Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Патофизиология АД 12
1.1 .Определение 12
1.2.ФормыАД 13
1.3 .Иммунный ответ при АД 14
1.3.1. Характеристика острой и хронической стадий АД 14
1.3.2. Роль кератиноцитов 15
1.3.3. Роль антиген-презентирующих клеток 15
1.3.4. Роль лейкоцитов 17
1.3.5. Роль регуляторных клеток 19
Глава 2. Антиэрготипический ответ 25
2.1 Эрготопы 25
2.2. Клетки-мишени 26
2.3. Антиэрготипические Т-клетки 27
2.3.1. Антиэрготипический Т-клеточный ответ в неиммунизированном организме 27
2.3.2. Антиэрготипический ответ в иммунизированном организме 28
2.3.4. Антиэрготипический ответ в результате вакцинации 29
2.4. Взаимодействие различных популяций регуляторных клеток 31
Глава 1. Клинико-иммунологическая характеристика аллергической и неаллергической формы АД 46
1.1. Общая характеристика клеточного и гуморального звена иммунной системы больных АД 47
1.2. Оценка функционального состояния субпопуляций CD4 - и CD8+-клеток у больных АД 49
1.3. Оценка функционального состояния клеток моноцитарно-макрофагальной системы у больных АД 52
Глава 2. Характеристика активированных аутологичных Т-клеток, предназначенных для введения с целью иммунокоррекции 54
Глава 3. Динамика клинических и иммунологических показателей у больных АД на фоне терапии активированными аутологичными Т-лимфоцитами 58
3.1. Клиническая эффективность использования активированных аутологичных Т-лимфоцитов в терапии пациентов с АД 58
3.2. Общая характеристика изменений в клеточном и гуморальном звене иммунной системы больных АД в процессе ТКВ 63
3.3 Оценка изменений функционального состояния субпопуляций CD4 и CD8+ Т-лимфоцитов у больных АД в процессе ТКВ 65
3.4. Оценка изменений функционального состояния клеток моноцитарно-макрофагальной системы у больных АД в процессе ТКВ 68
Обсуждение 71
Заключение 86
Выводы 88
Практические рекомендации 89
Список литературы 90
- Характеристика острой и хронической стадий АД
- Антиэрготипический Т-клеточный ответ в неиммунизированном организме
- Оценка функционального состояния клеток моноцитарно-макрофагальной системы у больных АД
- Характеристика активированных аутологичных Т-клеток, предназначенных для введения с целью иммунокоррекции
Введение к работе
Проблема атопического дерматита является чрезвычайно актуальной в связи с 2-3 кратным увеличением заболеваемости АД в индустриальных странах за последние 30 лет. АД страдают 10-20% детей и 1-3% взрослых [Ben-Gashir М.А., 2004, Leung D.Y.M., 2004]. Многочисленные исследования показали, что АД является полиэтиологичным заболеванием. Клинически заболевание реализуется при наличии генетической предрасположенности по аутосомно-доминантному типу, нарушении барьерной функции кожи, вегетативно-сосудистых, нейроэндокринных нарушений, локальных и системных изменений реакций иммунной ситемы и провоцирующих факторов окружающей среды [Ben-Gashir М.А.,2004, Leung D.Y.M, 2004]. АД является гетерогенным заболеванием. В зависимости от общего уровня IgE сыворотки крови различают аллергическую и неаллергическую форму АД [Novak N., Bieber Т., 2003]. Изучение особенностей иммунологических механизмов развития каждой из форм является актуальной задачей аллергологов и иммунологов.
Стандартные методы лечения аллергических заболеваний, используемые в настоящее время, включают применение системных и топических препаратов, которые подавляют действие медиаторов воспаления. Единственным методом, который видоизменяет характер реагирования организма на аллерген, вмешиваясь в основные патогенетические звенья аллергического процесса, является аллерген-специфическая иммунотерапия и ее модификации [Akdis С.А., 1998, Francis J.N., 2003, Gardner L.M., 2004, Алексеева Л.Г., 2007]. Однако недостаточная эффективность, а подчас и невозможность ее проведения при атопическом дерматите, является основанием для поиска новых направлений системной терапии данного заболевания.
Активное изучение регуляторных клеток при различных патологических состояниях в последнее десятилетие выявило снижение их активности при атопических заболеваниях. В частности показано, что у аллергиков при неизмененном количестве клеток в субпопуляции CD4+CD25 преобладают не регуляторные, а активированные Т-клетки. Кроме того, в эксперименте было
показано, что как естественно встречающиеся С04+С025+-регуляторные Т-клетки, так и индуцированные IL-10-продуцирующие аллерген-специфические Trl-клетки снижают активность аллерген-специфических эффекторных клеток, подавляют продукцию IgE и повышают уровень IgG4 и IgA, что способствует уменьшению симптомов аллергического заболевания [Felmrvary Z., 2004, Ling Е.М., 2004, Robinson D.S., 2004, Shi H.-Z., 2005].
В зависимости от поверхностных маркеров и профиля цитокиновой секреции к настоящему времени охарактеризованы различные группы регуляторных клеток, среди которых могут находиться как антиидиотипические, распознающие клоноспецифические детерминанты, так и антиэрготипические клетки, распознающие маркеры активации (так называемые эрготопы), например, молекулу CD25, молекулу белка теплового шока 60 [Cohen I.R., 2004, Fehurvary Z., 2004, Sarantopoulos S., Kronenberg M., 2005, Beisser, S., 2006]. Показано, например, что субпопуляция С04+С025+РохрЗ+-регуляторных клеток содержит в себе как антиидиотипические, так и антиэрготипические клоны [DeMoraes L.V., 2003, Sakaguchi S., 2004, Buenafe A.C., 2004, Hong J., 2006]. Эти данные позволяют предполагать изменения активности регуляторных клеток в результате индукции антиэрготипического ответа, что даст возможность корригировать дисбаланс с преобладанием Т1г2-клеток, характерный для атопических заболеваний, и уменьшить клинические проявления аллергии.
Иммунизация, нацеленная на усиление природной антиэрготипической регуляторной сети, впервые была применена в экспериментальных моделях для лечения аутоиммунных заболеваний [Lohse A.W., 1989, 1993, Mimran А., 2004, 2005], при которых было показано снижение антиэрготипического ответа [Hafler D.A., 1985, Mimran А., 2004]. Такое воздействие оказалось успешным. Так, введение антиэрготипических клеток или иммунизация самими эрготопами или полноразмерными последовательностями ДНК, кодирующими эти молекулы, контролировало такие аутоиммунные заболевания, как адьювантный артрит и экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит.
У человека стимуляция антиэрготипического ответа показана путем вакцинации антиген-реактивными Т-клетками при рассеянном склерозе, при котором отмечается его снижение [Hafler D.A., 1985, Correale J., 1997, Stinissen P., 1998, Zang Y.C., 2000]. Также стимуляция антиэрготипического ответа была получена у пациентов, страдающих диабетом I типа, при введении им пептида белка теплового шока 60 (HSP60) [Raz L, 2002, Huurman V.A., 2007].
Идея применения поликлональной Т-клеточной вакцины при атопическом дерматите заключалась в том, чтобы индуцировать именно антиэрготипический ответ, поскольку выявить антигенную специфичность клеток, участвующих в патогенезе АД, у большинства пациентов не удается. Феномен индукции антиэрготипического ответа путем введения поликлонально активированных Т-клеток ранее был показан только в эксперименте, поэтому не изучены возможные изменения клинических и иммунологических параметров больных в результате такой терапии.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Изучить изменения клинических и иммунологических параметров пациентов с аллергической и неаллергической формой атопического дерматита в процессе терапии активированными аутологичными Т-лимфоцитами.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Сравнить клинические проявления аллергической и неаллергической формы атопического дерматита, используя шкалу для оценки тяжести клинических симптомов АД (SCORAD) и индекс качества жизни (DLQI).
Исследовать особенности количественных и функциональных характеристик иммунной системы больных с аллергической и неаллергической формой атопического дерматита, включая оценку числа теломерных повторов ДНК иммунокомпетентных клеток, их линейные и активационные маркеры, продукцию регуляторных и эффекторных молекул (цитокинов, Н202 и иммуноглобулинов).
Исследовать фенотипические характеристики in vitro активированных аутологичных Т-клеток больных атопическим дерматитом, предназначенных для введения с целью иммунотерапии.
Изучить переносимость и клиническую эффективность применения активированных аутологичных Т-лимфоцитов в лечении больных с аллергической и неаллергической формой атопического дерматита.
В динамике оценить влияние иммунотерапии активированными аутологичными Т-лимфоцитами на количественные и функциональные параметры иммунной системы больных с аллергической и неаллергической формой атопического дерматита.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА:
В результате выполнения работы были получены новые данные, характеризующие больных с аллергической и 'неаллергической формой атопического дерматита с точки зрения их общих и особенных свойств, клинических проявлений и иммунной системы.
Впервые показано, что при обеих формах заболевания наблюдаются изменения активности фагоцитоза, снижение количества NK-клеток, уменьшение числа теломерных повторов ДНК в субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов, повышение продукции лимфоцитами факторов ингибиции миграции в реакции ГЗТ и активация гуморального звена иммунной системы.
Обнаружено, что для аллергической формы атопического дерматита характерна большая тяжесть заболевания и большее число нарушений в различных звеньях иммунной системы, включая увеличение числа CD4+CD25+bnght-KneTOK и нарушение факторов врожденного иммунитета, обусловленные снижением продукции перекиси водорода моноцитами. В патогенезе этой формы большую роль играют реакции гиперчувствительности как I, так и IV типа. Установлена важная роль в развитии этой формы заболевания популяции СВ8+-лимфоцитов.
Впервые в лечении больных атопическим дерматитом для Т-клеточной вакцинации (ТКВ) были использованы поликлонально активированные аутологичные Т-лимфоциты. Обнаружено, что при аллергической форме АД положительная клиническая динамика от ТКВ сопровождается повышением числа CD8+-клеток, снижением уровня IgE и числа В-лимфоцитов периферической крови. При неаллергической форме нарастает число CD8+CD25+ Т-клеток, уменьшается количество В-лимфоцитов и повышается активность лимфоцитов в продукции факторов ингибиции миграции в реакции ГЗТ. При обеих формах заболевания в результате ТКВ восстанавливается фагоцитарная функция клеток моноцитарно-макрофагального звена иммунной системы.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:
Полученные данные демонстрируют различия большего числа иммунных параметров пациентов с АД, чем только нормальное или повышенное содержание IgE в сыворотке, причем более выраженные изменения иммунной системы при аллергической форме АД могут обусловливать и ее более тяжелое течение.
Нами разработан метод лечения атопического дерматита, основанный на индукции антиэрготипического ответа путем введения поликлонально активированных аутологичных Т-клеток. Показана безопасность и высокая клиническая эффективность такого подхода в лечении пациентов, как с аллергической, так и с неаллергической формой атопического дерматита. Были выявлены изменения иммунологических параметров больных с обеими формами заболевания в процессе такого воздействия.
Полученные данные позволяют рекомендовать внедрение иммунотерапии активированными аутологичными Т-лимфоцитами в клиническую практику, что позволит расширить возможности патогенетической терапии аллергических заболеваний, повысить ее эффективность и улучшить качество жизни таких больных.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ;
Более тяжелое течение аллергической формы атопического дерматита, в отличие от неаллергической, обусловлено как активацией гуморальных эффекторных функций и дисбалансом в моноцитарно-макрофагальном звене иммунной системы, характерных для обеих форм заболевания, так и участием в патогенезе заболевания реакций гиперчувствительности I и IV типов, активным участием CD4+- и С08+-субпопуляций Т-лимфоцитов и более глубокими нарушениями факторов врожденного иммунитета.
Использование активированных аутологичных Т-лимфоцитов в терапии атопического дерматита коррегирует дисбаланс в иммунной системе: подавляет гуморальный, активирует клеточный иммунный ответ и функции монофитарно-макрофагального звена. При аллергической форме заболевания положительная клиническая динамика сопровождается повышением числа CD8 -клеток и прогрессивным снижением уровня общего IgE, при неаллергической - нарастанием числа CD8 CD25+ Т-клеток.
Использование активированных аутологичных Т-лимфоцитов в терапии больных атопическим дерматитом является безопасным и клинически высокоэффективным как при аллергической, так и при неаллергической форме заболевания и позволяет рекомендовать его в качестве метода патогенетической терапии.
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Характеристика острой и хронической стадий АД
АД Атопический дерматит характеризуется 2 фазами: начальной, острой, фазой с преобладанием цитокинов ТЬ2-профиля и последующей, хронической, ассоциированной с доминированием Thl-цитокинов. В соответствии с этим, АД различается от других аллергических заболеваний проявлением реакций гиперчувствительности как I, так и IV типа [Mittermann I., 2004].
Считается, что острое воспаление в коже характеризуется значительно более высоким уровнем клеток, экспрессирующих мРНК IL-4, IL-5, IL-13 и низким уровнем клеток, экспрессирующих мРНК IFN-y и IL-12. И, наоборот, в хронической стадии АД снижается экспрессия клетками кожи мРНК IL-4 и IL-13, но увеличивается экспрессия мРНК IL-5, GM-CSF, IL-12 и IFN-y. Это способствует переключению иммунных реакций в сторону ТЫ-типа. Более того, наличие IFN-y-продуцирующих клеток коррелирует с хронизацией и тяжестью АД [Grewe М., 1994, 1995, 1998]. Действие IFN7 заключается в индукции апоптоза и повреждении кератиноцитов. Кератиноциты в норме несут мало Fas-R, но у больных АД под влиянием у-интерферона усиливается экспрессия рецепторов апоптоза Fas-R (CD95), а Т лимфоциты инфильтрата имеют лиганд Fas-L. Их взаимодействие в настоящее время рассматривается как единственный или главный механизм повреждения Т-клетками кератиноцитов при АД [Trautmann А., 2000]. В то же время известны и проапоптотические эффекты ГМ-КСФ в отношении кератиноцитов [Breuhahn К., 2000].
Персистенция воспаления в коже и переход в хроническую форму может быть следствием повышения уровня IL-5 и GM-CSF в коже, ведущего к повышению выживаемости эозинофилов, моноцитов/макрофагов и клеток Лангерганса [Blauvelt А., 2003, Grewe М., 1994., 1995., 1998., Leung D.Y., 2000]. Кроме того, в эту стадию увеличивается выживаемость Т-клеток памяти [Akdis М., 2003]. В лихеноидную стадию ремоделирование кожи происходит за счет хронизации воспаления и характеризуется повышением числа IgE-несущих клеток Лангерганса и IDEC-клеток в эпидермисе. При этом в дерме преобладают макрофаги, а эозинофилы и Т-клетки представлены в меньшем количестве, чем в острый период. Недавние исследования показали, что депозиты коллагена в хронической стадии АД частично являются следствием повышенной активности цитокинов, участвующих в фиброзе, таких как IL-11 [TodaM., 2003].
Механическая травма и повреждение кожного барьера после снятия верхнего слоя кожи в результате зуда, порог которого значительно более низкий у больных АД, запускают продукцию кератиноцитами провоспалительных цитокинов и хемокинов. [Mihara К., 2004]. Выявлено, что в поврежденной расчесами коже происходит быстрое выраженное повышение уровня IL-lcc, IL-lp, IL-18, TNF-oc и GM-CSF [Wood L.C., 1992, Wood L.C., 1996, Konishi H., 2002, Higa S., 2003, Novak N., 2004, 2005]. Эти первичные провоспалительные цитокины активируют продукцию хемоаттрактантов и молекул адгезии (например, ICAM-1), способствующих привлечению в кожу лейкоцитов, их пролиферации и поддержанию выживаемости [Homey В., 2002, Leung, 2003, Reiss Y., 2001, Campbell J.J., 2000]. Последующая механическая травма, пептидогликаны стафилококков и гистамин усиливают продукцию GM-CSF кератиноцитами, который участвует в поддержании выживаемости и сохранении субпопуляции дендритных клеток [Matsubara М., 2004, Kanda N., 2004].
В коже пациентов, страдающих АД, повышено число IgE-несущих АПК, экспрессирующих РсєМ-рецептор, характеризующийся высоким сродством к IgE [Novak N., 2003]. Повышение экспрессии FcsRI на дендритных клетках кожи атопиков обусловлено повышением экспрессии FcsRry-цепи и сохраняется в результате повышенного уровня IgE [Novak N., 2003]. Дендритные клетки кожи пациентов с АД связываются с комплексом антиген -специфический IgE, захватывают антиген (аллерген) и усиливают свою антиген-презентирующую способность [Leung D.Y., 2004].
В коже пациентов с АД выявлено существование 2 основных типов дендритных клеток: клеток Лангерганса и IDEC-клеток (воспалительных эпидермальных дендритных клеток), которые в большей степени представлены в участках пораженной кожи [Novak N., 2003]. Оба типа ДК характеризуются повышенной экспрессией FcsRI. Клетки Лангерганса и IDEC-клетки играют важную роль в презентации аллергена соответственно Th2 и ТЫ-лимфоцитам [Novak N., 2003]. Аллергены, проникающие через поврежденную кожу пациентов с АД, соединяются с комплексом FcsRI — IgE на эпидермальных ДК и представляются Т-клеткам, способствуя их дифференцировке. FcsRI/IgE+ клетки Лангерганса могут мигрировать в лимфатические узлы и стимулировать наивные Т-клетки к дифференцировке в Тп2-клетки. Это ведет к увеличению пула лимфоцитов ТЬ2-типа [Novak N., 2003].
После миграции клеток Лангерганса в лимфатические узлы и активации Т-лимфоцитов происходит усиление процесса привлечения в эпидермис воспалительных эпидермальных дендритных клеток, т.к. клетки Лангерганса, активированные через FcsRI, высвобождают хемотаксические сигналы, повышающие миграционную способность как предшественников IDEC-клеток, так и наивных Т-клеток. IDEC-клетки не только имеют на своей поверхности более высокую плотность FcsRI фрагмента IgE, чем клетки Лангерганса, но и продуцируют существенно большее количество цитокинов (TNFa, IL-6, IL-8) и хемокинов, усиливая воспалительные иммунные реакции в коже и поддерживая клеточную активацию и процесс IgE-опосредованного захвата аллергена для его процессинга и презентации Тп2-лимфоцитам [Novak N., 2004, Kraft S., 1998].
Антиэрготипический Т-клеточный ответ в неиммунизированном организме
Исследователями было выявлено наличие антиэрготипической Т-клеточной реактивности в неиммунизированном организме. Следовательно, этот тип регуляции, возможно, важен для контроля иммунной системы в физиологических условиях.
Так антиэрготипический ответ определялся в тимусе однодневных животных, что позволило предположить, что развитие такого ответа является антиген-независимым [Mimran А., 2004]. Показано, что антиэрготипические Т-клетки новорожденных крыс обладали фенотипом CD8 и включали в себя Т-клетки с TCRocP+ и TCRy+ Т-клеточным рецептором. Эти две популяции клеток различались между собой по профилю продуцируемых цитокинов, рестрикции МНС и костимуляторным молекулам, необходимым для активации. TCRa(3 -антиэрготипические клетки пролиферировали, но не секретировали цитокины, тогда как ТСКу5+-антиэрготипические клетки в ответ на активированные Т-клетки секретировали IFN-y и TNF-a [Mimran А., 2005].
Ответ СВ8+ТСЯа3+-антиэрготипических Т-клеток был рестриктирован молекулами МНС I класса и зависим от взаимодействия костимуляторных молекул B7-CD28. Ответ ТСК/5+-антиэрготипических Т-клеток также был зависим от B7-CD28, но не был рестриктирован классическими молекулами МНС [Mimran А., 2005].
От здоровых людей также были получены антиэрготипические CD8+ Т-клетки. Было замечено, что эти С08+-антиэрготипические Т-клетки могли распознавать только антиген-активированные, но не фитогемагглютинин-активированные, аутологичные CD4+ Т-клетки [Correale J., 1997]. CD8+TCRap+ и CD8+TCRy8+ Т-клетки также различались по рестрикции МНС и профилю секретируемых цитокинов. CD8+TCRa3 были рестриктированы молекулами МНС I класса и секретировали IFN-y, TNF-a/p и TGF-P, тогда как CD8+TCRy8+ не были рестриктированы молекулами МНС I класса и секретировали только IFN-y и TNF-a /р [Correale J., 1997].
Однако стоит отметить, что определение неиммунизированных здоровых крыс и здоровых людей, как иммунологически наивных, некоторыми исследователями ставится под сомнение, т.к., по их мнению, стоит принять во внимание присутствие постоянной стимуляции антигенами и микроорганизмами окружающей среды [Quintana F J., 2006]. 2.3.2. Антизрготипический ответ в иммунизированном организме
Вакцинация крыс полным адъювантом Фрейнда вызывала выраженный антизрготипический ответ, который, предположительно, был результатом процесса «самовакцинации» Т-клеточными клонами, количество которых увеличивалось в ответ на введение адъюванта. Предположительно, Т-клеточная активация ведет к приобретению активированными Т-лимфоцитами функции антиген-презентирующих клеток [Lohse A.W., 1993]. Подтверждение индукции антиэрготипического ответа вследствие вакцинации сильными иммуногенами позволяет предположить, что антиэрготипические регуляторы участвуют в завершающей фазе иммунного ответа, чем ограничивают развитие патологического, чрезмерного ответа. Так, антиэрготипические Т-клетки наивных крыс секретируют IFN-y, который играет двойную роль в Т-клеточном иммунитете. В начальную фазу IFN-y участвует в поддержке индукции иммунного ответа, в завершающую фазу - в его разрешении [Pfister G., 2005]. На экспериментальных моделях адъювантного артрита [Mimran А., 2004] и при рассеянном склерозе у человека [Hafler D.A., 1985] было показано, что антиэрготипический ответ подавлен при аутоиммунных заболеваниях. Тогда предположили, что иммунизация, нацеленная на усиление природной антиэрготипической регуляторной сети, возможно, будет успешно их контролировать. В ходе дальнейших экспериментов было показано, что вакцинация экспериментальных животных неспецифически активированными Т-клетками [Lohse A.W., 1989; Lohse A.W., 1993] или определенными эрготопами [Мог F., 1996; Mimran А., 2004] действительно предотвращала развитие у них АА и ЭАЭ. Вакцинация ДНК, кодирующей полноразмерную цепь CD25, приводила к индукции CD4+ и CD8+ TCRa(3+ и TCRyS+ антиэрготипических Т-клеток, секретирующих IL-10 [Mimran А., 2004], в отличие от антиэрготипических Т-клеток неиммунизированных животных, секретирующих IFN-y и TNF-a [Mimran А., 2004]. TCRaP+антиэрготипические клетки были рестриктированы по MHC-I и МНС-П, а антиэрготипические взаимодействия, опосредованные ТСЯу5+-клетками не были рестриктированы классическими молекулами МНС. Выраженность пролиферации ТСЯуб-клеток (которые на 83-86% были CD8+TCRyS+) в ответ на активированные Т-клетки была в 2 раза выше, чем у CD8 TCRaP-клеток. Однако 99% CD4 Т -клеток были TCRaP-клетками [Mimran А., 2004].
Оценка функционального состояния клеток моноцитарно-макрофагальной системы у больных АД
Нами была проведена оценка функционального состояния клеток моноцитарно-макрофагальной системы, играющих важную роль, как во врожденном, так и в приобретенном иммунном ответе.
Данные, представленные в таблице 10, демонстрируют снижение фагоцитирующей активности гранулоцитов и моноцитов, увеличение числа моноцитов, экспрессирующих молекулу HLA-DR, и повышение продукции перекиси водорода нейтрофилами в обеих группах больных АД по сравнению с донорами.
Продукция перекиси водорода моноцитами, наоборот, была снижена, но достоверные различия по сравнению с донорскими значениями наблюдались только при аллергической форме заболевания при отсутствии различий между группами (табл.10). между донорами и больными АД
Следовательно, при обеих формах АД отмечается неполноценность системы врожденного иммунитета.
Таким образом, нами было показано, что аллергическая и неаллергическая форма АД имеют различные иммунологические проявления, обусловливающие разную выраженность клинических симптомов заболевания. Следовательно, к изучению механизмов развития АД необходимо подходить дифференцировано в зависимости от формы.
Итак, общими характеристиками обеих форм являются повышение числа CD19+ В-лимфоцитов и увеличение продукции ими иммуноглобулинов IgA и IgG, уменьшение числа теломерных повторов ДНК в субпопуляции CD4 Т-лимфоцитов, снижение индекса ингибиции миграции в реакции ГЗТ, уменьшение количества CD16+ NK-клеток, подавление фагоцитоза гранулоцитами и моноцитами и повышении продукции перекиси водорода нейтрофилами.
Аллергическая форма АД характеризуется более тяжелым течением и участием в патогенезе реакций гиперчувствительности как немедленного типа, выражающихся в гиперпродукции IgE и снижении количества клеток, продуцирующих IFNy+, так и замедленного типа в виде снижения индексов миграции, ингибиции миграции и повышения ПЭФ. Важную роль в развитии этой формы играют С08+-лимфоциты, она отражается в уменьшении числа теломерных повторов ДНК в этой субпопуляции клеток, повышении числа CD8+CD45RA+-HanBHbix клеток, увеличении экспрессии молекулы костимуляции CD28 на СВ8+-лимфоцитах и уменьшении количества CD8 CD45RO -клеток. При этой форме АД выявлено увеличение числа -клеток и более глубокие нарушения факторов врожденного иммунитета, обусловленные снижением продукции перекиси водорода моноцитами.
Таким образом, более тяжелое течение аллергической формы атопического дерматита, в отличие от неаллергической, обусловлено как активацией гуморальных эффекторных функций и дисбалансом в моноцитарно-макрофагальном звене иммунной системы, характерных для обеих форм заболевания, так и участием в патогенезе заболевания реакций гиперчувствительности I и IV типов, активным участием CD4+- и CD8+-субпопуляций Т-лимфоцитов и более глубокими нарушениями факторов врожденного иммунитета.
Характеристика активированных аутологичных Т-клеток, предназначенных для введения с целью иммунокоррекции
Показанное в многочисленных исследованиях изменение численности и снижение функциональной активности регуляторных клеток при аллергических заболеваниях, которые в норме играют важную роль в подавлении патологического Тп2-ответа, привело к идее восстановления субпопуляции этих клеток. Ранее индукция регуляторных клеток была показана при использовании антиген-специфической ТКВ, причем полученные регуляторные клетки были 2 типов: антиидиотипические и антиэрготипические. Однако у пациентов с АД получение антиген-специфической Т-клеточной вакцины практически невозможно в связи с трудностями идентификации значимого антигена. В результате возникла идея стимуляции у таких пациентов антиэрготипического ответа. Для этого мононуклеары периферической крови были стимулированы анти-СОЗ антителами в присутствии IL-2, т.е. активированы поликлонально. После 10-дневного культивирования со стимуляторами, мы исследовали активированные клетки.
Результаты описательного статистического анализа представлены в таблицах в виде средних величин показателей и их стандартных ошибок. Ри -достоверность различий определялась тестом согласованных пар Уилкоксона.
В полученной ТКВ, по сравнению с нести мул ированными клетками больных АД, выявлялось увеличение числа CD8+- и снижение CD4+-лимфоцитов, снижение «дважды отрицательных» Т-лимфоцитов (табл.11).
Определялось значительное увеличение экспрессии маркеров активации, таких как CD25 и DR, на CD4+- и С08+-лимфоцитах, более выраженное в субпопуляции CD8 -клеток. Количество С04+С025+Ьг№-лимфоцитов снижалось (табл.12). Снижение числа CD4+CD25+ "81-клеток является показателем того, что увеличение субпопуляции CD4+CD25+ происходило за счет активированных, а не регуляторных клеток, что являлось ожидаемым, т.к. IL-2 в концентрации 50ед./мл. использовался в культуре в качестве фактора роста клеток.
В результате активации достоверно снижалась экспрессия костимуляторной молекулы CD28 на С04+-лимфоцитах активированных клеток (табл.13).
Не было выявлено изменения длины теломерных районов ДНК в субпопуляциях CD4+ и CD8+ в результате активации клеток.
При оценке различий в генерировании активированных Т-клеток при каждой форме АД было выявлено, что при неаллергической форме число CD4+-клеток, экспрессирующих молекулу активации HLA-DR почти в 4 раза выше, чем при аллергической форме (36,1 ±3,7 и 9,7±2,3, р 0,01), тогда, как число СВ8+-клеток, не экспрессирующих молекулы HLA-DR, существенно ниже (24,3±3,5 и 40,95+3,1, р 0,05). При неаллергической форме заболевания было отмечено более высокое число CD4+CD28"-лимфоцитов (14,7±6,3 и 2,8±2,6, р 0,05). Следовательно, генерирование активированных Т-клеток при разных формах АД протекает по-разному.
Были отмечены различия в генерировании активированных Т-клеток у больных АД по сравнению с донорами (табл.14). У доноров в результате активации также отмечалось увеличение численности субпопуляции CD8+- и снижение СВ4+-клеток, однако повышение экспрессии маркеров активации CD25 и DR было выявлено только на С08+-лимфоцитах, тогда как у больных АД - на обеих исследуемых субпопуляциях Т-клеток. Следовательно, активированные Т-клетки, полученные в результате стимуляции анти-СОЗ антителами в присутствии 50ед/мл IL-2, у больных АД и доноров различаются.
ТКВ, полученная из клеток доноров, состояла преимущественно из активированных СЭ8+-лимфоцитов, тогда как ТКВ, полученная из клеток больных АД, состояла из активированных CD4+- и С08+-лимфоцитов с преобладанием последних.
