Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы современные методы проведения и регистрации результатов биохимических и иммунохимических лабораторных исследований на планарных носителях и направления их усовершенствования 11
1.1. Введение 11
1.2. Принципы получения и обработки изображений при видеоцифровой регистрации 13
1.3. Лабораторные биохимические и иммунологические тесты на планарных носителях 17
1.3.1. Биохимические тесты на планарных носителях 17
1.3.2. Иммунологические тесты, выполняемые на мембранах 25
1.3.3. Агглютинационные тесты на планарных носителях 31
1.4. Лабораторные иммунологические и биохимические исследования на носителях в виде упорядоченных матриц 35
1.4.1. Распространенные иммунологические лабораторные исследования в формате 96-луночного микропланшета 36
1.4.2. Лабораторные исследования в матричных микроформатах и перспективы их развития 45
1.4.3. Технология формата чипов низкой плотности как направление развития тестов «сухой химии» и агглютинационных тестов 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы 56
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 63
3.1. Получение изображений аналитических объектов и принципы построения программного обеспечения для регистрации результатов клинических лабораторных исследований 63
3.1.1. Устройства получения изображений аналитических объектов 64
3.1.2. Общие принципы построения программного обеспечения для клинических лабораторных исследований на основе видеоцифровой регистрации 66
3.2. Оценка характеристик видеоцифрового аппаратно-программного комплекса «Рефлеком» для регистрации результатов иммунохроматографических тестов и тестов «сухой химии» 74
3.2.1. Регистрация результатов ИХ-тестов с применением аппаратно-программного комплекса «Рефлеком» " 76
3.2.2. Биохимические исследования крови на основе тестов «сухой химии» с применением аппаратно-программного комплекса «Рефлеком-БХК» 82
3.3. Оценка характеристик разработанного аппаратно-программного комплекса «Эксперт-Лаб» для регистрации иммунологических исследований в формате стандартного 96-луночного и разработанного 12-луночного планшета 88
3.3.1. Применение комплекса «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов твердофазного иммуноферментного анализа в 96-луночных микропланшетах 89
3.3.2. Применение комплекса «Эксперт-Лаб» для оценки результатов реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакции агглютинации желатиновых частиц 99
3.3.3. Применение и характеристики комплекса «Эксперт-Лаб» для оценки результатов реакции латексной агглютинации 104
3.4. Разработка комплексных систем проведения иммунологических и клинических биохимических исследований в матричном микроформате с видеоцифровой регистрацией 115
3.4.1. Разработка и характеристики систем формирования матриц микрокапель на планарных носителях 115
3.4.2. Разработка мембранных тестов в микроформате с видеоцифровой регистрацией 123
3.4.3.Тесты со смешиванием образцов и реагентов в микроформате 130
Заключение 143
Выводы 145
Практические рекомендации 147
Список литературы 148
Список сокращений 163
- Иммунологические тесты, выполняемые на мембранах
- Получение изображений аналитических объектов и принципы построения программного обеспечения для регистрации результатов клинических лабораторных исследований
- Применение комплекса «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов твердофазного иммуноферментного анализа в 96-луночных микропланшетах
- Разработка мембранных тестов в микроформате с видеоцифровой регистрацией
Введение к работе
Актуальность проблемы
Важнейшая роль лабораторной диагностики в медицине является общепризнанным фактом, в связи, с чем усовершенствование имеющихся и разработка новых вариантов аналитических лабораторных методов на основе использования современных и постоянно развивающихся компьютерных технологий представляется весьма актуальным. Очевидна направленность этих усовершенствований, призванных обеспечить повышение достоверности, точности, снижение времени выполнения и трудоемкости проведения анализов. («Концепция развития службы клинической лабораторной диагностики Министерства здравоохранения Российской Федерации на 2004-2010 годы»).
Одной из важных зон внедрения новых лабораторных методик, основанных на использовании современных информационных технологий регистрации и обработки результатов, являются малые и средние лаборатории, где и в настоящее время большое количество лабораторных исследований проводится на основе визуальной интерпретации. К таким исследованиям относятся иммунологические агглютинационные и преципитационные анализы, тесты «сухой химии», иммунохроматографические тесты, иммунодот- и иммуноблот-анализы.
Важным технологическим направлением развития этих и других лабораторных методов является видеоцифровой компьютерный анализ. Применение видеоцифрового анализа к традиционным тестам с визуальной регистрацией решает задачу документирования и объективизации результатов анализа, что поднимает эти тесты на принципиально более высокий уровень достоверности и аналитической ценности. Видеоцифровой анализ открывает новые возможности и для усовершенствования методов, где применяются обычные варианты фотометрии и рефлектометрии, таких как иммуноферментный анализ, турбидиметрические исследования, тесты «сухой химии».
Другим перспективным направлением усовершенствования лабораторных методик является внедрение микрометодов, обеспечивающих проведение исследований c использованием минимальных количеств реагентов и образцов. Существенные преимущества дает сочетание подходов видеоцифровой регистрации и проведение аналитических процедур в микроматричном формате. Многими научными группами разрабатываются аналитические системы, включающие приспособления для проведения реакций в минимальных объемах и видеоцифровые системы регистрации. Такие системы позволяют создать принципиально новые варианты высокопроизводительных и экономичных методик.
В связи с этим исследования, направленные на разработку и внедрение высокотехнологичных аналитических систем на основе видеоцифрового анализа, обеспечивающих эффективное проведение распространенных клинико-диагностических определений на высоком уровне достоверности, можно считать весьма актуальными.
Цель исследования
Создать новые и усовершенствовать имеющиеся методы проведения распространенных клинико-диагностических исследований с применением видеоцифровой регистрации и оценить на клиническом материале аналитические характеристики созданных лабораторных комплексов и методов.
Задачи исследования:
1. Разработать лабораторные видеоцифровые системы для регистрации результатов латексной агглютинации, пассивной гемагглютинации, изосерологических исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа и биохимических тестов «сухой химии».
2. Сформулировать медико-технические требования к программному обеспечению видеоанализаторов и обосновать алгоритмы оценки результатов специфических аналитических реакций с учетом особенностей их прохождения.
3. Создать стандартизованные методики проведения агглютинационных тестов с документированием, автоматической оценкой результатов, обеспечивающие возможность внутрилабораторного контроля качества исследований.
4. Разработать систему регистрации результатов и планшеты для проведения латексных агглютинационных и изосерологических исследований со сниженным расходом реагентов.
5. Сконструировать приспособления формирования матриц микрокапель на планарных носителях и создать полные аналитические системы, включающие эти приспособления и программно-аппаратные комплексы для регистрации и интерпретации результатов иммунологических и биохимических исследований в микроматричном формате.
6. Провести расширенную апробацию разработанных методов и аппаратуры на клиническом материале в сопоставлении с референсными лабораторными системами и подготовить научно обоснованную методическую базу для внедрения этих методов в практику клинической лабораторной диагностики.
Научная новизна работы
Разработана не имеющая аналогов многофункциональная система регистрации результатов иммунологических исследований на основе сканера.
Впервые разработано программное обеспечение для регистрации результатов латекс - агглютинационных исследований на планарных носителях с количественной оценкой реакций для любых латекс -агглютинационных тестов.
С применением разработанных подходов видеоцифровой регистрации и микрометодов предложены новые, эффективные варианты проведения серийных исследований латексной агглютинации, изосерологических тестов в различных форматах, позволяющие снизить необходимые для анализов объемы реагентов и проб в 10-30 раз.
Разработана, защищенная патентом РФ, полная аналитическая система для проведения матричных дот - иммунологических и биохимических анализов в микро - формате, включающая приспособления нанесения микрокапель образцов и реагентов на планарные носители, видеоанализатор и специализированное программное обеспечение.
Практическая ценность работы
Разработана лабораторная многофункциональная регистрирующая система «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов латекс - и гемагглютинационных исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа. Эта универсальная видеоцифровая система с пакетом программ «Эксперт-Лаб» (Свидетельство о регистрации № 2007613095 в Реестре программ для ЭВМ от 20.07.2007) может рассматриваться как основной лабораторный комплекс, обеспечивающий регистрацию результатов практически всего спектра иммунологических исследований.
За разработку и внедрение системы комплекса «Эксперт-Лаб» присужден Диплом биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007» (Москва, 2007). Разработка видеоцифровых систем для лабораторной диагностики отмечена золотой медалью «Международного салона инноваций и инвестиций» (Москва, 2009).
На основе разработанного аналитического комплекса для матричных дот - иммунологических и биохимических анализов в микроформате с видеоцифровой регистрацией предложены методы серийного дот - анализа альбумина в моче, глюкозы крови, латексагглютинационного метода определения содержания аналитов ревматоидной тройки (СРБ, РФ, АСЛО) и изосерологических исследований, позволяющие в десятки раз снизить объемы реагентов и проб и повысить производительность.
Внедрение результатов работы
Разработанная лабораторная система «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов латекс - и гемагглютинационных исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа внедрена в серийное производство на предприятии ОАО «ЛОМО» (Санкт-Петербург) (Регистрационное удостоверение № ФС 02012006/3617-06 от 10.08.2006). Системы «Эксперт-Лаб» используются в учебном процессе кафедры клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в практике работы КДЛ ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова», НУЗ «ЦКБ №1 ОАО «РЖД», ГУЗ «Московский областной перинатальный центр», ГУЗ ДЦ №1 УЗ ЮЗАО.
Положения, выносимые на защиту
-
Разработанные и научно обоснованные подходы усовершенствования лабораторных методов с видеоцифровой регистрацией реализованы и внедрены в практику в виде многофункциональных программно-аппаратных комплексов, обеспечивающих получение объективных и достоверных результатов широкого спектра биохимических и иммунологических лабораторных исследований.
-
На основе сочетания подходов видеоцифровой регистрации и применения микрометодов создана и реализована в виде полного аналитического комплекса технология проведения биохимических и иммунохимических исследований в матричных форматах в микрообъемах реагентов и образцов.
-
Использование разработанных видеоцифровых систем регистрации результатов иммунологических и биохимических исследований повышает качество и достоверность лабораторных данных за счет объективизации их оценки, сохранения первичного документа теста для ретроспективного контроля.
Личный вклад автора
Автор лично принимала участие в определении направлений, планировании и выполнении исследований: разрабатывала медицинские требования к приборным и аппаратным компонентам программно-аппаратных комплексов и приспособлений для проведения исследований в микроформатах, критерии для алгоритмов регистрации и дискриминации результатов иммунологических исследований, осуществляла оценку разработанных лабораторных методов в сопоставлении с референсными вариантами, сформулировала рекомендации для использования результатов исследований в клинико-диагностических лабораториях.
Апробация работы
Результаты исследования докладывались на совместной научно-практической конференции кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ и проблемной научно-исследовательской лаборатории нуклеинового и белкового обмена ГОУ ВПО РГМУ Росздрава 06 октября 2009года.
Печатные работы
По теме диссертации опубликовано 19 публикаций в отечественной и зарубежной печати, из них в изданиях, рекомендуемых ВАК- 9 работ. Получены патент на изобретение №2325644 от 27.05.2008 и свидетельство №2007613095 «Пакет программ для лаборатории «Эксперт-Лаб» от 20.07.2007.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 163 стр., состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, практических рекомендаций, списка литературы, списка сокращений. Список литературы содержит 149 работ, из которых 44 отечественные источники. В диссертационную работу включены 11 таблиц и 48 рисунков.
Иммунологические тесты, выполняемые на мембранах
Одним из распространенных вариантов иммунологических лабораторных исследований является проведение реакций антиген-антитело для качественных или полуколичественных определений на планарных носителях. В качестве плоских подложек для иммунологических исследований используются разные типы носителей. Это: нитроцеллюлозные мембраны для иммобилизации реагентов (иммунодот, иммуноблот тесты); создающие поток жидкости или проницаемые пористые мембраны (иммунохроматографические и иммунофильтрационные тесты); химически инертные пластиковые или бумажные карты (для тестов латексной агглютинации).
В таких тест-системах, в качестве меток, выявляющих прохождение иммунологических реакций, используются ферменты, коллоидные частицы, флуоресцирующие группы, латексы [23, 111, 117, 128, 129]. Все эти тесты являются удобными объектами для систем ВЦР, а во многих случаях получение и анализ изображения объекта является единственным возможным вариантом регистрации результатов, поэтому далее мы рассмотрим эти иммунологические тесты более подробно.
А. Методы иммунохроматографии и иммунофилыпрации
В иммунохроматографических и иммунофильтрационных тестах сочетается иммобилизация иммунореагентов на мембранах и выявление реакции антиген-антитело за счет формирования окрашенного преципитата сенсибилизированных соответствующими компонентами микрочастиц.
Иммунохроматографические тесты (ИХ) горизонтального потока основаны на создании в пористой мембране за счет капиллярных сил потока смеси исследуемой жидкости с конъюгатом иммунореагента (антител или антигена) с микроскопическими частицами, в качестве которых чаще всего используют частицы коллоидного золота [23, 61, 74]. Создание потока жидкости позволило уйти от процедур отмывки мембран после каждой стадии анализа и свести процедуру анализа к минимальному количеству операций.
Технология ИХ-тестов также как определение глюкозы крови является примером переноса разработок для «домашнего использования» на сферу исследований, проводимых только в клинической диагностической лаборатории. Первым ИХ-тестом, производство которого было начато в крупных масштабах, явился тест для определения хориогонического гонадотропина человека в моче, который использовался и используется для раннего определения беременности в домашних условиях [73]. В этой разработке для визуализации прохождения иммунологической реакции были использованы конъюгаты антител с коллоидным золотом, до этого применявшиеся в основном в гистохимических исследованиях [23, 63].
В настоящее время тесты, основанные на принципе иммунохроматографии, выпускаются для обнаружения широкого спектра маркеров различных патологических состояний и выявления присутствия многих аналитов в биологических жидкостях. В англоязычной литературе за иммунохроматографическими (ИХ) тестами закрепилось название «rapid tests» - «быстрые тесты». Это связано с тем, что все анализа с помощью ИХ-тестов обычно не превосходит 10-15 мин.
ИХ-тесты сравнительно недороги, просты в постановке и не требуют специального дорогостоящего оборудования, содержат все необходимые реагенты, готовы к употреблению, включают обязательный внутренний контроль. Некоторые тесты позволяют проводить анализ образцов цельной крови. Благодаря этому они используются при скрининг-исследованиях для ранней диагностики, и при проведении первичных противоэпидемических мероприятий.
В перечень наиболее часто применяемых входят тесты для определения онкомаркеров, наркотиков, кардиомаркеров, выявления инфекционных заболеваний, изосерологические системы и тесты для оценки гормонального статуса [1, 7, 62, 68, 72, 74, 81, 83, 93, 98, 119, 132]. Обычный «сэндвич» вариант ИХ определения антигенов проводится следующим образом. На стартовый конец полоски наносится исследуемая биологическая жидкость, которая растворяет, находящийся в лиофилизированном виде на фрагменте фильтровальной бумаги конъюгат коллоидного золота с антителами к выявляемому антигену. В ходе капиллярного перемещения вдоль полоски смесь коньюгата и анализируемого образца контактирует с зонами, в которых в виде поперечных линий иммобилизованы антитела к выявляемому антигену (тестовая полоса) и антивидовые антитела (контрольная полоса). Развитая поверхность мембраны обеспечивает достаточно высокую емкость локальных иммуносорбентов, которыми являются эти линии.
При наличии антигена в исследуемой жидкости на этих линиях формируются видимые глазом зоны преципитата меченных антителами частиц коллоидного золота. Вторая - «контрольная» полоса образуется за счет реакции антител, покрывающих частицы коллоидного золота, с антивидовыми антителами и свидетельствует о годном состоянии теста.
Распространен также вариант конкурентного иммуно-хроматографического анализа. В этом случае в тестовой полосе иммобилизуется антиген и применяется конъюгат коллоидного золота со специфическими антителами к этому антигену.
При наличии в исследуемой пробе соответствующего антигена он взаимодействует с антителами на частицах коллоидного золота, что препятствует их связыванию с иммобилизованным на мембране антигеном. Преципитат частиц золота на тестовой полосе не образуется, и контрастная тестовая полоса на мембране после проведения анализа отсутствует. Проявление двух полос при таком варианте анализа означает отсутствие антигена в тестируемой пробе. Такие конкурентные тесты с успехом применяются для определения низкомолекулярных веществ, таких как, например, наркотики, антибиотики и их метаболиты [23, 46, 72, 113, 132]. Иммунофильтрационные мембранные тесты основаны на иммобилизации иммунореагентов в виде точечных зон на специальной пористой мембране, сквозь которую пропускают, как через фильтр, анализируемый образец в смеси с конъюгатом коллоидного золота с соответствующим иммунореагентом. Поток образца обеспечивается за счет того, что фильтрующая мембрана, на которую наносится образец и конъюгат, помещается с плотным контактом на стопку фильтровальной, хорошо впитывающей жидкость бумаги. В данном случае потоки жидкости в ходе анализа направлены вертикально, а результаты проявляются в виде точечных или имеющих другую форму окрашенных зон [53, 149].
Вариант иммунофильтрации в технологической реализации более сложен, чем иммунохроматография, так как требуются дополнительные компоненты, например, промывочный буфер, который удаляет не связанный с иммуноактивными зонами окрашенный конъюгат.
Иммунофильтрационные тесты чаще всего используются для обнаружения антител к различным антигенам. Наиболее востребованы в лабораторной практике такие тесты для определения антител к вирусу иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов [75], к вирусам гепатитов А, В и С [71, 106, 117]. Для скрининговых обследований эти тесты вполне могут быть приравнены к классическим иммуноферментным тест-системам [7], но время выполнения анализ составляет менее 30 минут.
Для определения содержания микроальбумина, СРБ и D-димера в крови и сыворотке разработаны иммунофильтрационные тесты с использованием специального регистрирующего устройства, что дает возможность получения полуколичественных и даже количественных результатов [112].
Получение изображений аналитических объектов и принципы построения программного обеспечения для регистрации результатов клинических лабораторных исследований
Сфера применений видеоцифровых устройств для лабораторных исследований постоянно расширяется благодаря улучшению характеристик серийно выпускаемых сканеров и цифровых камер, разработкам новых технологических решений. Получаемые с помощью видеоцифровых устройств изображения таких объектов лабораторной диагностики, как микропланшеты или тест-полоски после прохождения соответствующих реакций, позволяют получать достоверную аналитическую информацию.
Методы видеоцифровой регистрации (ВЦР) могут быть использованы в качестве альтернативы методам обычной и отражательной фотометрии в приложении к традиционным объектам фотометрических исследований, а в применении к методикам с визуальной регистрацией предоставляют специалисту по лабораторной диагностике такие существенные преимущества как документирование, объективизацию и регистрацию результатов.
В данном разделе описываются общие принципы разработки систем получения изображений аналитических объектов и программного обеспечения (ПО) для регистрации результатов лабораторных исследований на основе технологий ВЦР для различных типов лабораторных методов.
ЗЛЛ.Устройства получения изображений аналитических объектов
На рис. 2 показаны варианты видеоцифровых систем получения изображения, использованных в данной работе, для которых разрабатывалось специализированное программное обеспечение.
На рис. 2(а - в) представлены несколько вариантов систем на основе видеоцифровых камер. Обычная система «Рефлеком» (б) позволяет регистрировать результаты иммунохроматографических тестов, матричных дот-тестов в формате 5x6 в режиме отражения и тестов в формате 3x4 в режиме пропускания. Решенная в виде моноблока с мини-компьютером компактная система «Рефлеком-Компакт» (в) и вариант «Рефлеком-Мини» (а), который с портативным компьютером помещается в кармане, предназначены для работы с иммунохроматографическими тестами в полевых условиях, являются модификацией исходной системы и работают с тем же программным обеспечением.
Системы получения изображения на основе видеокамер и сканеров имеют свои достоинства и недостатки.
Видеоцифровые ПЗС-камеры, используемые нами в разработанных устройствах, компактны, позволяют получать качественные изображения, хотя и с меньшим, чем у сканера разрешением, обеспечивают более высокую скорость съемки, дают возможность конструировать малогабаритные мобильные и более универсальные, чем сканеры, приборы. Сейчас появились видеокамеры на КМОП-матрицах (комплементарная структура металл-оксид-полупроводник; английский эквивалент CMOS - Complementary Metal-Oxide—Semiconductor). Технология CMOS позволяет интегрировать на матрице, кроме светочувствительной области, различные устройства обработки информации и обеспечивает выпуск значительно более дешевых и более доступных видеокамер.
Все системы «Рефлеком» не нуждаются в подключении к электрической сети и в автономном режиме могут питаться от батареи компьютера. К недостаткам систем с видеокамерами относятся: небольшое поле зрения при сохранении компактных размеров устройств, сложности при создании равномерного освещения исследуемого объекта и при регистрации светопропускания. Это ограничивает применение систем на основе видеокамер относительно небольшими по размеру объектами.
Сканеры производятся в массовом количестве, доступны по ценам, дают изображения высокого разрешения, обладают хорошей цветопередачей, однако они в основном приспособлены для работы с плоскими объектами. Из-за больших размеров и требований к электропитанию они используются в основном только как стационарное оборудование. Еще одним недостатком сканеров является необходимость непосредственного контакта объекта с поверхностью сканирующего устройства, что нежелательно при работе с объектами, на которые наносились анализируемые потенциально инфекционно-опасные биологические жидкости. Кроме того, время получения изображения сканером, определяемое скоростью перемещения каретки, составляет несколько десятков секунд, что ограничивает применение сканера для исследований в режиме кинетических измерений.
Существенным достоинством системы «Эксперт-Лаб» является возможность работы с чрезвычайно распространенными лабораторными тестами, проводимыми в 96-луночных планшетах, изображения которых можно получать в режиме пропускания, а затем вычислять аналитические параметры, относящиеся к каждой из 96 лунок планшета.
Важным свойством систем ВЦР является единообразие построения пользовательских интерфейсов и алгоритмов обработки информации, которые не зависят от типа устройства получения изображения. На основе единых принципов построения программного обеспечения, используя алгоритмы обработки информации в соответствии с характеристиками конечных результатов для конкретных типов реакций, на базе видеоцифровых систем удается создать многофункциональные устройства, способные обеспечивать достоверную и объективную регистрацию результатов различных лабораторных исследований.
Общие принципы построения программного обеспечения для клинических лабораторных исследований на основе видеоцифровой регистрации
А. Построение ПО для иммунохроматографических полосок и полосок «сухой химии» с регистрацией в режиме отражения
В настоящее время одним из важных направлений развития экспрессных лабораторных иммунологических и биохимических исследований стали иммунохроматографические тесты и тесты «сухой химии». Иммунологические экспресс-тесты или быстрые тесты ("rapid tests") основаны на принципах иммунохроматографии с использованием в качестве меток частиц коллоидного золота и имеют такие преимущества, как простота выполнения анализа, быстрое получение результата, надежность определений, не требующих высокой квалификации оператора.
В результате исследования на тестовой полоске предусмотрено появление нескольких линий — контрольной, обозначающей пригодность теста, и тестовых, обозначающих наличие или отсутствие определяемого одного или нескольких аналитов. Таким образом, в этом случае объектом регистрации являются контрастные линии.
Номенклатура доступных иммунохроматографических тестов постоянно расширяется, и почти полностью совпадает со спектром распространенных иммуноферментных определений. Однако в лабораторной диагностике иммунохроматографические тесты имеют ограниченное применение из-за проблем, связанных с отсутствием документирования и субъективности оценки результатов.
Применение комплекса «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов твердофазного иммуноферментного анализа в 96-луночных микропланшетах
Одним из самых распространенных методов клинической лабораторной диагностики является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) на основе использования 96-луночных микропланшетов. Разработанный нами аппаратно-программный комплекс «Эксперт-Лаб» с ПО «Эксперт-Лаб ИФА» может быть с использован в качестве вертикального фотометра для микропланшетов при проведении ИФА. Он не уступает по аналитическим характеристикам высококлассным фотометрам с расширенными опционными возможностями.
В данном разделе описывается разработанная нами система «Эксперт-Лаб» с ПО для регистрации результатов ИФА в стандартных 96-луночных планшетах в сопоставлении с результатами, полученными с применением высококлассного вертикального фотометра для различных вариантов иммуноферментных определений.
Референсная регистрация результатов ИФА была проведена на многофункциональном анализаторе «VICTOR 1420» (Wallac, Финляндия) при длине волны 450 нм с обработкой полученных данных с помощью программы "MULTICALC" для количественных тестов.
Воспроизводимость двух систем сопоставлялась при многократных измерениях набора КПА-01 с фильтрами различной оптической плотности.
В табл. 3 показаны суммарные результаты 20 измерений оптической плотности набора фильтров на анализаторе и сканере. В соответствии с техническими требованиями к анализатору «VICTOR» при повторных измерениях одного и того же образца допускается отклонение менее 0,5 AS, а коэффициент вариации должен быть меньше 2%. Очевидно, что сканерный комплекс полностью удовлетворяет этим критериям и данные, получаемые обоими приборами, статистически неразличимы. Однако только эти данные не могут однозначно свидетельствовать об эквивалентности сканера и анализатора, так как использованные стандарты являются «серыми» объектами, имеющими одинаковое поглощение во всем диапазоне длин волн. В отличие от узкополосных лабораторных фотометров, в сканере для получения изображения используется источник «белого» света, причем сигнал регистрируется линейкой состоящей из светочувствительных элементов, каждый из которых регистрирует интенсивность светового потока в трех, довольно широких диапазонах длин волн. Эти диапазоны называются по цветам - R-G-B — то есть красный, зеленый, синий.
Поэтому, чтобы на сканере получать результаты, сопоставимые с данными обычных спектральных приборов, для каждого субстрата подбирались специальные комбинации трех входных цветовых сигналов, реализующие соответствующий ему «программный фильтр». Эта комбинация интенсивностей сигналов и являлась измеряемой для каждого пикселя величиной, которая после усреднения сопоставлялась с данными оптической плотности обычного иммуноферментного анализатора с интерференционным фильтром 450 нм.
На рис. 13 представлено изображение иммуноферментного микропланшета после проведения всех стадий ИФА с применением в качестве хромогенного субстрата ТМБ. Применяя комбинации сигналов разных цветов с различными коэффициентами, удается получать совпадающие с обычным анализатором результаты и при использовании других стандартных субстратов для ИФА.
Для устранения фактора изменения окраски из-за неполной остановки реакции проводилась серия из трех измерений одного планшета через равные промежутки времени (5 мин) на двух приборах поочередно. Сначала проводилось измерение на приборе «VICTOR», затем с помощью системы «Эксперт-Лаб», а потом делали двукратное повторение измерений с интервалом 5 мин. На рис. 14 представлены средние величины этих измерений планшета, изображенного на рис. 13.
Очевидно полное совпадение результатов в диапазоне оптических плотностей от 0 до 3 оптических единиц (коэффициент корреляции по Спирмену - 0,999). При измерении значений оптических плотностей выше 3,0 прибор «VICTOR» выходит за паспортный предел измерений, который для него составляет 3,0, а сканер позволяет измерять значения более высокой оптической плотности. Представленные данные показывают, что система «Эксперт-Лаб» позволяет адекватно определять значения оптических плотностей.
Следующим этапом работы являлась апробация аппаратно-программного комплекса для обычных задач ИФА в КДЛ.
Количественные методы измерений подразумевают построение калибровочной кривой и определение по ней концентрации аналитов. Программа «Эксперт-Лаб ИФА» позволяет ввести значения калибраторов, строить калибровочную кривую и выводить на экран значения концентраций исследуемых веществ. Очевидно, что для количественных вариантов ИФА важно было сопоставить не только значения оптических плотностей, но и значения концентраций. Сопоставительные данные по количественным определениям по «сэндвич» схеме ИФА были получены для следующих аналитов: ТТГ, АТТПО, АТТГ и общего ПСА.
В качестве примера на рис. 15 представлены данные сопоставления результатов определении концентрации АТТГ в образцах сыворотки крови для обычной фотометрической системы и ВЦР системы «Эксперт-Лаб».
Разработка мембранных тестов в микроформате с видеоцифровой регистрацией
А. Серийное определение альбумина в моче в микроформате — тест на микроальбуминурию
Для дот-определения альбумина в моче использовалась схема прямого твердофазного иммуноферментного анализа. При этом пробы мочи наносят в виде упорядоченных матриц точек на мембраны, а затем присутствующий в образцах альбумин выявляется с помощью конъюгата генно-инженерного рецептора альбумина или антител к альбумину с пероксидазой.
На рис. 35 представлено изображение мембраны, на которую с помощью описанного выше аппликатора (шаг 4,4 мм; объем капли 0,5 мкл) нанесены пробы нормальной мочи с добавлением различных концентраций альбумина, после проведения процедуры анализа. Очевидно, что интенсивность окрашивания пятен возрастает с повышением концентрации альбумина в пробах.
Для проведения серийного анализа в качестве оптимального варианта. нанесения был выбран 30-пиновый аппликатор с шагом между пинами 4,4-мм. Были оптимизированы объемы образцов мочи в планшетах, подобраны типы используемых нитроцеллюлозных мембран, а также параметры иммунологической системы детекции, такие как, концентрации конъюгатов время инкубации, состав блокирующего буфера, другие параметры тестов.
После формирования матрицы микрокапель образцов мочи на мембране и проведения всех процедур иммуноферментного анализа результаты анализировали с помощью разработанной и адаптированной к данному типу анализа программы «Видеодот».
На рис. 36 представлены калибровочные кривые для определения альбумина в моче для нитроцеллюлозных мембран разных производителей. Чувствительность определения альбумина в моче для всех образцов мембран была около 10-20 мг/л. Признанным пороговым значением для установления микроальбуминурии является концентрация альбумина 30 мг/л.
Таким образом, можно сделать вывод, что иммунологический тест на микроальбуминурию на основе видеорегистрации в мультидот-формате обладает достаточной чувствительностью и может быть использован в практике, например, для скрининга.
На рис. 37 представлено сопоставление данных определения альбумина в моче разработанным методом серийного дот-анализа и референсным методом иммуноферментного анализа для 67 образцов мочи от здоровых людей и пациентов с сахарным диабетом. Возрастной состав обследованной группы следующий: моложе 30 лет - 3 человека; от 30 до 50 лет - 6 человек; от 50 до 70 лет - 42 человека; старше 70 лет - 16 человек. Установленные диагнозы: сахарный диабет 1-го типа - 2 человека, сахарный диабет 2-го типа- 38 человек.
Результаты показывают удовлетворительное совпадение данных с референсным иммуноферментным методом во всем диапазоне концентраций альбумина в моче у обследованного контингента больных. С помощью предложенного метода серийного определения альбумина в моче можно достоверно определять уровни альбумина, начиная с 10-15 мг/л, что позволяет применять этот метод для выявления микроальбуминурии.
Б.Серийное определение концентрации глюкозы в микроматричном формате
Серийное определение концентрации глюкозы в сыворотке производили с использованием мембран «сухой химии» «Меридиан» фирмы «NDP» (Австралия). На мембрану с помощью описанной системы позиционирования наносили в виде упорядоченной матрицы микрокапли цельной крови с антикоагулянтом или сыворотки крови. Результаты измерений концентрации глюкозы в единицах ммоль/л получали с помощью модифицированной для этого типа анализа программы «Эксперт-Лаб
Видеодот». На рис. 38 показано окно программы «Эксперт-Лаб Видеодот» с калибровочной кривой зависимости интенсивности окрашивания пятен от концентрации глюкозы, таблицей рассчитанных концентраций и дифференциацией образцов по пороговому значению (6,1 ммоль/л).
Разработанный метод серийного измерения глюкозы крови с применением системы матричного нанесения образцов и видеоцифровой регистрации отличается высокой производительностью. С помощью аппликатора на мембрану переносятся сразу 30 образцов крови или сыворотки крови. Время инкубации для проявления цветового пятна на мембране составляет не более 60 секунд. Регистрация результатов производится в течение 30-40 секунд. Таким образом, вся процедура анализа 30 образцов (после заполнения планшета) занимает не более 2-3 минут, причем результаты, представленные в электронной форме, могут сохраняться в базе данных или распечатываться.
