Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Влияние патогенетических факторов травмы на развитие иммунной недостаточности
1.1.1. Оценка тяжести травмы и шока 17
1.1.2 Кровопотеря 20
1.1.3. Гипоксия и развитие оксидантного стресса 23
1.1.4. Нейроиммуноэндокринный дисбаланс 27
1.1.5 Посттравматическая антигенемия 32
1.2. Изменения иммунной реактивности при сочетанной травме 37
1.3. Костномозговое кроветворение при травме 41
1.4. Иммунологические критерии развития воспаления и инфекционных осложнений при сочетанной травме
Глава 2. Материалы и методы исследования 58
2.1. Характеристика обследованных пациентов с сочетанной травмой 58
2.2. Материалы исследования 60
2.3. Лабораторные методы исследования 60
2.3.1. Методы исследования костномозгового кроветворения 60
2.3.2. Методы исследования иммунитета и неспецифической резистентности
2.3.3. Методы оценки активности воспалительного процесса у больных с сочетанной травмой
2.3.4. Исследование парциального напряжения Ог и СОг в вартериальной крови больных с сочетанной травмой
2.3.5. Микробиологическая диагностика гнойных осложнений 66
2.4. Методы статистического анализа 66
Глава 3. Влияние этиологических и патогенетических факторов сочетанной травмы на развитие воспаления у пострадавших (результаты собственных исследований)
3.1. Влияние факторов патогенеза сочетанной травмы - кровопотери, гипоксии, оксидантного стресса на течение и исход травматической болезни
3.2. Содержание медиаторов воспаления в крови пострадавших с сочетанной травмой
3.3. Нейроэндокринная регуляция активности воспаления при сочетайной травме
Глава 4. Костномозговое кроветворение и иммунитет при сочетай- 99 ной травме (результаты собственных исследований)
4.1. Влияние гипоксии и оксидантного стресса на кроветворение 99
4.2. Ранние предшественники гемопоэза в костном мозге постра- 101 давших с сочетанной травмой
4.3. Гранулоцитопоэз при сочетанной травме 103
4.4. Эритропоэз и развитие посттравматической анемии 115
4.5. Моноцитопоэз при сочетанной травме 124
4.6. Лимфоцитопоэз при сочетанной травме 127
Глава 5. Иммунитет и неспецифическая резистентность при сочетайной травме (результаты собственных исследований)
3.3.1. Функциональная активность полиморфноядерных лейкоцитов 140 при сочетанной травме
3.3.2. Функциональная активность моноцитов при сочетанной травме 145
3.3.3. Функциональная активность лимфоцитов при сочетанной травме 155
Глава 6. Значение нарушений костномозгового кроветворения, иммунитета и неспецифической резистентности для прогноза развития ССВО, сепсиса и тяжелого сепсиса у пациентов с сочетанной травмой (результаты собственных исследований)
Заключение 178
Выводы 195
Практические рекомендации 197
Список литературы 1
- Гипоксия и развитие оксидантного стресса
- Методы исследования костномозгового кроветворения
- Содержание медиаторов воспаления в крови пострадавших с сочетанной травмой
- Функциональная активность лимфоцитов при сочетанной травме
Введение к работе
Актуальность исследования. Сочетанная травма, сопровождающаяся развитием шока, является основной причиной смерти среди лиц работоспособного возраста (20-40 лет) (Багненко с соавт., 2010). Летальность при тяжелой сочетанной травме составляет от 10 до 40% (Гуманенко Е.К. с соавт.,2002; Апарцин К.А. с соавт., 2004; Савельев В.С., 2008; Martin G.S. et al., 2003). Основными причинами летальных исходов в постшоковом периоде являются тяжелые гнойные осложнения, в том числе сепсис, и тяжелый сепсис. Инфекционные осложнения тяжелых травм развиваются в среднем у 50–70 % пострадавших, а их частота определяется тяжестью повреждений и шока, степенью расстройств иммунитета (Селезнев С.А. с соавт., 2003; Рожков А.С. с соавт., 2005; Багненко С.Ф. с соавт., 2010; Martin G.S. et al., 2003).
При травматическом шоке средней и тяжелой степени у пострадавших можно наблюдать как признаки синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), так и признаки, характерные для сепсиса и тяжелого сепсиса в соответствии с классификацией, предложенной Bone R.S. (1992) и принятым протоколом по сепсису Калужской согласительной конференции (2004). ССВО рассматривается как ключевое звено развития сепсиса, шока различной этиологии и других критических состояний (в том числе и после травмы). Наиболее тяжелая сочетанная травма и шок, тяжелый сепсис ассоциированы с генерализацией воспаления и развитием полиорганной недостаточности (Faist E., Angele M.K.,1999). В данном случае, очевидно, можно говорить о развитии системного воспаления, ассоциированного со стадийной активацией клеток (нейтрофилов, моноцитов, тканевых макрофагов, тучных клеток, лимфоцитов, тромбоцитов, эндотелиоцитов), секретирующих активные формы кислорода, цитокины, протеолитические ферменты, продукты активации арахидоновой кислоты и другие клеточные медиаторы (Гусев Е.Ю., Черешнев В.А., Юрченко Л.Н., 2007).
В первые часы и сутки после критического воздействия (механическая, ожоговая травма) изменения в иммунной системе носят срочный компенсаторный характер. В последующем, в зависимости от тяжести повреждения и исходной иммунной реактивности, происходит или компенсация изменений или дальнейшее развитие патологических процессов. Развитие иммуносупрессии обусловлено такими системными процессами как гипоксия, гипоперфузия, реперфузия, метаболические нарушения, оксидантный стресс, а при наиболее тяжелой травме и множественная недостаточность органов и тканей, что показано во многих исследованиях (Селезнев С.А., Багненко С.Ф., Шапот Ю.Б., 2004; Калинина Н.М. с соавт., 2005; Гуманенко Е.К., 2006; Vincent J.L., 2002; Brocher A.C., Toft P., 2009). Иммунорегуляторные центры головного мозга, костный мозг, вилочковая железа, селезенка, лимфатические узлы при геморрагическом шоке также находятся в режиме ограниченного кровоснабжения (Багненко С.Ф., Лапшин В.Н., Шах Б.Н., 2004; Raff G. et al., 1993), что существенно влияет на метаболизм клеточных элементов органов иммуногенеза и их функциональную активность.
Известно, что резервом восстановления клеточных популяций различных тканей и их функций является костный мозг. Реакция иммунной системы на повреждающие факторы травмы на первом этапе характеризуется активацией миграции клеток различных популяций из костного мозга в кровь и в очаг воспаления. Активация нейтрофильных гранулоцитов (НГ) крови как основных клеток неспецифической резистентности обеспечивает первую линию защиты от
эндогенной и экзогенной инфекции и развитие острой фазы воспаления (Пинегин Б.В., Маянский А.Н., 2007). Таким образом, нарушения формирования воспаления и различных этапов фагоцитоза при сочетанной травме часто рассматривают как одну из наиболее важных причин развития инфекционных осложнений (Ayala A., Chung C., Grutkoski P.S., 2003). Нарушения функций нейтрофилов как основной популяции, обеспечивающей немедленную антибактериальную защиту, может быть обусловлено также и нарушением различных этапов гранулоцитопоэза в костном мозге при тяжелой травме.
Таким образом, изучение влияния факторов патогенеза сочетанной травмы, сопряженной с развитием шока средней или тяжелой степени, на количественный и качественный состав клеток иммунной системы как в крови, так и в костном мозге, и поиск нарушений в гемопоэзе необходимы для разработки новых способов ранней диагностики гнойных осложнений при травматической болезни.
Степень разработанности темы. Инфекционные осложнения при сочетанной травме и определяемая ими летальность в разные сроки постшокового периода, их прогнозирование и своевременная диагностика продолжают оставаться актуальной научной и клинической проблемой. Новые возможности в решении проблемы связаны с развитием клинической иммунологии и основаны на комплексном динамическом анализе общего состояния и результатов исследования иммунного статуса пострадавших в разные сроки после травмы. Особенности лечения больных с шокогенной сочетанной травмой определяют основное требование к методам прогнозирования осложнений – доступность и быстрота выполнения.
Попытки прогноза тяжести течения травматической болезни состояли в исследовании концентрации в крови различных цитокинов: IL-1, IL-6, TNF. Результаты прогноза в отдельных случаях были мало убедительными (Urbaschek R., 2001). В то же время другими исследователями были получены результаты, подтверждающие возможность прогнозирования развития острой респираторной недостаточности при травме и сепсисе на основании концентрации TNF в сыворотке крови (Eichacker P,Q. et al., 2001), прогрессивного повышения концентраций IL-6, IL-8 и С3а-компонента комплемента в крови (Pape H.C. et al., 2003).
Однако, прогностическое значение иммунологических показателей у пострадавших с сочетанной травмой в ранние сроки после инцидента (1-3 сутки) для развития инфекционных осложнений и выживаемости больных чаще всего ставится под сомнение. Так, Kress H.A. с соавт. (2001) продемонстрировали, что показатели IL-1 и TNF коррелируют с исходом тяжелой сочетанной травмы и риском развития сепсиса только в поздние сроки после травмы, а информативными являются тяжесть состояния по шкале ISS, уровень лактата в крови, парциальное напряжение кислорода и количество лейкоцитов крови в первые 2 дня после травмы.
Таким образом, актуальность данного исследования обусловлена необходимостью поиска ранних маркёров развития гнойных осложнений при сочетанной травме на основе различных иммунологических критериев (концентрация медиаторов воспаления, изменение количественного состава и функциональных характеристик клеток крови и костного мозга), что будет способствовать своевременной диагностике сепсиса и тяжелого сепсиса у данной категории больных и началу адекватной терапии.
Цель исследования
Установить роль нарушений в системе кроветворения и иммунитета в развитии недостаточности противоинфекционной резистентности при сочетанной травме, сопровождающейся шоком, и обосновать алгоритмы ранней диагностики развития гнойных осложнений.
Задачи исследования:
-
Исследовать основные показатели содержания цитокинов, гормонов и медиаторов воспаления у пострадавших с сочетанной травмой в зависимости от тяжести травмы и шока и уровня развития воспаления.
-
Изучить состояние гемопоэза у пострадавших с сочетанной травмой на основе морфофункциональных характеристик ранних и коммитированных предшественников эритро-, миело- и лимфопоэза в костном мозге пострадавших.
-
Изучить состояние иммунитета и неспецифической резистентности на основе исследования функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов крови при сочетанной травме
4. Оценить прогностическую значимость показателей костномозгового
кроветворения и иммунитета для ранней диагностики сепсиса и тяжелого сепсиса у
пациентов с сочетанной травмой.
Научная новизна
Доказана патогенетическая и диагностическая значимость изменений в системе гемопоэза для развития гнойных осложнений у пострадавших с сочетанной травмой
Впервые установлено, что развитие системного воспаления у пострадавших с сочетанной травмой и шоком способствует нарушению проницаемости гематоэнцефалического барьера и появлению в крови пострадавших маркера повреждений головного мозга – белка S100, концентрация которого прямо коррелировала с концентрацией медиаторов острого воспаления (IL-6, IL-10) в первые 12 часов от момента травмы.
Впервые показано, что у пострадавших с сочетанной травмой до 5 суток после травмы в костном мозге сохраняется нормальное или повышенное количество ранних предшественников гемопоэза при одновременном нарушении созревания клеток эритроидного и миелоидного ростков кроветворения (нормоцитов и миелоцитов), прямо ассоциированном с уровнем смешанной гипоксии.
Показано, что развитие анемии у пострадавших с сочетанной травмой связано со снижением количества полихроматофильных и оксифильных нормоцитов в костном мозге и одновременным усилением стресс-эритропоэза с повышенной генерацией ретикулоцитов из полихроматофильных нормоцитов и последующей миграцией их в кровоток.
Впервые установлен комплексный характер функциональной недостаточности нейтрофильных гранулоцитов пострадавших с сочетанной травмой при развитии гнойных осложнений, обусловленной истощением пула зрелых клеток гранулоцитарного ряда в костном мозге, мобилизацией в кровоток функционально незрелых клеток (дефензин – отрицательных гранулоцитов) и развитием оксидантного стресса.
Разработан и научно обоснован алгоритм проведения лабораторного обследования пациентов с сочетанной травмой, сопровождающейся шоком, для раннего прогнозирования развития сепсиса и тяжелого сепсиса.
Теоретическая и практическая значимость работы
На основании проведенного исследования охарактеризован патогенез развития осложнений сочетанной травмы, заключающийся в одновременном нарушении костномозгового кроветворения и иммунитета в остром периоде травматической болезни.
Установлено, что ключевую роль в развитии гнойных осложнений при сочетанной травме играет недостаточность нейтрофильных гранулоцитов, связанная с повышением в крови количества незрелых клеток и снижением количества дефензин-положительных гранулоцитов как в костном мозге, так и в крови пострадавших.
Проведена клиническая оценка целого ряда лабораторных тестов на основе оценки содержания цитокинов и других медиаторов воспаления, функциональной активности клеток крови и костного мозга для ранней диагностики и прогнозирования развития сепсиса и тяжелого сепсиса при сочетанной травме, сопровождающейся шоком.
Показано, что исследование в крови пострадавших с сочетанной травмой таких цитокинов как IL-10 и IL1ra и количества в крови дефензин-положительных нейтрофильных гранулоцитов в первые 24 часа после травмы позволяет с большой вероятностью предсказать развитие тяжелого посттравматического сепсиса на 4-10 сутки.
Продемострировано, что увеличение содержания в крови HLA-DR+ мононуклеаров выше 1,25109/л на 5 сутки после травмы является высокочувствительным диагностическим тестом развития бактериемии у пострадавших.
Использование показателей с высокой прогностической значимостью уже в 1 сутки после травмы позволяет выявить риск развития тяжелых гнойных осложнений у пациентов с сочетанной травмой и может быть рекомендовано для внедрения в практику работы отделений сочетанной травмы отечественных центров скорой помощи.
Положения, выносимые на защиту:
-
Характерными признаками нарушения иммунитета и кроветворения при сочетанной травме, сопровождаемой развитием шока, является снижение содержания дифференцированных клеток-предшественников эритро- и гранулоцитопоэза в костном мозге пострадавших при повышенном количестве ранних клеток-предшественников, что обусловлено уменьшением концентрации в крови гемопоэтических цитокинов (IL-1, IL-2, IL-3, GM-CSF) и увеличением концентрации цитокинов, негативно влиящих на гемопоэз (IL-10, IFN).
-
Системное воспаление, маркёрами которого являются высокие концентрации в крови IL-6 и IL-10 во время травматического шока, ассоциировано с повреждением клеток головного мозга и нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера, о чем свидетельствует повышение содержания в крови пострадавших белка S100.
-
Значимыми факторами развития гнойных осложнений у пострадавших с сочетанной травмой, сопровождающейся шоком, являются функциональная недостаточность нейтрофильных гранулоцитов при дефиците опсонических факторов (иммуноглобулинов) и дисфункция моноцитов в течение первых трёх суток после травмы.
4. Достоверными лабораторными критериями риска развития посттравматического тяжелого сепсиса и системного воспаления являются повышение в крови пострадавших IL-10, IL1ra и снижение содержания дефензин – положительных нейтрофильных гранулоцитов в первые 24 часа после травмы.
Возможные области применения и формы внедрения. Клиническая иммунология, реаниматология, экстренная хирургия, травматология. Экономический эффект от внедрения будет определяться снижением частоты гнойных осложнений, сепсиса и летальности, а также длительности лечения пострадавших с механическими поражениями.
Методология и методы исследования. Для реализации цели исследования и обоснования основных положений были использованы теоретический анализ литературы, лабораторные методы и методы статистической обработки данных.
Степень достоверности и апробация результатов исследования.
Достоверность полученных результатов обеспечена теоретическим анализом проблемы, репрезентативным объёмом выборок обследованных пациентов, достаточным количеством выполненных наблюдений с использованием современных методов исследования и адекватным статистическим анализом данных.
Основные положения работы, а также содержание её отдельных этапов были представлены на VII Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", Санкт-Петербург (2003); VII Всеармейской международной конференции «Актуальные вопросы профилактики, диагностики и терапии хирургической инфекции», Москва (2007); Объединённом иммунологическом форуме, Санкт-Петербург (2008); VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Санкт-Петербург (2009); X конгрессе по аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии, Казань (2009); VI Российской конференции по нейроиммунопатологии, Москва (2010); XIV Всероссийском научном Форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург (2011); III Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Санкт-Петербург (2011); Всероссийской научно-практической конференции «Совершенствование медицинской помощи больным с нейротравмой и пострадавшим в ДТП» совместно с научно-практической конференцией «Скорая медицинская помощь 2011», Москва (2011); VII Конференции по нейроиммунопатологии, Москва (2012); IV международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Москва (2013); Объединённом иммунологическом форуме, Нижний Новгород (2013). Сделано 2 научных доклада на заседаниях общества иммунологов Санкт-Петербурга (2012), на заседании проблемной комиссии и Ученого Совета Санкт-Петербургского НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе (2013).
Результаты исследования внедрены в практическую деятельность отдела анестезиологии и реанимации, отделения сочетанной травмы, отделения лечения сепсиса и тяжелого сепсиса ГБУ «Санкт-Петербургский НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе».
По теме диссертации опубликовано 41 работа, в их числе 16 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях.
Личное участие автора. Диссертант лично участвовал в планировании и организации работы, проведении большей части лабораторных исследований, обработке, анализе, обобщении и представлении полученных данных.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 242 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав результатов собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 87 таблицами. Список литературы включает 393 публикаций, из них 99 – отечественных авторов и 294 – зарубежных.
Гипоксия и развитие оксидантного стресса
Кровопотеря, являющаяся главной причиной нарушения центральной гемодинамики и микроциркуляции в органах и тканях, приводит к выраженным нарушениям гомеостаза: развиваются биохимические сдвиги в крови и тканевых жидкостях [15, 99, 211], изменяется обмен газов в организме [10], метаболические процессы характеризуются преобладанием катаболизма белков [20, 327, 381], активацией перекисного окисления липидов и гликолити-ческих процессов [25, 370].
В органах, испытывающих дефицит поступления питательных веществ, микроэлементов и кислорода, изменяется активность клеточных элементов, в том числе и тканевых макрофагов, что может приводить к нарушению основных функций того или иного органа или системы. Во время шока снижается секреторная, экскреторная и сорбционная функции печени и почек [15, 37]. Изменения функций легких зависят не только от нарушенной гемодинамики, но испытывают мощные влияния со стороны эффекторных клеток иммунной системы [101, 160, 176]. Формируется эндогенный травматический токсикоз [55, 83, 162].
Однократная дозированная острая кровопотеря, превышающая 20% объема циркулирующей крови (ОЦК), угнетает гуморальный иммунный ответ мышей на эритроциты барана в соответствии с увеличением объема кро-вопотери [5]. По данным Abraham Е. et al. (1986) [100] кровопотеря при случайной и операционной травме приводит к снижению функциональной активности Т-лимфоцитов. Так, геморрагический шок у крыс в объеме 30 % ОЦК вызывал снижение продукции IL-2 лимфоцитами крови в течение 2 часов на 90%, которое не зависело от числа лимфоцитов и уровня глюкокорти-коидов в крови. При тяжелой механической травме, когда наряду с кровопо-терей присутствуют обширное повреждение тканей, стресс и антигенемия, снижение уровня IL-2 в крови наблюдается в течение 3-21 суток после травмы [184]. Угнетение продукции IL-2 Т-лимфоцитами и снижение проли-феративной активности Т- и В-лимфоцитов опосредуется также простагландином Е2 (PGE2), который образуется при циклооксигеназном пути превращений арахидоновой кислоты в активированных моноцитах/макрофагах [185, 186,188,358].
Ишемия, возникающая вследствие централизации кровообращения, приводит сначала к стимуляции, а затем к угнетению кроветворения в кост 22 ном мозге [15]. Растёт выброс в кровь незрелых клеток-предшественников иммунокомпетентных клеток, которые характеризуются функциональной неполноценностью. Кроме того, ишемия кишечника приводит к повышению проницаемости кишечного барьера для бактерий и токсинов [128, 209], что вызывает стимуляцию иммунитета, а при длительном воздействии может приводить и к иммуносупрессии. Феномен транслокации бактерий со слизистых оболочек, в том числе из желудочно-кишечного тракта, является причиной значительного числа госпитальных инфекций и депрессии иммунитета после травмы [7, 35, 165, 224]. По мнению Nakayama М. et al. (1997) [302] транслокация оказывает стимулирующее влияние на иммунитет. Многие исследователи считают кишечник важнейшим иммунным органом, в котором осуществляется непрерывная антигенная стимуляция. Липополисахарид -компонент оболочки бактерий, активирует CD14+ моноциты и макрофаги, продукты которых вызывают нарушение проницаемости эндотелиального слоя микрососудов кишечной стенки [122, 276]. Toll-like-рецепторы индуцируют передачу сигнала, приводящего к синтезу и высвобождению цитокинов и других медиаторов, таких как АФК [97, 380]. Увеличение содержания в крови PGE2 и IL-10 ассоциировано с развитием иммуносупрессии [186]. Им-муносупрессия может объясняться, по мнению Sfeir Т. et al. (2001) [341], нарушениями в представлении антигена и дефицитом специфических иммуноглобулинов.
При шокогенной травме средней и тяжелой степени и выраженной кро-вопотере значительное число пострадавших получает трансфузии консервированной донорской крови, что может приводить к аллоиммунизации [370, 373]. Иммуногенность крови связана с лейкоцитарными и тромбоцитарными поверхностными антигенами и другими связанными антигенами. Идеальным и перспективным приемом модификации эффекторных механизмов клеточной деструкции после гемотрансфузий считается специфическое угнетение фагоцитоза и лимфоцитопосредованной цитотоксичности [99, 352], что очевидно, мало приемлемо при посттравматической иммунодепрессии. У боль 23 шинства пострадавших в остром периоде травматической болезни потребление кислорода возрастает. Это диктует необходимость обеспечить максимальную доставку кислорода, в том числе увеличив кислородную емкость крови путем гемотрансфузий [99]. Вместе с тем, кислородная емкость крови напрямую связана с содержанием в ней гемоглобина. Переливание эритроци-тарной массы - необходимый компонент терапии тяжелого шока и острой кровопотери, но показания к гемотрансфузий до сих пор нуждаются в уточнении [370, 373]. Иммуногенность крови связана с лейкоцитарными и тром-боцитарными поверхностными антигенами и другими связанными антигенами. Однако исследованиями Angele М. (2002) [112] показана высокая эффективность гемотрансфузий или компонентов крови при массивной кровопоте-ре более 3000 мл для повышения выживания пострадавших.
По данным отчета Американской ассоциации банков крови, в развитии трансфузиологии представляется перспективным: уменьшение внеопераци-онного использования крови, в частности, за счет уточнения показаний к гемотрансфузий [373]; уменьшение потребности в повторных трансфузиях за счет переливания молодых эритроцитов [192]; активация эритропоэза с помощью рекомбинантных цитокинов, например, эритропоэтина [155, 157]; продуцирование клеток крови in vitro методами культивирования.
Методы исследования костномозгового кроветворения
Тяжесть травмы оценивали, рассчитывая балл шокогенности травмы (БШТ) по шкалам Г.И. Назаренко (1988) [92] и ISS (Injury Severity Score) [121]. Развитие ССВ О, сепсиса и тяжелого сепсиса определяли по наличию признаков, представленных в рекомендациях Калужской согласительной конференции (2004) [92]. Тяжесть полиорганной недостаточности, связанной с сепсисом, оценивали по шкале SOFA - sepsis related organ failure assessment score -принятой Европейским обществом интенсивной терапии [372].
На догоспитальном этапе 100% пострадавших получили медицинскую помощь и были доставлены в стационар реанимационно-хирургическими бригадами. На месте происшествия и во время транспортировки все пациенты получили лечение, включавшее остановку наружного кровотечения, транспортную иммобилизацию, обезболивание наркотическими анальгетиками, инфузии растворов кристаллоидов (400-1500 мл), в половине случаев вводили холино-литики (атропин), в 20% случаев - седативные препараты (реланиум) и в 85% -глюкокортикостероиды (60-240 мг преднизолона однократно).
Обследование и лечение пострадавших в стационаре начинали в противошоковой операционной, где выполняли стандартный комплекс исследований и противошоковой терапии, включающей хирургические противошоковые мероприятия (обеспечение внешнего дыхания, остановка кровотечения и стабилизация переломов). У всех пострадавших с сочетанной травмой констатировали тяжелую степень кровопотери, объем которой составлял в среднем 2325 мл (от 1600 до 3500 мл). Все пострадавшие получили инфузии эритроци 60 тарной массы (от 199 до 849 мл) и свежезамороженной плазмы (от 500 до 1250 мл). Антибактериальную терапию во всех случаях начинали со стандартной комбинации препаратов (цефалоспорин 1-2 поколения + аминогликозид + метронидазол). При травмах с шоком III степени использовали цефалоспорин 3 поколения - цефтриаксон.
Материалом исследования служили кровь и пунктаты костного мозга пострадавших с сочетанной травмой. Для проведения исследований из цельной крови кровь забирали из кубитальной вены в стандартные вакуумные пробирки VENOJECT II Lithium Heparin LH STERIL и VENOJECT II Clot Act. Z STERIL (Belgium) для выделения сыворотки. Костный мозг получали пункцией губчатых костей по методу Аринкина с помощью иглы Кассирско-го, имеющей щиток-ограничитель, который можно установить на необходимую глубину в зависимости от толщины кожи и подкожной клетчатки. Пунктировали грудину в области рукоятки или верхней трети ее тела (на уровне 3 - 4 ребра) по средней линии.
Исследование крови пострадавших проводили при поступлении в противошоковое отделение, через 24 часа, на 3, 5, 10 сутки после травмы. Исследование костного мозга проводили в течение первых 24 часов после поступления в стационар, на 3 и 5 сутки после инцидента.
Из пунктата костного мозга готовили мазки (окраска по Май-Грюнвальду с докраской по Романовскому-Гимзе). Также выделяли фракцию мононуклеаров на фиколл-верографиновом градиенте плотностью 1,077 г/л. Фенотипирование субпопуляций мононуклеаров (CD) проводили иммуноци-тохимическим методом с использованием моноклональных антител (Novo 61 castra, UK). Перечень изученных субпопуляций мононуклеаров костного мозга представлен в таблице 7.
Фагоцитоз, антителозависимая цитотоксичность, рецептор Fc-фрагмента IgG NK-лимфоциты, нейтрофилы, макрофаги
Гематологическое исследование выполняли на автоматическом анализаторе КХ-21 (Sismex). Оно включало в себя общеклиническое исследование крови, с обязательным определением: 1 .Количества эритроцитов 2.Количества ретикулоцитов 3.Гемоглобина 4.Гематокрита
Среднего объема эритроцитов (MCV) 6.Ширины распределения эритроцитов по объему (RDW) 7.Среднего содержания гемоглобина в эритроците (МСН) 8.Средней концентрации гемоглобина в эритроците (МСНС) 9.Количества лейкоцитов 10.Количества тромбоцитов
Иммунофенотипирование фенотипических и активационных маркеров клеток крови с помощью иммуноцитохимического метода (Novocastra, UK).
Для постановки реакции из 4 мл венозной крови выделяли мононук-леары крови на градиенте плотности фиколл-верографина (плотность 1,077) и нейтрофильные гранулоциты (плотность градиента 1,119) [136]. Чистота выделения клеточных популяций составляла 90-97%. Клеточную суспензию дважды отмывали при центрифугировании (1200 об/мин) в 10 мл среды Хен-кса без фенолового красного. Исследовали содержание CD3, CD4, CD8, CDllb, CD16, CD18, CD20, CD25, HLA-I, HLA-DR - положительных моно-нуклеаров и Defensin - положительных нейтрофильных гранулоцитов. Образцы последовательно инкубировали:
Для большинства моноклональных антител достаточно 10-минутной инкубации. Для каждой новой серии специфических и связывающих и /или антител с меткой подбиралась оптимальная рабочая концентрация в разведении от 1:10 до 1: 300 в зависимости от качества реагента. Оптимальная концентрация антител - это наименьшая концентрация, при которой позитивные клетки еще имели интенсивное специфическое окрашивание. Эту концентрацию принимали за рабочий титр антител. Использовали максимально возможное разведение, так как это снижало интенсивность неспецифического фонового окрашивания.
При микроскопии идентифицировали окрашенный продукт иммуно-ферментной реакции (черно-коричневый) при использовании диаминобензи-дила в качестве хромогена, образующийся в местах связывания выявляемых антигенов. Учет результатов проводили в световом микроскопе при суммарном увеличении х 900 (окуляры 15, объектив 60) или с использованием масляной иммерсии(окуляры 15, объектив 90). Положительно окрашенной считалась клетка, по окружности которой окрашенный продукт реакции занимал не менее трети. Подсчет проводили на 200 клеток, определяли процент положительно окрашенных клеток.
Содержание медиаторов воспаления в крови пострадавших с сочетанной травмой
На продукцию ЕРО в организме человека также влияет содержание в крови и тканях про- и противовоспалительных цитокинов. Известно, что IFNy оказывает отрицательное воздействие на продукцию ЕРО [45]. У больных 1 группы мы наблюдали уровень IFNy, не превышающий нормальные значения, тогда как в 2 группе пациентов - 2-кратное превышение уровня IFNy в сыворотке крови через 24 ч после травмы (таблица 20). При этом уровень IL-6 (таблица 23), положительно влияющего на продукцию ЕРО, существенно повышен вплоть до 3 суток после инцидента.
При исследовании костного мозга пострадавших мы наблюдали снижение количества эритроцитарных предшественников вплоть до 5 суток после травмы вне зависимости от тяжести травмы и шока. Данная картина была обусловлена снижением количества полихроматофильных нормоцитов (ПХН), т.е. клеток с наибольшим числом рецепторов к эритропоэтину (таблица 50). При этом содержание базофильных нормоцитов оставалось в пределах нормы с момента поступления. Содержание ранних коммитированных предшественников, таких как эритробласты, наоборот повышено уже на 3 сутки (таблица 49). Это говорит об усилении пролиферации стволовых клеток при индуктивном эритропоэзе, направленном на восстановление пула циркулирующих эритроцитов после кровопотери. Уровень наиболее зрелых окси-фильных нормоцитов (ОФН) оставался достоверно сниженным до 3 суток после травмы (таблица 51).
Таким образом, на уровне высокого гипоксического стимула у пациентов с шокогенной СТ происходит активация эритропоэза, что выражается в увеличении количества ранних клеток-предшественников эритропоэза в костном мозге. Однако наиболее чувствительными к воздействию гипоксии и травматического токсикоза оказываются дифференцированные клетки (в данном случае - полихроматофильные нормоциты), количество которых снижается сразу при поступлении и остается низким вплоть до 5 суток после травмы. При этом содержание полихроматофильных и оксифильных нормоцитов в костном мозге достоверно коррелировало с уровнем Ра02 в крови на 5 сутки после травмы (г=- 0,78, Р 0,01 для ПХН и г=- 0,88, Р 0,01 для ОФН).
Период созревания от проэритробласта до ретикулоцита составляет примерно 120 ч (в среднем 24 ч на каждую стадию развития). Однако поли-хроматофильные нормоциты могут без деления созревать до оксифильных нормоцитов и больших ретикулоцитов, которые затем поступают в кровь. Этот путь развития, характерный для эритропоэтических стрессов - при острой массивной кровопотере, гемолизе - по времени экономит около 70 ч (за счет уменьшения на 50% числа эритроцитов, образующихся при нормальном пути развития в 3-5 клеточных генерациях) [24].
В условиях физиологического эритропоэза ретикулоциты находятся в крови около 1-2 суток до их полного созревания и составляет 0,8-1,2% всех эритроцитов крови. Однако у пациентов с повышенной продукцией эритроцитов более крупные и менее зрелые ретикулоциты ( стресс»-ретикулоциты) освобождаются из костного мозга и дольше циркулируют в крови. Так, при соответствующем эритропоэтическом стимуле ретикулоциты могут полностью перемещаться в периферическую кровь, увеличивая таким образом в несколько раз число циркулирующих ретикулоцитов[24] .
Мы наблюдали массированный выход ретикулоцитов из депо костного мозга в русло крови, что, однако, не обеспечивало полноценного восстановления количества зрелых эритроцитов. Содержание ретикулоцитов в крови пострадавших всех групп (таблица 52) существенно возрастало с момента поступления до 10 сут. после инцидента.
Таким образом, воздействие факторов патогенеза сочетанной травмы, таких как кровопотеря, смешанная гипоксия, антигенемия и развитие окси-дантного стресса, приводит к нарушению процессов эритропоэза на уровне дифференцированных клеток-предшественников. Несмотря на нормальный уровень ранних клеток-предшественников в костном мозге пострадавших снижалось количество полихроматофильных нормоцитов, что, вероятно связано с усилением стресс-эритропоэза и генерацией ретикулоцитов из полихроматофильных нормоцитов и последующей миграцией их в кровоток. При этом восстановление эритропоэза у пациентов с СТ и шоком II степени обеспечивается физиологическими механизмами, связанными с нормальным уровнем продукции ЕРО на фоне нормального уровня кислорода, тогда как у больных с более тяжелой травмой,на фоне снижения уровня ЕРО восстановление эритроидного пула осуществляется резким усилением костномозгового кроветворения на фоне сохраняющегося гипоксического стимула с более интенсивной миграцией клеток эритроидного ряда из костного мозга в кровоток. Факторами, обусловливающими нарушение эритропоэза у пациентов с шоком III степени можно также считать развитие оксидантного стресса [60, 262, 268], почечной недостаточности и кратковременным увеличением (в первые 24 часа) в крови цитокинов, негативно влияющих на эритропоэз (IL-10,IFNy)[382].
Клетки, объединенные в систему мононуклеарных фагоцитов, включают костномозговые предшественники, пул циркулирующих моноцитов и тканеспецифичные макрофаги. Ранние коммитированные предшественники моноцитов дифференцируются в пролиферирующий пул монобластов и про-моноцитов, являющихся наиболее ранними морфологически дифференцире-мыми клетками системы мононуклеарных фагоцитов в костном мозге. Диф-ференцировка монобластов в моноциты происходит в костном мозге в течение 5 дней, после чего моноциты выходят в кровоток, не создавая, в отличие от гранулоцитов, костномозгового депо[24].
Морфологическое исследование препаратов костного мозга не выявило существенных различий между содержанием клеток моноцитарного ряда у пациентов исследуемых групп (таблицы 53,54).
Функциональная активность лимфоцитов при сочетанной травме
В нашем исследовании независимо от тяжести травмы и шока количество мононуклеаров, экспрессирующих CD25 оставалось в пределах нормы в течении всего периода наблюдений.
Индукция клеточной цитотоксичности связана, прежде всего, с продукцией и секрецией Т-хелперами 1 типа интерлейкина-2, уровень которого в крови снижался, по данным Puyana J.C. (1998) [322], до 10-14 дня после тяжелой механической травмы. В нашем исследовании уровень IL-2 в крови оставался низким на протяжении всего периода после инцидента у пациентов обеих групп (таблица 62). Однако, количество клеток, экспрессирующих CD25, свидетельствовало о том, что они испытывали активирующее воздействие IL-2 в органах иммуногенеза (тимусе, лимфатических узлах, лимфоидной ткани слизистых оболочек).
По современным представлениям, характер иммунного ответа во многом зависит от доминирующего участия ТЫ- и Т1і2-субпопуляций лимфоцитов, которые различаются по спектру продуцируемых ими цитокинов. Так ТЫ- лимфоциты, продуцируя IL-2, IFNy и ряд других цитокинов, усиливают клеточный иммунный ответ, который играет существенную роль в регуляции противовирусного иммунитета. Формирование гуморального иммунного ответа, являющегося важнейшим компонентом противобактериальной защиты, происходит под влиянием Т1і2-цитокинов - IL-4, IL-10 [45]. Усиление продукции иммуноглобулинов, прежде всего IgA и IgG, является как механизмом эффективного ограничения активности воспаления, так и регуляции агрегатного сотояния крови [183].
Как уже было сказано выше, содержание IL-4, как основного цитокина Th2, в крови пострадавших с сочетанной травмой увеличивалось у больных 2 группы, тогда как у пациентов 1 группы содержание IL-4 не отличалось от нормы (таблица 21). Тогда как, содержание IFNy (цитокин ТЫ) у больных 1 группы при поступлении было в пределах нормы и было снижено на протяжении всего периода наблюдения. У больных 2 группы наблюдается нарастание содержания IFNy через 12 часов после инцидента и сохраняется высо 161 ким в течение 1 суток после травмы (таблица 20).
Существуют мнения, что Т-лимфоцитопения в крови, развивающаяся после тяжелой механической травмы, обусловлена гиперкортизолемией, индуцирующей апоптоз Т-лимфоцитов [94]. В нашем исследовании у всех пациентов в течении первых суток наблюдалась кортизолемия, причем уровень кортизола у пациентов 2 группы был выше нормы в 3-6 раз. Корреляционной зависимости между количеством Т-лимфоцитов и уровнем кортизола в крови в раличные сроки наблюдения не было выявлено. Следует отметить, что наблюдалась корреляционная зависимость уровня кортизола в крови и тяжести травмы (БШТ, г=0,62), а также зависимость БШТ и количества CD3+-лимфоцитов при поступлении (г=0,49).
Также способствуют развитию Т-лимфопении в первые 3 суток после травмы такие факторы, как усиление миграции лимфоцитов в ткани [5], а также дефицит факторов лимфопоэза (растворимых пептидов тимуса, цито-кинов-лимфопоэтинов: IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 и др.) [194, 259, 264].
Таким образом, одним из основных компонентов иммунной недостаточности при сочетанной травме является остроразвивающая Т-лимфоцитопения, сохраняющаяся у больных с шоком III степени до 3 суток после инцидента и обусловленная недостатком CD4+ лимфоцитов при сохранении числа CD8+ клеток и числа активированных лимфоцитов CD25+. При этом уровень Т-лимфоцитопении не зависит от уровня кортизола в крови, однако может быть следствием недостатка медиатора, стимулирующего пролиферацию лимфоцитов - IL-2.
Во время шока снижение абсолютного числа В-лимфоцитов (CD20+) по сравнению с нормой наблюдалось у пострадавших 2 группы. К 3-ым суткам после травмы у пострадавших этой группы В-лимфопения (в среднем в 2 раза ниже, чем у доноров). Восстановление числа В-лимфоцитов в крови у пациентов с шоком III происходило к 5-ым суткам после травмы (таблица 82).
При травме изменения со стороны гуморального иммунитета характеризуются снижением антителообразования, угнетением пролиферативной активности лимфоцитов [272]. Иммуноглобулины сыворотки играют важную проль в поддержании гомеостаза при острой кровопотере и шоке, участвуя в регуляции клеточной активности и воспаления, реакциях фагоцитоза. При поступлении были снижены уровни иммуноглобулинов вех IgA, IgM, IgG за счет тяжелой кровопотери, а также гемодилюции при последующем восстановлении объема циркулирующей крови пр проведении противошоковых мероприятий. Концентрация IgA в сыворотке крови у пациентов обеих групп снижена по сравнению с нормой до 3 суток после травмы (таблица 83). При этом наблюдали достоверное снижение данного показателя у больных 1 группы с летальным исходом по сравнению с выжившими пациентами на 1 и 3 сутки наблюдения. При этом IgA является важным фактором противобак-териальной резистентности слизистых оболочек.
Изменения в иммунной системе после механической травмы различной степени тяжести обусловлены тяжестью повреждения тканей и шока, а также, компетентностью иммунной системы пострадавших до инцидента. Синдром системного воспалительного ответа (ССВО) рассматривается как ключевое звено развития критических состояний и сепсиса. Клинические и лабораторные признаки развития ССВО представлены в классификации Bone R.S. (1992) и материалах Калужской согласительной конференции (2004). При сочетанной механической травме, сопровождающейся развитием шока, признаки системного воспалительного ответа наблюдаются уже в течение 1 часа после воздействия повреждающего фактора. Обычно ССВО рассматривают как фазу развития, возможно переходящую в сепсис.
Как показывают наши исследования, травматический шок различной тяжести ассоциирован с ССВО, но не обязательно перерастает в сепсис или тяжелый сепсис. Так у 32% пострадавших с шоком II степени не наблюдали развития гнойных осложнений. Адаптивный вариант реакции на травму проявлялся в развитии системного воспалительного ответа на повреждение тканей, характеризовался как пролиферацией моноцитов, так и активацией их функций. В первые сутки после травмы наблюдали умеренно выраженную активацию нейтрофильных гранулоцитов, транзиторную Т- и В-лимфопению и увеличение содержания в крови медиаторов острой фазы воспаления. При этом уровень хемилюминесценции как реакции исключительно индуцибель-ной (например, бактериальными антигенами или воспалительными цитоки-нами) сохранялся в пределах нормальных значений, отражая состояние инфекционного благополучия.
