 в присутствии рифампицина и офлоксацина, IL-10 и TGF- при действии рифампицина, IFN- под влиянием рифампицина, этамбутола, офлоксацина и TNF в присутствии офлоксацина). Впервые установлено, что этамбутол, офлоксацин, парааминосалициловая кислота и капреомицин in vitro подавляют пролиферацию антигенспецифических лимфоцитов у больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких. Впервые показано, что основные и резервные ПТП in vitro индуцируют угнетение активности сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитарных клетках (в условиях перераспределения популяции лимфоцитов периферической крови с повышением доли низкоактивных клеток), стимулируют активность кислой фосфатазы и апоптоз лимфоцитов. Продемонстрировано, что у больных лекарственно-резистентным туберкулёзом лёгких in vitro интенсивность антиген-индуцированной секреции IFN (при действии рифампицина, этамбутола и капреомицина), IL-4 (под влиянием изониазида, этамбутола, офлоксацина и парааминосалициловой ксилоты), TNF (в присутствии офлоксацина) и количество CD95+-лимфоцитов (при действии офлоксацина) ниже, а секреция IL-12 (под влиянием изониазида, офлоксацина, парааминосалициловой кислоты и капреомицина), IL-10 (в присутствии изониазида и парааминосалициловой кислоты) и TGF- (при действии изониазида и рифампицина), напротив, выше, чем при лекарственно-чувствительном варианте заболевания. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что у больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких лимфоциты более чувствительны к экзогенному лекарственному воздействию in vitro, чем у здоровых доноров. Так, у пациентов с туберкулёзом лёгких отмечается более выраженное угнетение пролиферации антигенспецифических лимфоцитов (при действии офлоксацина), активности сукцинатдегидрогеназы и изменение структуры популяции лимфоцитов (после 2-часового воздействия основных и резервных ПТП), увеличение среднего цитохимического коэффициента кислой фосфатазы (под влиянием изониазида, этамбутола и капреомицина) и числа апоптотических лимфоцитов (в присутствии рифампицина и офлоксацина). При этом у здоровых доноров регистрируется более значительное подавление антиген-индуцированной секреции мононуклеарными лейкоцитами IFN (при действии рифампицина) и IL-10 (под влиянием рифампицина). Впервые показано, что у больных туберкулёзом лёгких in vitro рифампицин обладает более выраженным иммуносуперссорным эффектом, чем изониазид и этамбутол, что проявляется более высокой степенью угнетения антиген-индуцированной секреции IFN и более низким уровнем антиген-стимулированной продукции мононуклеарными лейкоцитами IL-12 при его действии. Впервые продемонстрировано, что у больных туберкулёзом лёгких иммуномодулирующий эффект офлоксацина in vitro более выражен, чем у парааминосалициловой кислоты и капреомицина. Так, при действии офлоксацина регистрируется увеличение числа апоптотических лимфоцитов (что не было отмечено в присутствии капреомицина), а также более значительное повышение доли клеток с низкой активностью сукцинатдегидрогеназы. Впервые установлено, что иммунотропный эффект основных препаратов химиотерапии туберкулёза проявляется более значимым, чем у ПТП резервного ряда, апоптоз-индуцирующим действием, повышением активности кислой фосфатазы в лимфоцитах и увеличением антиген-стимулированной секреции IL-4 in vitro. Иммуномодулирующее действие препаратов второй линии in vitro характеризуется более высокой степенью подавления активности сукцинатдегидрогеназы и угнетением антиген-индуцированной TNF-секреторной активности мононуклеарных лейкоцитов.
Практическое и теоретическое значение работы. Получены новые данные фундаментального характера о механизмах прямого (in vitro) иммуномодулирующего действия ПТП первого и второго ряда на антиген-индуцированную секрецию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами, пролиферацию, апоптоз и метаболизм лимфоцитов крови у больных с инфильтративным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких. Результаты исследования теоретически обосновывают необходимость включения в стандартную схему лечения больных туберкулёзом лёгких иммуномодулирующих препаратов для профилактики и коррекции иммунодефицитных состояний, обусловленных влиянием не только возбудителя, но и ПТП. Полученные данные могут быть положены в основу разработки методологического подхода к коррекции лекарственно-индуцированных нарушений реактивности мононуклеарных лейкоцитов, сопровождающих течение туберкулёзной инфекции на этапе специфического лечения. Знание механизмов прямого иммунотропного действия ПТП на мононуклеарные лейкоциты больных туберкулёзом лёгких представляет значительный интерес для фтизиатрической практики и иммунологии не только с точки зрения получения новых фундаментальных знаний, но и дальнейшей разработки на основе уже известных и широко применяемых лекарственных средств с известной структурой новых их производных с выраженным иммуномодулирующим эффектом. Основные положения и выводы диссертации используются в учебном процессе ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава на кафедре патофизиологии в тематических разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета» и кафедре фармакологии в лекционных и практических разделах по теме «Побочное действие антимикробных средств».
Положения, выносимые на защиту:
-
В основе иммунотропного действия основных (изониазид, рифампицин, этамбутол) и резервных (офлоксацин, парааминосалициловая кислота, капреомицин) противотуберкулёзных препаратов in vitro у здоровых доноров и больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких лежит модулирующее их влияние на антиген-индуцированную секрецию мононуклеарными лейкоцитами крови провоспалительных (IL-2, IL-12, IFN, TNF) и противовоспалительных (IL-4, IL-10, TGF) цитокинов, подавление пролиферации и активация апоптоза лимфоцитов с угнетением в них активности сукцинатдегидрогеназы и повышением активности кислой фосфатазы.
-
Ответная реакция мононуклеарных лейкоцитов крови на прямое действие противотуберкулёзных препаратов основного и резервного ряда (в условиях дополнительной антигенной нагрузки и без неё) определяется исходным состоянием клеток. При этом у больных туберкулёзом лёгких in vitro апоптоз, угнетение пролиферативного ответа антигенспецифических клеток, дисбаланс ферментативной активности лимфоцитов, индуцированные противотуберкулёзными препаратами, носят более выраженный характер, чем у здоровых доноров.
-
У больных лекарственно-резистентным инфильтративным туберкулёзом лёгких in vitro при действии противотуберкулёзных препаратов первого и второго ряда степень секреторной дисфункции мононуклеарных лейкоцитов является более выраженной, чем при лекарственно-чувствительном варианте инфекции. Наибольший суммарный негативный эффект на иммунокомпетентные клетки крови из числа противотуберкулёзных препаратов основного ряда оказывает рифампицин, а из препаратов второй линии – офлоксацин.
-
Противотуберкулёзные препараты основного ряда in vitro способны не только подавлять, но и активировать секрецию Th1-ассоциированных цитокинов: IL-2 (рифампицин) и IL-12 (изониазид) в ответ на антигенное воздействие. При этом они оказывают более выраженное стимулирующее влияние на секрецию IL-4, апоптоз и активность кислой фосфатазы в лимфоцитах крови, чем резервные противотуберкулёзные препараты, наиболее значимыми цитопатическими эффектами которых являются угнетение активности фермента цикла трикарбоновых кислот (сукцинатдегидрогеназы) в лимфоцитах и секреции TNF мононуклеарными лейкоцитами крови.
Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на IX, X конгрессах молодых учёных и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008, 2009), межгородских конференциях молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), II Архангельской международной медицинской конференции молодых учёных и студентов (Архангельск, 2009), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009), Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Томск, 2009), VII международной Российско-германской конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекции» (Новосибирск, 2009), а также на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2009).
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК №02.412.11.2040; ГК №02.512.11.2112; ГК №02.512.11.0013) и Совета по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ (НШ-4153.2006.7; НШ-2334.2008.7).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ, из них 10 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 213 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 28 таблицами. Библиографический указатель включает 422 источника, из них 231 отечественных и 191 зарубежных авторов.
