Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 13
1.1 Современные представления о патогенезе токсических поражений печени. Роль окислительного стресса 13
1.2 Механизмы действия флавоноидов и их применение при токсических поражениях печени 36
Выводы по главе 1 65
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 66
2.1 Характеристика объектов исследования 66
2.2 Постановка опытов и основные экспериментальные серии 68
2.3 Методы исследования 76
2.3.1 Оценка поражения печени по биохимическим показателям 76
2.3.2. Оценка интенсивности переписного окисления липидов 78
2.3.3. Оценка состояния эндогенной антиоксидантной системы 79
2.3.4 Определение активности ферментов микросомалъной системы печени 82
2.3.5 Оценка состояния энергетического обмена в печени 83
2.3.6 Определение содержания NO-радикалов методом ЭПР 84
2.3.7 Выделение постъядерной, микросомалъной и митохондриальной фракций печени 85
2.3.8 Определение антиоксидантной активности флавоноидов в модельной системе
2.3.9 Изучение гистоморфологической картины печени 86
2.3.10 Оценка желчеобразовательной функции печени 87
2.4 Используемые реактивы 87
2.5 Статистическая обработка результатов эксперимента 88
ГЛАВА 3 Определение эффективной дозы флавоноидов и сухого экстракта из горошка обрубленного на модели острого поражения печени у крыс
Выводы по главе 3 105
ГЛАВА 4 Сравнительное изучение гепатозащитного действия флавоноидов и сухого экстракта из горошка обрубленного на модели острого поражения печени у крыс
4.1 Характеристика острого поражения печени тетрахлорметаном 106
4.2 Сравнительная оценка эффективности и особенности генатозащитного действия флавоноидов и сухого экстракта при остром ССІ4-генатитогепатозе 113
Выводы по главе 4 127
ГЛАВА 5 Сравнительное изучение гепатозащитного действия флавоноидов и сухого экстракта из горошка обрубленного при остром алкогольном поражении печени у крыс
5.1. Характеристика острого алкогольного поражения печени 128
5.2 Сравнительная оценка эффективности и особенности гепатозащитного действия флавоноидов и сухого экстракта при остром алкогольном поражении печени 133
Выводы по главе 5 145
ГЛАВА 6 Влияние флавоноидов и сухого экстракта из горошка обрубленного на основные звенья патогенеза острого поражения печени четырёххлористым углеродом
6.1 Влияние флавоноидов и сухого экстракта на про-антиоксидантное равновесие при остром ССІ4-гепатитогепатозе 146
6.2 Влияние флавоноидов и сухого экстракта на энергетический обмен в печени при остром ССІ-гепатитогепатозе 156
6. 3 Влияние флавоноидов и сухого экстракта на систему микросомального окисления в печени при остром ССІ4-генатитогепатозе 161
Выводы по главе 6 164
ГЛАВА 7 Влияние флавоноидов и сухого экстракта из горошка обрубленного на основные звенья патогенеза острого алкогольного поражения печени
7.1 Влияние флавоноидов и сухого экстракта на про-/антиоксидантное равновесие при остром алкогольном поражении печени 174
7.2 Влияние флавоноидов и сухого экстракта на энергетический обмен при остром алкогольном поражении печени 178
7.3 Влияние флавоноидов и сухого экстракта на систему микросомального окисления при остром алкогольном поражении печени 183
Выводы по главе 7
ГЛАВА 8 Изучение антиоксидантного действия флавоноидов, сухого экстракта из горошка обрубленного и карсила in vitro и in vivo и их влияния на энергетический обмен и микросомальное окисление в условиях нормы
Выводы по главе 8 198
ГЛАВА 9 Изучение влияния флавоноидов на эндотелиальную дисфункцию, продукцию no, органный кровоток и ге-мореологические показатели крови
Выводы по главе 9 218
ГЛАВА 10 Изучение лечебного действия сухого экстракта из горошка обрубленного при хроническом поражении печени и его влияния на желчеобразовательную функцию печени
10.1 Изучение гепатозащптного действия сухого экстракта при хронической алкоголизацин у крыс в сравнении с карсилом 219
10.2 Изучение влияния сухого экстракта на развитие фиброза при хроническом поражении печени ССІ4 в сравнении с карсилом 236
10.3 Изучение биохимических показателей печени при хроническом ССІ4-гепатите через 2 месяца после лечения сухим экстрактом и карсилом 240
10.4 Изучение влияния сухого экстракта на желчеобразовательную функцию печени в сравнении с флампном и карсилом 241
Выводы по главе 10 244
Заключение 245
Общие выводы 261
Список литературы 264
- Механизмы действия флавоноидов и их применение при токсических поражениях печени
- Сравнительная оценка эффективности и особенности генатозащитного действия флавоноидов и сухого экстракта при остром ССІ4-генатитогепатозе
- Сравнительная оценка эффективности и особенности гепатозащитного действия флавоноидов и сухого экстракта при остром алкогольном поражении печени
- Влияние флавоноидов и сухого экстракта на энергетический обмен при остром алкогольном поражении печени
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Поражения печени различной этиологии являются достаточно широко распространенной патологией [Дробинский А. и соавт., 2002; Ильченко Л.Ю. и соавт., 2002, Полонский В.М., 2005]. По данным ВОЗ в мире – 2 млрд человек с патологией печени, что в 100 раз превышает распространенность ВИЧ-инфекции [Дроговоз С.М., 2009]. Среди широкого круга препаратов, используемых в комплексной терапии заболеваний печени, выделяют сравнительно небольшую группу «истинных» гепатопротекторов, эффективность которых не всегда оказывается достаточной.
В патогенезе поражений печени (токсической, алкогольной и другой этиологии) большое значение отводится окислительному стрессу [Буеверов А.О., 2002, Скворцов В.В., 2003, Ипатова О.М., 2005, Оковитый С.В., 2007, Fernandes-Checa J. C., 2003, Lieber C.S., 2004, Dey A., Cederbaum A.I., 2006]. При оксидативном стрессе, в первую очередь, наблюдается сдвиг про-антиоксидантного равновесия в сторону усиления прооксидантной составляющей, снижение резервов мобилизации антиоксидантной защиты, что сопряжено с нарушением энергообеспечения клетки, детоксикационных механизмов, активацией апоптоза, провоспалительных цитокинов и др.[Дубинина Е.Е., 1998, Болдырев А.А., 2001, Шаповал Г.С. и др., 2003, Сазонтова Т.Г. и др., 2007, Ланкин В.З. и др., 2009, Han D. Et all., 2006]. Окислительный стресс инициирует нарушения, связанные с кровоснабжением печени (повреждение эндотелия сосудов и синусоидов печени с изменением выработки оксида азота, ухудшение реологических свойств крови, состояния микроциркуляторного русла и пр.), что усугубляет течение патологического процесса [Марков Х.М., 2005, Lukivskaya O. et al., 2004, Prvu A.E. et al., 2005, Babl P. et al., 2006].
Многофакторность патогенеза поражений печени требует, чтобы и защита осуществлялась на различных уровнях и структурах, что определяет перспективность поиска новых гепатопротекторов среди флавоноидов, для которых выявлено более 40 видов фармакологической активности [Robak J.et al., 1996]. Несмотря на значительное число работ, посвященных изучению гепатозащитных свойств флавоноидов, сравнительного изучения эффективности их действия не проводилось. Не выяснены до конца и механизмы их гепатопротекторной активности. Большинство исследователей считают, что основой такового является антиоксидантное действие [Чучалин В.С., 2003, Куркин В.А., 2003, Саратиков А.С. и др., 2005, Middleton E. JR. et al., 1996, 2000, Roback I. et al., 1996, Narayana et al., 2001, Nijveldt R.I. et al., 2001, Havsteen B. H., 2002]. В последние годы все большее внимание уделяется исследованию состояния эндогенных систем антиоксидантной защиты [Puiggros F. et al., 2005, Moskaug et al., 2005, Кравченко Л.В. и др., 2005, Frei B., 2003].
Поэтому сегодня актуальным является не только поиск новых эффективных и безопасных гепатозащитных препаратов, но и сравнительное изучение особенностей и интимных механизмов действия уже известных гепатопротекторов.
Исходя из этого, следует считать важным, как с научной, так и с практической точки зрения, комплексное, сравнительное изучение гепатопротекторного действия флавоноидов, их влияние на про-антиоксидантный баланс, системы антиоксидантной защиты, детоксикации и энергообеспечения, эндотелиальную дисфункцию, продукцию оксида азота и печеночный кровоток, что и явилось предметом настоящей работы.
Цель и задачи работы.
На основании комплексной и сравнительной оценки влияния флавоноидов на основные метаболические и гемодинамические патогенетические процессы при токсических поражениях печени экспериментально обосновать создание новых эффективных отечественных гепатопротекторов.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- провести изучение в сравнительном аспекте влияния лечебно-профилактического действия гесперидина, диосмина, флавицина, кверцетина, карсила и сухого экстракта (СЭ) из горошка обрубленного (Vicia abbreviate Fish. ex Spreng. (Vicia truncatula Fish. ex. Bieb.), содержащего флавицин, на развитие синдромов цитолиза, холестаза, мезенхимального воспаления и гепатодепрессии, гистологическую картину печени, интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ), состояние систем антиоксидантной защиты (АОЗ), энергообеспечения и детоксикации при экспериментальном остром поражении печени СС14 и этанолом;
- провести сравнительное изучение антиоксидантного действия исследуемых флавоноидов in vitro и их влияния на интенсивность ПОЛ, состояние систем АОЗ, энергообеспечения и детоксикации in vivo при их курсовом введении в условиях нормы;
- провести сравнительное изучение влияния флавоноидов на содержание NO у интактных животных и при его избыточной продукции, индуцированной СС14, методом ЭПР;
- изучить в сравнительном аспекте влияние флавоноидов на органный кровоток и функцию эндотелия в условиях нормы и моделирования эндотелиальной дисфункции;
- провести комплексное изучение энергетического обмена, интенсивности ПОЛ и состояния АОЗ, а также изменения печеночных показателей и гистоморфологической картины данного органа в ходе хронической алкоголизации и при лечебном применении наиболее активного гепатопротектора в сравнении с карсилом;
- изучить влияние наиболее активного гепатопротектора на развитие фиброза при хроническом поражении печени СС14, желчеобразовательную функцию печени в норме и при экспериментальном гепатите и отдаленные результаты его лечения.
Научная новизна полученных результатов.
Впервые проведено сравнительное, комплексное изучение механизмов гепатопротекторного действия индивидуальных флавоноидов, флавицина и СЭ из травы горошка обрубленного, их влияние на процессы ПОЛ, системы АОЗ, детоксикации и энергообмена в условиях нормы и патологии печени. Впервые установлена гепатозащитная активность флавицина, выделенного из оригинального растительного сырья (надземная часть V.abbreviata), при токсических поражениях печени СС14 и этанолом. Впервые показано существование тесной корреляционной взаимосвязи между выраженностью гепатозащитного действия и степенью восстановления про-антиоксидантного равновесия за счет не только прямого антиоксидантного действия флавоноидов, но и повышения активности эндогенной системы АОЗ в печени.
Впервые выявлено, что курсовое введение исследуемых флавоноидов оказывает стимулирующее влияние на активность NADP+-редуктазных ферментов, принимающих участие в регенерации восстановленного глутатиона, а применение диосмина, флавицина и кверцетина повышает содержание GSH, участвующего в механизмах повышения неспецифической резистентности организма к экстремальным факторам среды.
Впервые показано, что введение гесперидина и флавицина увеличивает печеночный кровоток в условиях нормы. Впервые проведено сравнительное изучение корригирующего влияния флавоноидов на органный кровоток в условиях эндотелиальной дисфункции, очевидно связанное с активацией eNOS и повышением продукции NO.
Методом ЭПР показано повышение под влиянием флавоноидов содержания NO в норме, и его снижение в условиях индукции окислительного стресса введением СС14, что свидетельствует об их модулирующем влиянии на продукцию NO.
Впервые установлено, что СЭ из Vicia abbreviata, содержащий 5,12 – 5,67 % флавицина, обладает более эффективным гепатопротекторным действием, чем препарат сравнения карсил, и изучен механизм действия СЭ при профилактическом и лечебном применении, который связан с преодолением окислительного стресса за счет поддержания функционирования эндогенной системы АОЗ, нормализации энергопродукции и процессов детоксикации, торможением процесса фиброгенеза при хронической патологии, восстановлением желчеобразовательной функции печени.
Впервые показано, что в ходе хронической алкоголизации происходит усиление адаптационно-защитных механизмов в виде повышения активности ферментов NADPH-GSH-зависимой системы, что значительно более выражено при лечебном применении СЭ из Vicia abbreviate.
Практическая значимость. На основании полученных результатов выявлено в разной степени выраженное влияние флавоноидов на патологические синдромы, патогенетические механизмы поражения гепатоцитов: ПОЛ, систему АОЗ, детоксикации и энергообразования, кровоснабжение печени, эндотелиальную дисфункцию. Такие данные позволяют разработать рекомендации по дифференцированному применению флавоноидов, как гепатопротекторов, при определенном характере течения заболевания печени. Сумма, содержащая арабиноглюкозид - и ксилоглюкозид диосметина, которая условно названа флавицином, может быть рекомендована для дальнейшей разработки в качестве лекарственного средства для лечения поражений печени. СЭ из V. abbreviata, оказывающий выраженное гепатозащитное действие при острых и хронических токсических поражениях печени, превосходящее карсил, а также препятствующий развитию фиброза и стимулирующий секрецию желчи, может быть использован для создания лекарственного препарата.
Практические рекомендации. Учитывая селективную токсичность ряда лекарств по отношению к эндотелиальным клеткам синусоидов печени и наиболее выраженное положительное действие гесперидина на эндотелиальную функцию и печеночный кровоток, данное соединение может быть рекомендовано для коррекции сосудистых поражений печени. Более эффективное нормализующее влияние диосмина на холестаз может быть основанием для его рекомендации при заболеваниях печени, сопровождающихся нарушением желчеобразования. Кверцетин может быть рекомендован при поражениях печени, сопровождающихся выраженным цитолизом и мезенхимальным воспалением. Флавицин и СЭ, являющиеся высокоэффективными гепатопротекторами при поражениях печени СС14 и алкоголем, могут быть рекомендованы для разработки на их основе лекарственных средств для лечения и профилактики заболеваний печени при острых и хронических отравлениях гепатотоксическими ядами.
Уровень внедрения результатов исследования.
По данным, полученным автором, подготовлены информационные письма, материалы которых включены в планы НИР кафедр технологии лекарств (акт внедрения от 03.09.2007 г.), органической химии (акты внедрения от 07.09.2007г. и от 04.11.2009), фармакогнозии (акт внедрения от 03.11.2009), фармакологии (акт внедрения от 29.08.2007 г.) и ботаники (акт внедрения от 10.11.2009) Пятигорской ГФА Росздрава. Материалы, полученные автором, используются в санаторно-курортной практике (санаторий им. М.Ю. Лермонтова, г. Пятигорск, акт внедрения от 20.08. 2007). Результаты работы включены в лекционный материал для студентов лечебного, педиатрического, фармацевтического, слушателей факультета усовершенствования врачей и провизоров на кафедрах фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ, Курского государственного медицинского университета, Ставропольской государственной медицинской академии, Саратовского государственного медицинского университета. Данные по изучению механизма действия и гепатозащитной активности сухого экстракта из горошка обрубленного вошли в комплект документов, переданных в ООО «Эвалар» для представления в ФК МЗ и СР на получение разрешения к проведению клинических испытаний.
Связь с планом НИР ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава».
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» по проблеме «Изучение биохимических основ защитного действия флавоноидов при экспериментальном поражении печени»(номер государственной регистрации 01.200.11. 7645), а также в соответствии с планом научно-исследовательских работ Волгоградского Государственного медицинского университета и соответствует проблеме, номер государственной регистрации 01 200 800 804.
Апробация полученных результатов.
Основные положения диссертационной работы изложены на 55-й – 63-ей научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2000-2008 гг.), на десятой Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2005 г.), на международной конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005 г.), на IV конференции гастроэнтерологов Южного Федерального округа (Кисловодск, 2005г.), на международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2006 г.), на IX Украинском биохимическом съезде (Харьков, 2006 г.).
Положения, выносимые на защиту.
1. При острых поражениях печени СС14 и этанолом более выраженной гепатозащитной активностью в сравнении с индивидуальными флавоноидами и карсилом, обладает СЭ из V. abbreviate (truncatula), который практически полностью устраняет развитие синдромов цитолиза, холестаза, мезенхимального воспаления и печеночной недостаточности, белковую и жировую дистрофии, а также в большей степени восстанавливает про-антиоксидантное равновесие, энергетический обмен и активность систем детоксикации при лечебно-профилактическом введении в дозе 300 мг/кг.
2. В условиях развития окислительного стресса при острых токсических поражениях печени СС14 и этанолом выявлено в различной степени выраженное влияние флавоноидов и СЭ на ферментативное звено системы АОЗ и сопряженные механизмы клеточной защиты (энергообмен и детоксикацию).
3. Флавицин in vitro по силе антиоксидантного действия уступает кверцетину, но более мощно активирует АОЗ и превосходит кверцетин по эффективности гепатопротекции и поддержанию равновесия в системе ПОЛ/АОС. Отмечается достаточно тесная корреляционная связь между выраженностью гепатопротекции и коэффициентом окислительного стресса, характеризующим про-антиоксидантный баланс. Отсюда следует, что более важное значение для защиты печени имеет не просто снижение и подавление ПОЛ, а устранение дисбаланса в системе ПОЛ/АОС.
4. СЭ из Vicia abbreviate (truncatula) в дозе 300 мг/кг обладает выраженным лечебным действием при поражении печени, вызванном хронической алкогольной интоксикацией, усиливая адаптационно-приспособительную защитную реакцию, развивающуюся в ходе алкоголизации при введении этанола, превышая по эффективности карсил.
5. В результате курсового введения исследуемых флавоноидов в эффективных гепатопротекторных дозах наблюдается активация ферментов, принимающих участие в регенерации восстановленного глутатиона, и повышается содержание GSH в печени, что увеличивает неспецифическую резистентность органа к действию повреждающих факторов.
6. Исследуемые флавоноиды в норме и при эндотелиальной дисфункции увеличивают продукцию NO, вероятно, путем активации eNOS, и повышают печеночный кровоток, а также ограничивают гиперпродукцию NO iNOS в печени, стимулированную СС14, что в определенной степени обусловливает гепатопротективные свойства флавоноидов.
7. СЭ в дозе 300 мг/кг при лечебном применении на модели хронического СС14-гепатита уменьшает развитие фиброза, а также улучшает желчеобразовательную функцию печени в норме и при патологии печени.
8. Высокая эффективность СЭ, связанная с воздействием на основные звенья патогенеза острых и хронических поражений печени, наличие у него более выраженного лечебного действия, чем у карсила, позволяет рекомендовать СЭ в качестве субстанции для создания нового гепатопротекторного препарата.
Публикации .По теме диссертации опубликовано 42 печатных работы из них 9 статей в научных журналах, которые входят в перечень рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 351 страницах текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований (8 глав), заключения, общих выводов, списка литературы, приложений А, Б и В (55 страниц). Работа иллюстрирована 31 таблицей и 89 рисунками. Библиографический список включает 649 источников, из которых 416 публикации иностранных авторов.
Механизмы действия флавоноидов и их применение при токсических поражениях печени
В 1814 году впервые был получен флавоноид, названный кверцетином и имел жёлтую окраску. Флавоноиды являются самой многочисленной группой растительных полифеноль-ных соединений и не образуются в животном организме. На сегодняшний день из растений выделено и охарактеризовано более пяти тысяч [423], а по данным [315, 528] - более восьми тысяч индивидуальных флавоноидов. Флавоноиды относятся к дифенилпропаноидам, объединяемым общим структурным признаком Сб-Сз-Сб- В основе этих веществ лежит молекула флавана, имеющая два бензольных (А и В) и одно кислородосодержащее гетероциклическое пирановое кольцо (С-кольцо). К ним относятся катехины (флаван-3-олы), лейкоантоциани-дины (флаван-3,4 диолы), халконы (изоликвиритигенин, бутеин), дигидрохалконы (флоре-тин, оксифлоретин), антоцианидины (цианидин, дельфинидин, пеларгонидин), флавоны (апигенин, лютеолин, диосметин и его 7-О-гликозид диосмин), флавонолы (кемпферол, кверцетин, мирицетин), флаваноны (нарингенин, эриодиктиол, гесперетин и его 7-О-гликозид гесперидин), флаванонолы или дигидрофлавонолы (аромадендрин, таксифолин или дигидрокверцетин), ауроны (сульфуретин, ауреузидин) и изофлавоны (генистеин, даидзеин, формононетин) [74] . Флавоноиды широко представлены в овощах, фруктах, цветах, семенах, стеблях и корнях растений, которые служат источником поступления данных соединений для животных и человека [81, 151].
Флавоноиды обладают широким спектром биологической и фармакологической активности. Помимо капилляроукрепляющего, установлено наличие противовоспалительной, противоинфекционной, антиаллергической, антигистаминной, антимутагенной, спазмолитической, анаболической, ранозаживляющей, антитромбической, венотонизирующей, противоязвенной, гипохолестеринемической, антикарциногенной, антиатеросклеротической, кардио-стимулирующей, противоопухолевой, противовирусной, гспатозащитной и радиозащитной активностей [80, 209, 316, 356, 419, 496, 497, 526, 617]. Для флавоноидов выявлено более 40 видов фармакологической активности, они применяются при около 50 заболеваниях [496, 497].
Основой разнообразной биологической активности и протективного действия флавоноидов при патологических состояниях являются: 1) антиоксидантные свойства [209,315, 316, 387, 497, 617]; 2) способность .модулировать активность различных ферментов и клеточных рецепторов [419, 496, 497, 524]; 3) способность вмешиваться в специфические биохимические пути [347].
Антиоксидантное действие различных классов флавоноидов достаточно хорошо изучено in vitro по торможению ПОЛ в различных химических и биологических системах [44, 81, 151, 225, 269, 278, 349, 395, 429, 432, 500, 522, 525, 552, 555, 626, 629] и по предотвращению Н 02-индуцированного повреждения ДНК и цитотоксического действия на различных клетках [358, 396,411,423, 536, 553, 620, 623] Флавоноиды проявляют антиоксидантные свойства благодаря [315]: 1) способности выступать в качестве «ловушек» свободных радикалов и большинства ROS; 2) способности подавлять образование ROS путем: а) хелатирования металлов переменной валентности, которые вовлечены в продукцию ROS; б) путем ингибирования некоторых ферментов, участвующих в образовании ROS (ксантиыоксидаза. миелопероксидаза, NADH-оксидаза и др.);3) способности усиливать экспрессию или обеспечивать защиту эндогенной АОС. Благодаря низкому редокс-потенциалу (0,23 Е 0,75), флавоноиды термодинамически способны восстанавливать высокоокнсленные свободные радикалы с редокс-потенциалом 2,13 Е 1,0, такие как 02 (Е=0,94), ROO (Е=1,00), RO" (Е=1,6), ОН (Е-2,1), выступая донаторами водородных атомов [169, 278, 315, 577]. Показано, что флавоноиды активны в отношении радикалов, возникающих как в ли-пидной, так и в водной фазе, и ингибируют процессы ПОЛ, как на стадии инициации, взаимодействуя с активными формами кислорода (02; -ОН, Ог, НОСІ, Н2О2), так и на стадии продолжения цепи, выступая донорами атомов водорода для липидных радикалов RO-, ROO- [151, 315, 471, 489]. Продемонстрирована способность флавоноидов нейтрализовать искусственные стабильные радикалы - 2,2 - дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) [211, 273, 500, 577, 623], катион-радикал 2,2-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты (ABTS ) [386, 549], гидроксильные радикалы [125, 159, 273, 338, 387, 428, 454, 517, 522, 555, 560], супероксидные анион-радикалы [147, 159, 169, 273, 338, 387, 408, 428, 486, 624], пероксинит-рильные радикалы [291, 381, 454, 630], гидроксиэтильный радикал, образующийся при взаимодействии этанола с -ОН [560]. Значительный интерес для исследователей представляет изучение взаимосвязи между антиоксидантной и антирадикальной активностью флавоноидных соединений и их структурой. Анализ литературных данных по этому вопросу позволяет сказать, что многими авторами прослеживаются примерно одни и те же структурные закономерности: свойства флавоноидов зависят от количества свободных ОН-групп и их расположения, наличия двойных связей, гликозиды менее активны, чем агликоны, метилирование гидроксильных групп приводит к снижению активности или не влияет на нее [81, 125, 147, 159, 169, 211, 269, 278,296, 395, 423, 454, 508, 550, 577, 587, 620]. Многочисленные экспериментальные исследования в водных системах позволили выявить следующие наиболее важные для антирадикальной активности структурные элементы молекул флавоноидов: 1) две ОН-группы в положениях Сз и С4; 2) двойная связь между 2 и 3 атомами углерода, желательно совместно с карбонильной группой в положении С4; 3) ОН-группы в положениях Сз и С5 совместно с карбонильной группой [151, 315, 386, 395, 454, 550, 620]. В связи с этим, можно сказать, что флавоны (имеют 2,3-двойную связь в кольце С) более эффективны, чем флавононы (двойная связь отсутствует), а флавонолы (имеется 3-ОН группа в кольце С), чем флавоны (3-ОН группа отсутствует). Все 3 важные для антиоксидантного действия структурные группировки имеют молекулы флавонолов, поэтому мирицетин, кверцетин и кверцетагетин проявляют наиболее высокую антиоксидантную активность в исследованиях in vitro [81, 125, 151, 169, 278, 386, 423, 454, 522, 532, 555, 577, 620].
В то же время, на сегодняшний день, достаточно трудно делать однозначные выводы о взаимосвязи между структурой и активностью, поскольку отдельные структурные элементы молекул флавоноидов могут проявляться по-разному в зависимости от экспериментальной системы [44, 125, 147, 269, 278, 296, 338, 349, 550, 577, 620, 623], а в гетерофазных системах (клетки, липопротеиды) эффективность флавоноидов во многом определяется их ли-пофильностью и гидрофильностью [151, 269, 278, 379, 550, 620].
Как отмечает Cotelle N., 2001 [315], проблема корреляции между антиоксидантной активностью и химической структурой флавоноидов далека от ясности, и, в основном, связана с тем, какие используются источники радикалов (радиолизис, фотолиз, химическая или ферментативная система) и среда (водная или липидная). Все же, не отрицается и важная роль структурных элементов в проявлении антиоксидантной активности флавоноидов [269, 620]. Конечный же ингибиторный эффект, по мнению авторов [269], будет определяться многими факторами, включая используемую систему, гидрофобность/гидрофильность, общее количество и локализацию ОН-групп у ароматического кольца. Имеется и крайняя точка зрения. Так, Ozgova S. et al., 2003 [522] считают, что определить закономерности структура-активность невозможно, поскольку в разных системах могут быть различными и механизмы антиоксидантного действия флавоноидов.
Сравнительная оценка эффективности и особенности генатозащитного действия флавоноидов и сухого экстракта при остром ССІ4-генатитогепатозе
Были проведены 2 серии экспериментальных исследований на модели острого поражения печени ССЦ при лечебно - профилактическом введении гесперидина, диосмина, флавицина, карсила и сухого экстракта в эффективных дозах, как описано в 2.2.1.
В первой серии, проведенной на 100 белых беспородных крысах обоего пола массой 180-200 г., изучали их влияние на более широкий круг биохимических показателей, являющихся маркерами основных патологических синдромов (цитолиза, холестаза, мезенхимального воспаления и печеночной недостаточности): активности АлАт, АсАт, КФ, ФЛА2, ЩФ, у-ГТП, ХЭ, ТП, содержание мочевины, ТРГ, X, ОБ и его фракций (ПБ и НПБ), общего количества белка, а также альбуминов и глобулинов в сыворотке крови и содержание ТРГ и ФЛ в печени. Интенсивность ПОЛ измеряли по содержанию ТБК-активных продуктов в печени и сыворотке крови, ДК в печени, а также по накоплению МДА при индуцированном Fe -аскорбатзависимом ПОЛ в постъядерной фракции печени (ПФП) при большой концентрации белка в инкубационной среде (ИС) - 3,5-4,0 мг/мл. Оценку АОС проводили путём определения активности в ПФП каталазы, СОД, Г-SP, ГП: общей, (ГП общ.), Se-зависимой (ГП-І) и Se-независимой (ГП-П), МАОР+-редуктазных активностей при использовании в качестве субстратов малата (МДГ), глюкозо-6-фосфата (Г-6-ФДГ) и изоцитрата (ИЦДГ), содержанию GSH в печени, по общей антиокислительной активности (АОА) сыворотки крови и резистентности эритроцитов к спонтанному гемолизу.
В ходе эксперимента регистрировали гибель животных, а также проводили изучение гистоморфологической картины печени у интактных крыс и животных контрольной и опытных групп, получавших флавоноиды, СЭ и карсил (отбирали по 4-5 оставшихся в живых крыс из каждой группы).
Во второй серии на 52 белых беспородных крысах обоего пола массой 190-210 г. изучали влияние исследуемых флавоноидов, сухого экстракта и карсила при остром поражении печени ССЦ на некоторые показатели энергетического обмена и активности отдельных ферментов митохондрий: активности Mg"+-ATOa3bi, СДГ, ЦТО в митохондриальной фракции печени, содержание глюкозы, гликогена, пирувата, лактата и АТФ в гомогенате печени. Оценивали также в этих условиях состояние микросомальной системы окисления. В микросомальной фракции печени измеряли NADH-феррицианид(КзТе(СЪ1)б])- и NADPH-HT-редуктазные, N-деметилазную и п-гидроксилазную активности.
Исследования проведены на 97 белых беспородных крысах-самках массой 220-240 г. и на 52 крысах-самках массой 210-230 г. Использование в эксперименте крыс-самок обусловлено тем, что алкогольное поражение печени у крыс-самок может развиться в более короткие сроки, поскольку равные дозы алкоголя оказывают у самок более выраженные токсические эффекты [79, 122]. Алкогольное поражение печени вызывали путем курсовой алкоголизации в течение 7 дней в результате введения 33% раствора этанола (2 раза в сутки, внутрибрюшинно) в дозе 0,75 мл/ЮОг массы тела животного [112]. Гесперидин, диосмин, флавицин и карсил вводили перорально в дозах 100 мг/кг, сухой экстракт - в дозе 300 мг/кг в течение 5 дней ежедневно до введения спирта этилового и затем продолжали совместно с этанолом еще 7 дней.
Эффективность гепатозащитного действия оценивали по биохимическим показателям (см. 2.2.2), гистоморфологической картине печени и проценту гибели животных контрольной и опытных групп.
Для оценки состояния про-/антиоксидантной системы, энергообмена и микросомального окисления использовали те же показатели, что и в 2.2.2 . Не определяли общую АОА сыворотки крови, но дополнительно изучали активность ГР в ПФП. 2.2.4 Изучение влияния курсового введения флавоноидов, сухого экстракта и карсила на про-/антиоксидантную систему, энергообмен, микросомальное окисление и печеночные показатели у здоровых животных
Опыты проведены на 68 белых беспородных крысах обоего пола массой 170-190 г. (были включены животные для гистоморфологических исследований) и на 42 белых беспородных крысах обоего пола, массой 180-200 г. В течение 12 дней опытные животные получали гесперидин, диосмин, флавицин, карсил в дозе 100 мг/кг и сухой экстракт в дозе 300 мг/кг перорально, в виде водной суспензии. Контролем служила группа животных, которым вводили такой же объём растворителя. Через сутки после последнего введения веществ проводили забой животных опытных и контрольной групп путём декапитации под лёгким эфирным наркозом, голодавших в течение 12-14 часов.
В постъядерной фракции печени измеряли активности СОД, каталазы, ГП0бщ., ГП—I, ГП-И, ГР, Г-SP, МДГ, Г-б-ФДГ, ИЦДГ, интенсивность спонтанного (ПОЛ II) и Fe2+-аскорбатзависимого ПОЛ (ПОЛ I) при концентрации белка в ИС 1 мг/мл. В гомогенате печени определяли содержание ТБК-активных продуктов, ДК, GSH, содержание глюкозы, гликогена, пирувата, лактата и АТФ.
В митохондриальной фракции печени измеряли активности СДГ, ЦТО, Mg -АТФазы. В микросомальной фракции печени изучали N-деметилазную, п-гидроксилазную, NADH: K3[Fe(CN)6]- и NADPH-HT-редуктазные активности.
В сыворотке крови проводили измерение следующих биохимических показателей: активностей АлАт, ЩФ, КФ, ФЛА2, содержания ОБ, глюкозы, ТРГ, X и ТБК-активных продуктов, а также определяли содержания гликогена, ТРГ и ФЛ в печени. Изучали гистоморфологическую картину органа. 2.2.5 Изучение влияния флавоноидов на продукцию NO
Опыты проведены на 55 крысах-самцах линии Wistar, массой 230-250 г. в г. Москве на базе государственного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ» в лаборатории физико-химических методов исследования отдела биохимии НИИЭК (руководитель, проф. Рууге Э.К) совместно с кандитатом физико-математических наук Тимошиным А.А.
Изучено влияние гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина на содержание радикалов NO методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) при использовании Ре3+-ДЭТКт и Бе3+-(МГД)2 в качестве соответственно жиро- и водорастворимых ловушек радикалов оксида азота после индукции ПОЛ ССІ4 и влияние гесперидина на содержание NO в норме при использовании в качестве ловушки Fe" -(МГДь
Гесперидин вводили здоровым животным перорально в дозе 100 мг/кг в течение 5 дней. В качестве контроля служила группа интактных крыс. Комплексы Fe +-(МГД)2 растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия и вводили животным внутривенно (хвостовая вена) в дозе 100 мг/кг массы тела животного, соотношение МГД : FeS04-7H20 10:1. Через 30 мин собирали мочу объёмом 150-300 мкл, которую сразу же замораживали в жидком азоте.
Индукцию ПОЛ ССІ4 вызывали путём однократной внутрибрюшинной инъекции 50% раствора ССЦв вазелиновом масле в дозе 2,5 мл/кг [210]. Флавоноиды животные получали в дозе 100 мг/кг за 3 дня до ССЦ, а затем совместно с ним. Через 24 часа после последнего введения ССЦ (контроль) или совместно с флавоноидами (опыт) животным вводили компоненты ловушки: ДЭТК, 620 мг/кг массы тела - внутрибрюшинно и FeS(V7 Н20 (25 мг/кг массы тела) с цитратом натрия (125 мг/кг) - подкожно, растворенными в воде. Через 30 мин после этого животных декапитировали под лёгким эфирным наркозом, извлекали печень и замораживали в жидком азоте. Fe +-(МГД)г вводили, как описано выше и собирали образцы мочи.
Сравнительная оценка эффективности и особенности гепатозащитного действия флавоноидов и сухого экстракта при остром алкогольном поражении печени
Активность ГДГ измеряли по убыли NADH в реакции восстановительного аминиро-вания а-кетоглутарата в присутствии сыворотки крови (40 мкл) в среде следующего состава: 1/15 М фосфатный буфер, рН 7,8, 10 мМ ЭДТА, 80 мМ а-кетоглутарат натрия, 8 мМ NADH [198]. Количество израсходованного NADH измеряли спектрофотометрически при 340 нм. Падение оптической плотности определяли через каждые 30 сек в течение 3 мин. Активность фермента выражали в мкмоль NADH на 1 л сыворотки за 1 мин, используя коэффициент молярной экстинкции NADH - 6,22-10"3 М" см " .
Для определения содержания билирубина и его фракций (мкмоль/л), глюкозы (ммоль/л), мочевины (ммоль/л), ТРГ (ммоль/л), X (ммоль/л) в сыворотке крови также использовали стандартные наборы реактивов «LaChema» (билирубин, мочевина, холестерин), «Биоконт, Агат» (глюкоза), «ДДС» и «Ольвекс Диагностикум» (ТРГ). Содержание общего белка в сыворотке крови определяли биуретовым методом, белковых фракций - методом электрофореза на бумаге [103] и выражали в абсолютных (г/л) и относительных (в %) единицах.
Количество ТРГ в гомогенате печени (мкмоль/г) измеряли по Gottfried S.P., Rosenberg В. [103]. Стандартный раствор триолеина для определения содержания ТРГ содержал 80% воды для устранения ошибки экстрагирования. Гомогенат печени готовили на 0,85% растворе NaCl в соотношении 1:8 или на 100 мМ трис-HCl буфере, рН 7,4 в соотношении 1:7. Для определения ФЛ в печени использовали метод, основанный на определении концентрации неорганического фосфата (Рн), освободившегося при кислотном гидролизе. ФЛ извлекали из гомогената печени хлороформно-метанольной смесью 2:1 по Bragdon J.H. [292]. Содержание фосфолипидов выражали в мг неорганического фосфора, выделившегося после минерализации липидов по Фиске-Суббароу, на 1 г ткани печени. Измерение содержания неорганического фосфата проводили реакцией с молибдатом аммония [103] и рассчитывали по калибровочному графику. Гомогенат печени готовили, как описано выше.
Содержание гликогена в печени определяли по Montgomery R. (реакция с фенолом в кислой среде после щелочного гидролиза) и выражали в г/кг печени [42].
Для оценки степени фиброза определяли содержание ОП в печени и ГАГ в сыворотке крови. Содержание ОП измеряли в гомогенате печени, приготовленном на 100 мМ трис-НСІ буфере в соотношении 1:7, используя принцип его окисления хлорамином Б (метод Бергмана и Локслей) и конденсации продуктов окисления с п-диметиламинобензальдегидом (реактивом Эрлиха), как описано [199, 236]. Содержание ОП в печени рассчитывали по калибровочному графику и выражали в мг/г.
Количество ГАГ определяли после осаждения их из сыворотки крови раствором цетилпиридинхлорида по содержанию гексоз, которые образуют окрашенные продукты при взаимодействии с орциновым реактивом при нагревании. Интенсивность окраски этих продуктов при 560 нм прямо пропорциональна концентрации гексоз, которую рассчитывали по стандартному раствору гексоз (галактоза+манноза) и выражали в г/л [103, 141]. 2.3.2 Оценка интенсивности переписного окисления липидов
Определение вторичных продуктов ПОЛ проводили по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с использованием диагностического набора "Агат-Мед". Принцип метода основан на том, что продукты ПОЛ в присутствии ортофосфосфата образуют с ТБК окрашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом, интенсивность которого, измеряемая на СФ-46 при длинах волн 535 нм и 570 нм, пропорциональна концентрации малонового диальдеги-да (МДА) [616]. Для расчета использовали коэффициент молярной экстинции МДА -1,56x10 " см" Результаты выражали в мкмоль МДА/л.
Определение ТБК-активных продуктов в печени крыс проводили по методу Ohkawa Н., et al.[513], разработанному для гомогенатов ткани и других биологических образцов. Гомогенат печени готовили на 0,85% растворе NaCl в соотношении 1:8 или на 100 мМ трис-НС1 буфере в соотношении 1:7. Метод основан на превращении гидроперекисей ПОЛ в МДА и окрашивании последнего с ТБК. Спектры окрашенных бутанольных экстрактов измеряли на СФ-46. Расчет производили по разности экстинкции при 535 нм и 520 нм, используя коэффициент молярной экстинции МДА -1,56х105М" см "\ Результаты выражали в нмоль на 1 мг белка в реакционной смеси. Белок определяли по методу Лоури в модификации Миллера [189].
Определение содержания ДК ацилгидроперекисей жирных кислот в гомогенатах печени проводили спектрофотометрически (СФ-46). ДК извлекали смесью гептан:изопропанол (1:1), как описано [134]. Метод основан на способности двойных и тройных связей интенсивно поглощать в ультрафиолетовой области с максимумом поглощения при 233 нм. Количество ДК рассчитывали по молярному коэффициенту экстинкции конъюгированных диенов при 233 нм - 2,2x105М"1см"1 и выражали в нмоль/мг белка. Гомогенат печени готовили на 100 мМ трис-HCl буфере, рН 7,4 в соотношении 1:7.
Интенсивность ПОЛ I и ПОЛ II измеряли in-vitro в ПФП по накоплению МДА при 2-х концентрациях белка в инкубационной среде: 1 мг/мл и 3,5-4,0 мг/мл [115]. При изучении ПОЛ I инкубационная среда содержала 100 мМ трис НС1, рН 7,4; 0,5 мМ аскорбат, 12 мкМ соль Мора. При изучении ПОЛ II не добавляли аскорбиновую кислоту и соль Мора. Реакцию проводили на водяной бане при 37С. Для измерения МДА в нулевое время, через 10, 20, 30 и 60 минут инкубации отбирали по 0,5 мл суспензии, смешивали на холоду с 1 мл 30% ТХУ. Полученную смесь центрифугировали при 3 тыс. об./мин. 15 минут. К надосадочной жидкости добавляли 0,1 мл 5 М НС1 и 1 мл 0,6% ТБК, приготовленного на 0,5 М Na2S04 и нагревали на водяной бане 15 минут при 100С. После охлаждения до комнатной температуры записывали спектр поглощения ТБК-активных продуктов на СФ-46 при 535 нм и 520 нм и рассчитывали количество ТБК-активных продуктов, используя коэффициент молярной экстинкции МДА - 1,56x105 М"1см"\ Результаты выражали в нмоль на 1 мг белка в реакционной смеси.
Активность СОД определяли в ПФП по торможению образования формазана п-нитро-тетразолия хлористого (НТХ) в опытной пробе по отношению к контрольной, не содержащей ПФП, как описано [232 ]. НТХ использовали в качестве индикатора Ог", восстановленную форму которого (формазан) растворяли в ацетоне. Для продукции 0{ использовали фотохимическую систему, содержащую 2,8-10"5 М рибофлавина, 1-Ю"2 М тетраметилэтилендиамина (ТМЕД) в 0,05 М К-фосфатном буфере, рН 7,8 при облучении лампой дневного света на расстоянии 20 см в течение 5 мин при комнатной температуре (25С). Для освобождения СОД из клеточных органелл применяли 0,5% ДОХ. Реакцию останавливали добавлением 20% ТХУ и ацетона. Оптическую плотность регистрировали на КФК-2 при 440 нм. Степень торможения продукции формазана рассчитывали в % и определяли соответствующее проценту торможения количество единиц активности СОД по формуле: Ед. акт. = 10(0,02бх% торможения - 1,3) для ПрЯмолинейного участка кривой (от 20% до 80% торможения продукции формазана) и выражали активность СОД в ед. акт /мг белка.
Активность каталазы определяли в ПФП спектрофотометрическим методом по скорости разложения перекиси водорода. Количество перекиси водорода определяли по реакции с 4% молибдатом аммония. Интенсивность окраски продукта реакции измеряли при 410 нм [131] при температуре 25С. Активность каталазы рассчитывали по разности экстинкции опытной и холостой проб, используя коэффициент молярной экстинкции перекиси водорода, равный 22,2-103мМ"1см"1 и выражали в нмоль/мин/мг белка.
Влияние флавоноидов и сухого экстракта на энергетический обмен при остром алкогольном поражении печени
Полученные нами данные согласуются с результатами целого ряда исследований. Так, например, в работе [342] показано, что спиртовой экстракт из туи западной, содержащий флавоноиды, танин и полисахариды, проявляет более выраженное гепатозащитное действие при поражении печени ССІ4П0 нормализации АлАт, АсАт, ЩФ и ОБ в дозе 400 мг/кг, чем 200 мг/кг, а силимарин эффективен в дозе 100 мг/кг. Установленными эффективными дозами максара и лохеина на различных моделях гепатитов (ССЦ, парацетамол, D-галактозамин) являются 100-200 мг/кг [20, 54, 61, 170, 200, 233]. При изучении гепатозащит-ного действия суммы антоцианов из Hibiscus sabdariffa [262] в дозах 50, 100 и 200 мг/кг выявлено, что наиболее полное восстановление биохимических индексов повреждения наблюдается при применении дозы 200 мг/кг. Наиболее эффективной дозой комплекса флавонои-дов из бархатцев распростертых является 100 мг/кг при поражении печени ССІ4 и индомета-цином [213], а флавоноидов из кожуры цитрусовых - 200 мг/кг [42], при изучении их гепато-защитной активности при остром ССІ4-гепатите в дозах 25, 50, 100 и 200 мг/кг. На модели поражения печени парацетамолом пифламин из травы гороха посевного [248] и сумма флавоноидов из астрагала [586] оказывают выраженное гепатопротекторное действие в дозах 150 мг/кг и 100 мг/кг соответственно, а сухой экстракт из горечавника бородатого в дозе 100 мг/кг - при поражении печени ССЦ и тетрациклином [48]. Танацехол, содержащий в качестве основных компонентов апигенин, лютеолин, диосметин, кверцетин, обладает гепатопро-текторной активностью, эффективность которой более выражена в дозе 100 мг/кг, чем в дозе 50 мг/кг [223]. Эпигаллокатехингаллат (ЭГКГ) уменьшает гепатотоксическое действие ССЦ у мышей в дозе 50 и 75 мг/кг [402], а в дозе 100 мг/кг полностью блокирует повреждение печени у крыс, вызванное алкоголем [369] и конканавалином А - у мышей [368]. Профилактическое введение гесперидина в дозах 100 и 200 мг/кг в течение 7 дней перед затравкой ССЦ (2 мл/кг, подкожно) значительно ослабляет его гепатотоксичность (снижает АлАт, АсАт, ТБК-активные продукты) [418]. Представлены сведения о гепатозащитной активности ди-гидрокверцетина в дозе 100 мг/кг при тетрахлорметановом гепатите у крыс [6].
В то же время имеются данные о проявлении флавоноидами гепатозащитного действия и в более низких дозах. Например, кверцетин в дозе 10 мг/кг снижал гибель животных на 20%, вызванную введением парацетамола [461]. Кверцетин и диосмин в дозе 60 мг/кг уменьшали токсическое действие на печень циклофосфана, парацетамола и винбластина [598], люцерон (50 мг/кг) - ССЦ, тетрациклина и алкоголя [118]. Следует сказать, что в данных работах отсутствуют сведения по эффективности действия флавоноидов в других дозах и представлены данные по их применению только в одной дозе. В работе [554] защитное действие кверцетина при этанол-индуцированном окислительном стрессе исследовано в нескольких дозах - 25, 50 и 75 мг/кг. По результатам этой работы видно, что при повышении дозы от 25 до 15 мг/кг степень снижения активностей АлАт и АсАт увеличивалась. При этом какие-либо другие печеночные пробы авторами не определялись, а также не ясно, происходило бы усиление эффекта при дальнейшем повышении дозы. Как следует из наших данных, наиболее выраженное усиление эффекта практически во всех случаях наблюдалось при повышении дозы от 50 до 100 мг/кг (см. рисунки 3.1-3.5).
Выбор дозы эталонного препарата карсила, в состав которого входят соединения фла-воноидной природы, был проведен в соответствии с рекомендациями фармакологического комитета по доклиническим исследованиям гепатозащитных средств [18], где указывается, что оптимальными терапевтическими дозами в экспериментах на крысах при введении препаратов в желудок для легалона, карсила и силибора являются дозы 100 или 200 мг/кг. По нашим данным [52, 213] установлено некоторое снижение эффективности гепатозащитного действия карсила при лечебно-профилактическом его введении на фоне воспроизведения ССІ4-гепатита в дозе 200 мг/кг по сравнению с дозой 100 мг/кг. В связи с этим препарат сравнения карсил при проведении дальнейших исследований применялся нами в дозе 100 мг/кг.
Учитывая то, что флавицин и СЭ были выделены впервые, проведены исследования по определению их острой токсичности по методу Кербера [190], результаты которых приведены в таблицах 3.11-3.14.
Как видно из приведенных данных, после перорального введения максимально возможной дозы флавицина и СЭ (1 мл раствора на 1 мышку), что соответствует дозе 6000 мг/кг, все животные остались живы. Таким образом, показатель LD5o установить не удалось, но можно утверждать, что LD50 выше, чем 6000 мг/кг.
Наблюдение за выжившими животными не выявило каких-либо отличий от животных контрольной группы по поведению, потреблению корма и воды, интенсивности и характеру движений, реакции на различные раздражители, состоянию волосяного и кожного покровов, окраске слизистых оболочек, частоте и глубине дыхательных движений, размеру зрачка, положению хвоста, количеству и консистенции фекальных масс, частоте мочеиспускания; координация движений и тонус скелетных мышц у животных были в норме. Таким образом, флавицин и СЭ можно отнести к IV классу опасности - малоопасные вещества с LD50 более 5000 мг/кг при пероральном введении [84]. При этом эффективные дозы флавицина (100 мг/кг) и сухого экстракта (300 мг/кг) составляют менее 1/60 и 1/20 от LD50 соответственно. 1. При лечебно-профилактическом введении гесперидина, диосмина, флавицина, кверцетина в дозах 25, 50, 100 и 200 мг/кг и сухого экстракта из горошка обрубленного в дозах 100, 200, 300 и 500 мг/кг на фоне острого поражения печени CCU степень нормализации ряда биохимических маркеров поражения печени увеличивается в интервале доз от 25 до 100 мг/кг для индивидуальных флавоноидов и от 100 до 300 мг/кг для сухого экстракта и в дальнейшем практически не изменяется. 2. Коэффициенты гепатопротекции, рассчитанные для исследованных биохимических показателей и характеризующие процент их восстановления, с повышением доз гесперидина, диосмина, флавицина, кверцетина от 25 до 100 мг/кг и сухого экстракта от 100 до 300 мг/кг повышаются, достигая максимума при дозах 100 мг/кг и 300 мг/кг для индивидуальных флавоноидов и сухого экстракта соответственно. 3. Наибольший процент выживших животных (100%) отмечается при применении индивидуальных флавоноидов в дозе 100 мг/кг, а сухого экстракта - в дозе 300 мг/кг. При увеличении дозы гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина до 200 мг/кг, а сухого экстракта до 500 мг/кг, данный показатель либо не изменяется и остается равным 100% (гесперидин, фла-вицин и диосмин), либо снижается до 87,5% (кверцетин и сухой экстракт). 4. LD50 флавицина и сухого экстракта из горошка обрубленного, определенные при перо-ральном применении на мышах по методу Кербера, составляют более 6000 мг/кг, что позволяет их отнести к IV классу опасности (малоопасные вещества). 5. Эффективными дозами гесперидина, диосмина, флавицина, кверцетина и сухого экстракта при исследовании их в качестве гепатопротекторов на модели острого поражения печени ССЦ являются 100 мг/кг и 300 мг/кг для индивидуальных флавоноидов и сухого экстракта соответственно, что составляет менее 1/60 и 1/20 от LD50 для флавицина и сухого экстракта соответственно.
