Введение к работе
Актуальность исследования
Метод мукозальной иммунизации, предложенный в конце XIX начале XX веков Д.К. Заболотным, И.Г. Савченко, А.М. Безредка, привлекал внимание исследователей на протяжении всех этапов развития вакцинологии.
Полученные в работах данные касались разных методов введения вакцин через слизистые оболочки и были проанализированы в рамках тех теоретических представлений, которые преобладали в иммунологии того времени [Першин Б.Б., 1964; Дроздов В.Н., 1965; Александров Н.И., Гефен Н.Е., 1969; Воробьев А.А., 1971; Мешалова А.Н., 1974; Краснопрошина Л.И., 1978 и др.]. В этот период были выявлены основные характеристики мукозальных методов иммунизации, в том числе меньшее сенсибилизирующее действие антигенов по сравнению с парентеральным способом их введения.
Последние десятилетия характеризуются прорывом в исследованиях клеточных и молекулярных механизмов регуляции иммунитета, особенно роли врождённого иммунитета и его инструктивного значения в развитии адаптивного иммунитета. Данные исследования проведены в основном при использовании парентеральных методов иммунизации и лишь фрагментарно касаются мукозальных способов введения антигенов [Ахматова Н.К., Киселевский М.В., 2008; Kumar P. et al., 2013; Yan H., 2013].
В настоящее время возникла необходимость в обобщении данных по молекулярно-клеточным механизмам, задействованным в формировании мукозального иммунитета, так как до 90% патогенов проникают в организм через слизистые оболочки. Важное преимущество мукозальная иммунизация приобретает в условиях расширяющегося Национального календаря прививок. В настоящее время один ребёнок получает до 20-30 прививок в год.
Однако число мукозальных вакцин, разрешённых для применения в практике, невелико, что связано с теоретическими и технологическими сложностями конструирования таких препаратов и недостаточностью данных о характеристике иммунитета, создаваемого при их применении [Семёнов Б.Ф., Зверев В.В., 2007, 2010; Barisani-Asenbauer T. et al., 2013].
Большое значение на первых этапах распознавания микробных антигенов имеет способ их введения, определяющий набор рецепторов, взаимодействующих с лигандами микроорганизмов и, соответственно, сигнальные пути дальнейших этапов развития врождённого, а в последующем адаптивного иммунитета [Меджитов Р., Джаневей Ч., 2005; Culter C., 2006; Romange F., 2007; Li Y., Shi X., 2013].
Для изучения особенностей мукозального иммунитета на молекулярно-клеточном уровне в качестве антигенной модели в данной работе использована поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4 из антигенов условно патогенных бактерий. Этот препарат обладает широким набором патоген-ассоциированных молекулярных структур (ЛПС, пептидогликан, тейхоевые кислоты и др.), являющихся лигандами для клеточных рецепторов, включая семейство Toll-like receptors (TLRs). Установлены основные показатели активации врождённого иммунитета при его подкожном введении [Ахматова Н.К., 2007].
До настоящего времени остались неизученными молекулярно-клеточные механизмы активации врождённого иммунитета на локальном и системном уровнях при мукозальной иммунизации антигенами условно патогенных микроорганизмов.
Цель исследования изучение особенностей клеточного иммунного ответа при мукозальных способах аппликации антигенов условно патогенных бактерий.
Задачи:
1. Определить особенности экспрессии TLR2, TLR4, TLR9 и иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов лимфоидных органов и тканей при мукозальных методах аппликации антигенов условно патогенных бактерий.
2. Выявить морфогистохимические изменения в лимфоидных органах и эпителио-ассоциированной лимфоидной ткани при непарентеральных методах иммунизации.
3. Изучить функциональную активность натуральных киллеров и продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками при мукозальных методах введения антигенов.
4. Оценить неспецифическую защитную активность вакцины Иммуновак-ВП-4 из антигенов условно патогенных бактерий при мукозальном введении в отношении
патогенов, не входящих в состав вакцины.
5. Исследовать специфическую протективную активность Иммуновак-ВП-4 в отношении возбудителей, антигены которых входят в состав вакцины при мукозальных методах введения.
Научная новизна работы
На молекулярно-клеточном уровне выявлены особенности активации лимфоидной ткани разной локализации при мукозальных методах аппликации антигенов условно патогенных бактерий.
Впервые установлено, что при мукозальных способах введения антигенов, в отличие от подкожного, не происходит увеличения численности клеток, экспрессирующих TLR2, регулирующего продукцию IgE, что объясняет меньшее сенсибилизирующее действие антигенов при введении через слизистые оболочки. Выявленные различия предполагают существование различных сигнальных путей активации при мукозальном и парентеральном методах иммунизации. Установлено, что численность клеток, экспрессирующих TLR4, TLR9, сопоставима при мукозальном и подкожном методах иммунизации.
Показано, что при всех исследованных методах введения антигенов происходит активация ключевых эффекторов мукозального иммунитета T и В1 лимфоцитов, но степень их активации и локализация различны. При интраназальном и подкожном методах увеличивается их содержание в лимфоидной ткани, ассоциированной с органами дыхания, и в селезёнке, при пероральном – в лимфоидной ткани, связанной с органами дыхания и желудочно-кишечным трактом.
Выявлено, что при мукозальной аппликации антигенов повышается численность лимфоцитов с экспрессией CD3, CD4, CD8, CD19, CD25 не только в лимфоидных образованиях, ассоциированных с органами дыхания и желудочно-кишечного тракта, но и в селезёнке. Это подтверждается морфогистохимическими исследованиями, указывающими на наличие пролиферативных процессов как в регионарных к месту введения, так и в отдалённых от него лимфоидных органах и тканях, включая селезёнку. Полученные данные свидетельствуют об активации не только местного, но и системного иммунитета.
Впервые установлено, что при мукозальных методах иммунизации увеличивается количество и цитотоксическая активность натуральных киллеров (natural killer – NK) во всех изученных органах и тканях. Наиболее высокой цитотоксичностью характеризовались NK, полученные из лимфоидной ткани кишечника после пероральной иммунизации (75,4±1,83%), что согласуется с существенным (в 46 раз) нарастанием популяции NK при данном методе введения антигенов. Динамика NK при подкожном введении практически отсутствовала.
Независимо от способа аппликации антигенов выявлено повышение уровня провоспалительных (IL-1, IL-6) и регуляторных (IL-12, IL-5) цитокинов в сыворотке крови мышей. При всех исследованных методах практически одинаково усиливался синтез IL-5, регулирующего продукцию IgA.
Продемонстрировано, что антигены условно патогенных бактерий при мукозальном введении стимулируют эффекторную систему врождённого иммунитета и приводят к быстрому формированию неспецифической резистентности, установленной на модели вируса гриппа H5N2. Также подтверждено развитие адаптивного иммунитета в острых опытах защиты от патогенов (K.pneumoniae, P.vulgaris, S.pneumoniae) при пероральном методе аппликации изученных антигенов.
Научно-практическая значимость
Полученные данные расширяют представление о мукозальной системе иммунологической защиты, которая обеспечивается не только иммунными реакциями мукозо-ассоциированной лимфоидной ткани дыхательного и желудочно-кишечного трактов, но и системным иммунитетом.
Результаты, полученные в ходе исследования, могут быть использованы при разработке неинвазивных методов вакцинации, являющихся оптимальным способом безопасной и массовой профилактики инфекционных заболеваний. Данные о механизмах формирования мукозального и системного иммунитета при непарентеральных способах вакцинации открывают перспективы для конструирования вакцин и иммуномодулирующих препаратов, а также способствуют расширению спектра и методов их применения.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Антигены условно патогенных бактерий действуют на различные сигнальные пути клеточной активации в зависимости от метода их введения: при интраназальной и пероральной аппликации увеличивается численность клеток с экспрессией TLR4 и TLR9, при подкожном введении TLR2, 4, 9.
2. Мукозальные методы иммунизации приводят к увеличению количества ключевых эффекторов местного иммунитета (T, В1 лимфоцитов), а также CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD25+ клеток не только в регионарных лимфоидных органах и эпителио-ассоциированной лимфоидной ткани, но и в селезёнке. Данные факты свидетельствуют о развитии системного иммунитета, что подтверждается морфологическими исследованиями, показавшими формирование локальных иммунных реакций и генерализацию иммунного процесса.
3. Непарентеральное введение антигенов условно патогенных бактерий индуцирует увеличение численности и цитотоксической активности NK, причём наибольшей цитотоксичностью характеризуются клетки, полученные после пероральной иммунизации из лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником.
4. При мукозальных методах введения антигенов условно патогенных микроорганизмов в сыворотке крови мышей повышается уровень IL-1, IL-6, IL-5, IL-12; при подкожном введении, кроме того увеличивается продукция IFN.
5. Антигены условно патогенных бактерий при мукозальных методах иммунизации стимулируют эффекторную систему врождённого иммунитета, приводя к быстрому формированию неспецифической резистентности к гетерологичным микроорганизмам и развитию адаптивного иммунитета.
Апробация материалов диссертации и публикации
Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на II-ом Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009); Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009); XIII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2009» (Санкт-Петербург, 2009); VII Российской конференции иммунологов Урала (Архангельск, 2009); 1st Сongress of the confederation of the european otorhinolaryngology head and neck surgery (Barcelona, Spain, 2011); 17-ом съезде педиатров России (Москва, 2013); V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2013); конференции молодых учёных ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН (Москва, 2013); 15th International Сongress of Immunology (Milan, Italy, 2013).
Апробация диссертации состоялась 25 апреля 2013 г. на конференции отдела иммунологии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН и 11 июня 2013 г. на заседании кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Минздрава России.
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, 6 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Препараты. В качестве экспериментальной антигенной модели для иммунизации мышей использовали поликомпонентную вакцину Иммуновак-ВП-4 (ФГУП «НПО «Микроген»), состоящую из антигенов условно патогенных микроорганизмов (Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus) и предназначенную для иммунотерапии хронических воспалительных и аллергических заболеваний. Вакцина содержит ЛПС, ассоциированный с белком наружной мембраны грамотрицательных бактерий, пептидогликан, тейхоевые кислоты, липопротеины, CpG-мотивы олигонуклеотидов, являющихся лигандами для TLRs.
Штаммы микроорганизмов. В работе были использованы штаммы K.pneumoniae К16, P.vulgaris серотипа О16Н6 №177, S. pneumoniae серотипа 3 (ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН). Штаммы восстанавливали из лиофилизированного состояния, выдерживая в 0,2%-ном сахарном бульоне 4-6 часов при 37оС. После этого пересевали на 16-18 часов на питательный агар. Применяли штамм вируса гриппа птиц H5N2 (A/Mallard/Pеnsil/1024/84 - H5N2), выделенный от уток и адаптированный к мышам (штамм предоставлен Ю.А. Смирновым ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» РАМН). Все штаммы использовали для воспроизведения инфекционного процесса у животных.
Экспериментальные животные. Опыты проводили на мышах линий СВА (n=1200), Balb/с (n=300) и беспородных (n=1000) весом 12-14 и 16-18 г, полученных из питомника НЦ Биомедицинских технологий РАМН «Андреевка» и содержащихся в условиях вивария ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.
Иммунизация мышей. Мышей вакцинировали Иммуновак-ВП-4 1-кратно и 3-кратно интраназально в разовой дозе 500 мкг/мышь и перорально в разовой дозе 2 мг/мышь; 1-кратно и 2-кратно подкожно в разовой дозе 200 мкг/мышь.
Защита мышей от бактериальной и вирусной инфекции. Активацию системы врождённого и адаптивного иммунитета у мышей оценивали на моделях клебсиеллёзной (K.pneumoniae К16, в дозах 0,005-0,01-0,025-0,05 млрд. м.кл), протейной (P.vulgaris, штамм №177, в дозах 10-20-40-80 млн м.кл.), пневмококковой (S.pneumoniae, серотип 3 в дозах от 10 до104 м.кл) инфекций (штаммы вводили внутрибрюшинно) и гриппозной инфекции (штаммом H5N2, 50LD50, заражали интраназально). Заражение мышей проводили через 24 часа после последней иммунизации вакциной. K.pneumoniae К16 и P.vulgaris вводили в 0,4%-ном агаре в соотношении культуры и агара 1:4, S.pneumoniae в 0,9%-ном растворе натрия хлорида. Протективную активность вакцины определяли через 6-20 дней после заражения.
Выделение мононуклеарных лейкоцитов (МЛ). Животных выводили из опыта под эфирным наркозом согласно правилам и международным рекомендациям Европейской конвенции по защите позвоночных животных. Извлекали лимфоидные органы и ткани, гомогенизировали, отмывали средой RPMI-1640 и выделяли мононуклеарные лейкоциты с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-урографина по методу A. Boyum (1968).
Определение экспрессии TLRs и поверхностных маркеров проводили при помощи моноклональных антител (Caltag Laboratories, США) против соответствующих антигенов. Результаты учитывали на проточном цитометре (Beckman Coulter Fc-500, США). На МЛ селезёнок, лимфатических узлов, назо-, бронхо- и гастро-ассоциированной лимфоидной ткани мышей исследовали уровни экспрессии TLR2, 4, 9, а также маркёры лимфоцитов: СD3, NK 1.1, СD3/NK, CD4, CD25, CD4/CD25, CD8, CD19, MHC II, СD5.2 (В1), TCR (T).
Цитотоксическую активность МЛ лимфоидных органов и тканей мышей определяли на NK чувствительной линии опухолевых клеток К-562 в МТТ-тесте. Опухолевые клетки (3х104/мл) инкубировали в течение 18 часов в плоскодонных 96-луночных планшетах (Costar, Франция) в культуральной среде RPMI-1640 (Sigma, США) с МЛ органов и тканей после вакцинации в соотношении 1:5 в СО2 инкубаторе при 37 С и 4 % СО2. В лунки добавляли витальный краситель МТТ (Fluka, Германия) и по оптической плотности ( – 540 нм), измеряемой на мультискане МS (Labsystem, Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).
Определение уровня цитокинов. Цитокины в сыворотке крови мышей определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем фирмы Bender MedSystems (США) согласно инструкции производителя. Морфогистохимические исследования. Изучена структура первичных (костный мозг, тимус) и вторичных (селезёнка, регионарные лимфатические узлы, мукозо-ассоциированная лимфоидная ткань) органов иммуногенеза мышей через 24 часа после интраназального, перорального, подкожного однократного введения вакцины Иммуновак-ВП-4 и у интактных животных. Исследования проводили на серийных парафиновых срезах органов и тканей, окрашенных гистологическими (гематоксилином-эозином и по Ван Гизону) и гистохимическими (по Браше с контролем РНК-азой, по Шабадашу с контролем амилазой и альциановым синим) методами. Фотосъемку и анализ изображения с гистологических препаратов осуществляли с помощью цифровой системы регистрации и анализа изображения AxioVision 4.2 (Сarl Zeiss, Германия).
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Excel (Microsoft Corporation, США), интегрированного пакета статистического анализа StatSoft 8.0 с применением параметрических и непараметрических методов сравнения. Выживаемость мышей в течение заданного срока рассчитывали по методу С.А. Гланца (1999).
![Особенности иммунного ответа у подростков с эктопией шейки матки и оптимизация тактики ее лечения [Электронный ресурс]](/i/i/4491/182061.png "Особенности иммунного ответа у подростков с эктопией шейки матки и оптимизация тактики ее лечения [Электронный ресурс] Соколова Елена Алексеевна")