Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
2. Материалы и методы исследований 46
3. Результаты исследований 55
3.1. Методика получения ДК in vitro. Культивирование клеток при различных условиях стимуляции созревания 55
3. 2. 1. Использование различных способов стимуляции созревания ДК в краткосрочных культурах 57
3.2.2. Свойства fast,Z]K, полученных с использованием ИЛ-7 и дексаметазона 63
3.2.3. Использование растворимой формы рекомбинантного CD и липополисахарида Salmonella typhi в качестве активаторов дозревания fastflK 80
3.2.4. Продукция различных цитокинов дендритными клетками, культивировавшимися в течение 3 суток при различных условиях стимуляции созревания 85
3.3. Функциональные свойства модулированных дендритных клеток взрослых и новорожденных в различных моделях взаимодействия с Т лимфоцитами 93
3.3.1. Одновременное культивирование обычных fastHK, и fast/IK модулированных в ходе созревания дексаметазоном в смешанной лейкоцитарной реакции 93
3.3.2. Фенотипическая характеристика ДК детей и взрослых, полученных при традиционных условиях культивирования 97
3.3.3. Модель взаимодействия дендритных клеток с модулированными свойствами и дендритных клеток с обычными свойствами, культивировавшимися в течение 8 суток 101
3.3.4. Последовательная стимуляция аллогенных лимфоцитов модулированными и обычными дендритными клетками, культивировавшимися в течение 8 суток 105
4. Обсуждение полученных результатов 115
Выводы 124
Список литературы 1
- Свойства fast,Z]K, полученных с использованием ИЛ-7 и дексаметазона
- Продукция различных цитокинов дендритными клетками, культивировавшимися в течение 3 суток при различных условиях стимуляции созревания
- Одновременное культивирование обычных fastHK, и fast/IK модулированных в ходе созревания дексаметазоном в смешанной лейкоцитарной реакции
- Последовательная стимуляция аллогенных лимфоцитов модулированными и обычными дендритными клетками, культивировавшимися в течение 8 суток
Введение к работе
Актуальность темы
Функционирование иммунной системы в ответ на антигенное раздражение и вне его находится под контролем многих молекулярных и клеточных систем. Эти системы призваны обеспечить оптимальный запуск и протекание реакции на антиген и при этом, не дать перейти этому процессу в русло различных системных отклонений, результатом которых может стать развитие аутоиммунной агрессии к собственным клеткам и тканям. Центральную роль в инициации первичного иммунного ответа играют дендритные клетки (ДК) - наиболее активные и высокоспециализированные антигенпрезентирующие клетки организма. Кроме инициации иммунных реакций немаловажной является роль ДК в регуляции иммунных процессов в организме и поддержания гомеостаза иммунокомпетентных клеток. ДК являются важнейшими участниками системы контроля иммунного ответа, так как основа контроля - центральная и периферическая толерантность как к ауто-, так и к аллоантигенам, зависит прежде всего от эффективной работы именно этих клеток (Guermonprez et al, 2002, Machy et al, 2002).
Известно, что процессы иммунного ответа и подержания клеточного гомеостаза лимфоцитов в раннем постнатальном периоде существенно отличаются от аналогичных процессов у взрослых. В этой связи, особенно интересным аспектом исследования функциональной значимости ДК является изучение последних на ранних этапах развития, т.е. с позиций онтогенетической зрелости иммунной системы (Schonland et al., 2003).
Исследования механизмов регуляции процессов созревания ДК при различных условиях культивирования необходимы для последовательного понимания процессов отклонений в работе иммунной системы человека в целом и, особенно, на ранних этапах развития ребенка. Исследование механизмов выработки толерогенных свойств позволяет оценить возможность применения дендритных клеток с модулированными в ходе
созревания свойствами при решении ряда проблем, возникающих в клинической практике при лечении аутоиммунных заболеваний и предотвращении отторжения трансплантированных органов.
Цель работы
Изучить особенности функционального созревания дендритных клеток новорожденных детей при различных условиях культивирования клеток, а также под действием иммуномодулирующих агентов, способных изменить функциональные свойства ДК в плане выработки толерогенных свойств in vitro и определить их участие в выработке толерантности к антигенам.
Задачи исследования
Проанализировать особенности фенотипического созревания ДК новорожденных и взрослых в зависимости от условий культивирования.
Определить влияние препаратов глюкокортикоидов и различных цитокинов на экспрессию специфических маркеров дендритными клетками новорожденных детей и взрослых.
Провести сравнительный анализ продукции цитокинов дендритными клетками новорожденных и взрослых.
Исследовать функциональные свойства дендритных клеток новорожденных и взрослых в различных моделях взаимодействия с аллогенными Т-лимфоцитами.
Сравнить особенности созревания обычных и потенциально толерогенных дендритных клеток новорожденных и взрослых.
Научная новизна
Были выявлены статистически значимые отличия между фенотипическими и функциональными свойствами ДК, полученных из моноцитов пуповинной крови новорожденных и венозной крови взрослых
здоровых доноров. Показан разный уровень экспрессии на мембране дендритных клеток функционально значимых маркеров, а также выявлены различия в продукции цитокинов дендритными клетками в зависимости от стадии созревания и условий культивирования. Показан сложный характер влияния синтетического глюкокортикоида дексаметазона на уровень продукции интерлейкина-10 дендритными клетками.
В ходе исследований впервые был выявлен стимулирующий эффект глюкокортикоидов, действующих в совокупности с интерлейкином-7, на экспрессию молекул антигенпрезентации на ДК новорожденных и взрослых.
Впервые проведены исследования толерогенных свойств ДК новорожденных в оригинальных моделях in vitro с использованием конкурентного и последовательного взаимодействия обычных ДК и ДК, подвергавшихся воздействию противовоспалительными агентами.
Практическая значимость
Разработаны оригинальные схемы культивирования дендритных клеток, предназначенные для выявления специфических свойств ДК.
Проведенные исследования механизмов регуляции процессов созревания ДК при различных условиях культивирования необходимы для разработки методов получения. Разработанные методики получения ДК со специфическими иммуностимулирующими или супрессорными свойствами могут быть использованы при оптимизации условий создания дендритно-клеточных препаратов для цитотерапии патологий как с недостаточностью иммунного ответа (онкологические заболевания), так и связанных с избыточной иммунной реакцией (аллергии, отторжение аллотрансплантанта). Толерогенные ДК могут найти применение в качестве основного инструмента при цитотерапии врожденных и приобретенных патологических срывов аутотолерантности организма к собственным антигенам.
Внедрение результатов работы
Материалы диссертационной работы вошли в аналитический обзор "Методы выделения, культивирования и оценки функциональной активности дендритных клеток новорожденных", рекомендованный для ознакомления и использования в работе специалистам учреждений научного профиля, занимающимся вопросами изучения формирования иммунного ответа Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Апробация материалов диссертации
Диссертация апробирована на совместном заседании 1) Ученого Совета
ФГУН "Нижегорордский научно-исследовательский институт
эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора, 2) кафедры молекулярной биологии и иммунологии биологического факультета ГОУ ВПО «Нижегородский Государственный Университет им. Н.И. Лобачевского» Федерального агентства по образованию 3) расширенного межлабораторного научного семинара ФГУН "Нижегорордский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора (протокол №11 от 30.06.10).
Основные материалы работы были доложены на научной конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007), на научной конференции Биосистемы организация поведение управление (Н. Новгород, 2007) и на 2-ой республиканской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2007).
Положения, выносимые на защиту:
1. Выявленные особенности фенотипического созревания дендритных
клеток, свидетельствуют о своеобразной последовательности
событий этого процесса у новорожденных детей.
Характерная продукция цитокинов дендритными клетками новорожденных свидетельствует о специфических функциональных особенностях этих ДК.
Модулированные противовоспалительными агентами дендритные клетки новорожденных обладают менее выраженными толерогенными свойствами, что является предпосылкой для более эффективного развертывания периферического отдела иммунной системы организма ребенка.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 7 - в журналах, рекомендованных ВАК для кандидатских диссертаций, одна статья в иностранном журнале, 4 тезисов докладов, 1 статья в сборнике.
Объем и структура диссертации
Свойства fast,Z]K, полученных с использованием ИЛ-7 и дексаметазона
Ранние исследования показывают, что мышиные миелоидные костномозговые предшественники могут давать популяции макрофагов, гранулоцитов и ДК в присутствии ГМ-КСФ [164]. Подобное развитие ДК было обнаружено в работах с человеческими ДК, где CD34 костно-мозговые предшественники дифференцировались в CDla моноциты, популяцию предшественников гранулоцитов и популяцию бипотенциальных предшественников со способностью давать начало зрелым ДК при культивировании с ГМ-КСФ и ФНОа или давать начало популяции макрофагов при культивировании в присутствии М-КСФ [40]. Большая часть данных о генерации ДК была получена при культивировании этих клеток из моноцитов крови in vitro. Это наиболее распространенное применение сочетания ГМ-КСФ и ИЛ-4 при культивировании моноцитов периферической крови. Процесс дифференцировки также может происходить при трансмиграции моноцитов через слой клеток эндотелия сосудов [130]. Подобный феномен был описан в экспериментах in vivo с моноцитами подкожных тканей [51].
Большинство экспериментов по изучению происхождения миелоидных ДК поставлены на моделях, в которых была проведена трансплантация мышиных общих костномозговых миелоидных предшественников в облученных реципиентов [22]. Оценивалось восстановление популяции ДК и пДК в селезенке и тимусе. Данные показывают, .что популяция таких костномозговых предшественников является гетерогенной по экспрессии Flt3, и что именно фракция Flt3+ предшественников способна давать субпопуляции ДК, которые обнаруживаются в селезенке и тимусе [103]. Из костного мозга мыши были выделены CX3CR1+CD117+ клональные предшественники, способные дать макрофаги и резидентные ДК и пДК селезенки [56].
Развитие ДК из CD34+ предшественников может проходить по двум путям, в зависимости от того получены предшественники из костного мозга или из пуповиной крови. CD34+ предшественники из костного мозга могут дифференцироваться в CD 14" HLA-DRbneht клетки с типичной дендритной морфологией, фенотипом и функцией в течение 4-5 дней культивирования в присутствии ГМ-КСФ, ФНО-а и SCF. Также, CD34+ предшественники могут давать клетки, которые коэкспрессируют CD 14, HLA-DR, CD115 и обладают смешанными функциональными и фенотипическими характеристиками дендритных клеток и макрофагов. Рекультивирование этих CD14+ HLA-DR+ клеток в присутствии ГМ-КСФ и ФНО-а приводит к их дифференцировке в CD14 , HLA-DR"1" дендритные клетки. Напротив, рекультивирование в присутствии M-CSF дает CD14"1" макрофаги. По всей видимости, такие CD14"1" HLA-DR" " клетки являются промежуточным звеном между дендритными клетками и макрофагами [184, 125].
При культивировании CD34+ клеток пуповинной крови также показаны два пути дифференцировки дендритных клеток. Промежуточные предшественники отличаются экспрессией CDla и CD14. При культивировании CD34+ предшественников пуповинной крови в течении 5 дней в присутствии ГМ-КСФ, ФНОа и SCF, культуры состоят из колоний CDla- CD14+ и CDla+ CD14- клеток. Рекультивирование CDla+ CD 14" клеток приводит к появлению дендритных клеток с чертами, присущими клеткам Лангерганса. Они HLA-DRbright CD83+ CD86+ Lag+ E-cadherin+ и содержат в цитоплазме гранулы Бирбека. Дифференцировка клеток Лангерганса из ранних CDla"1" предшественников зависит от TGF-)3 [137]. Напротив, предшественники, транзиторно экспрессирующие CD14, но не CDla, способны давать типичные дендритные клетки, если их культивировать в присутствии ГМ-КСФ и ФНОа. У этих ДК отсутствуют гранулы Бирбека и экспрессируются маркеры типичных дермальных ДК, такие как CD2, CD9, CD68 и фактор ХШа. Интересно отметить, что CDla-CD14+ , но не CDla+CD14" предшественники экспрессируют рецептор M-CSF (c-fmc или CD115) и дифференцируются в макрофаги [184, 13]. ДК лимфоидного происхождения
Ранние исследования резидентных ДК лимфоидных тканей показывают, что тимические ДК и субпопуляции ДК в селезенке и лимфатических узлах мыши экспрессируют маркеры, ассоциированные с лимфоидными клетками, включая такие маркеры как CD8a, CD4, CD2, ВР1 и CD25 [177]. Эти факты говорят о том, что некоторые ДК имеют общее с лимфоцитами происхождение. В костном мозге человека идентифицирована малочисленная популяция Lin-CDS гемопоэтических предшественников, которые экспрессируют CD45RA, HLA-DR, CD38 и; CD10. Эти Lin-CD34+CD10+ предшественники не способны дифференцироваться в клетки миелоидного или эритроидного ряда, но способны трансформироваться в Т-лимфоциты при пересадке в мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, а также в В-лимфоциты, NK-клетки и дендритные клетки в клональных культуральных системах. ДК могут дифференцироваться из Lin-CD34+CD10+ предшественников, без значительной! пролиферации под влиянием смеси цитокинов, включающей ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-7, SCF, ГМ-КСФ, ФНО-a и Flt3L. Полученные таким образом клетки экспрессируют типичные маркеры ДК, хотя не имеют явно выраженной дендритной морфологии в отличие от ДК, полученных в стандартных культурах, при стимуляции ГМ-КСФ [184, 164].
Из тимуса можно выделить популяцию клеток, имеющих фенотип Lin-CD1-CD34+. Популяция этих клеток экспрессирует GD2, CD5, CD7, GD38, CD13, CD45RA, а также низкие уровни CD10 и CD123. Эти клетки.способны дифференцироваться в Т- и NK-клетки в органной культуре эмбрионального тимуса. Из этих же клеток в культуре, содержащей только ИЛ-7 или смесь ИЛ-7, ИЛ-6, ИЛ-1 и ГМ-КСФ, можно получить клетки с фенотипом дендритных и сильной стимулирующей активностью в системе с аллогенными Т-клетками. Как показывают исследования, популяция тимических предшественников также дифференцируется в зрелые дендритные клетки в присутствии смеси цитокинов, необходимых для получения мышиных лимфоидных ДК (ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-7, ФНО-а, SCF, Flt3L и CD154) [183]. Более того, эти Lin"CDl"CD34+ тимусные предшественники не могут давать колонии миелоидного или эритроидного ряда на полутвердом агаре. Однако, эти клетки экспрессируют на своей мембране такие маркеры, как CDllc, CD13, CD33 и CDllb, белки, обычно экспрессируемые большинством ДК миелоидного происхождения [82, 183].
Продукция различных цитокинов дендритными клетками, культивировавшимися в течение 3 суток при различных условиях стимуляции созревания
Сухую среду DMEM растворяли в 930 мл деионизированного бидистиллята (Предприятие бактерийных препаратов ФГУП «Им БиО», г. Нижний Новгород). После полного растворения порошка добавляли 49,3 мл 7,5% раствора бикарбоната натрия. Доводили рН среды до 7,2, а общий объем раствора до 1 л и стерилизовали фильтрацией через фильтры Millipore (USA) с размером пор 0,22 мкм. Стерильную среду разливали во флаконы по 90 мл. Перед использованием во флаконы, вносили по 10 мл эмбриональной телячьей сыворотки. Сыворотку предварительно инактивировали нагреванием при +56С в течении 30 мин., стерильно разливали по-10 мл во флакон и хранили при - 20С до использования. При хранении готовой і 111С (полной питательной среды) более двух недель в- среду дополнительно вносили L-глютамин по 58,4 мг на 100 мл среды.
Объектом исследования являлись МНПК (мононуклеарные клетки периферической крови) новорожденных детей и взрослых здоровых людей. Все работы с клетками крови проводились в стерильных боксах и ламинарном шкафу.
Для выделения МНПК гепаринизированную кровь разводили в 2 раза по объему средой DMEM, наслаивали на Гистопак-1077 (Sigma, USA) в соотношении 3:1 и центрифугировали при 450g в течение 45 минут при комнатной температуре. Слой, содержащий МНПК, собирали с границы раздела фаз в центрифужную пробирку, доводили общий объем до 10 мл средой DMEM и осаждали клетки центрифугированием при 450g в течение 15 минут. Затем надосадок сливали, клетки ресуспендировали в 10 мл среды DMEM и дважды отмывали центрифугированием в течение 10 минут при 450g. Считали количество клеток и определяли их жизнеспособность в камере Горяева.
Для культивирования готовили суспензию МНПК в ППС с концентрацией клеток 3 - 5 106 кл/мл и засевали в объеме 1 мл в 24-луночные полистироловые планшеты (Costar, USA):
2.4. Получение дендритных клеток (классическая схема)
Дендритные клетки получали по стандартному методу культивирования дендритных клеток. Клеточные суспензии свежевыделенных МНПК инкубировали 3 часа при 37 G. Затем неадгезировавшиеся клетки осторожно смывали DMEM (по 1 мл на чашку) 3 раза. Далее внесли DMEM и провели визуальный контроль- под микроскопом. Слили DMEM и залили в лунки ППС (по 750 мкл на лунку): Добавили во все лунки кроме контроля (моноциты) ГМ-КСФ до концентрации 100 нг/мл, а также ИЛ-4 или ИЛ-7 до концентрации 20 нг/мл. Для исследования действия, глюкокортикоидов. на созревание ДК в отдельные лунки вносили ДЕКС до концентрации 0,4 мкг/мл. Культивировали 4 суток при 37 С и 5% СОг. За время культивирования адгезивность клеток существенно1 снижалась. В конце 4-х суток провели пересев культур с заменой 300 мл среды и добавлением цитокинов в тех же концентрациях. На седьмые сутки клетки пересевали в новую среду и добавляли активаторы созревания: ФНОа в концентрации 10 нг/мл, sCD154 - 1 мкг/мл, ЛПС - 1 мкг/мл. По окончании инкубации (в общей сложности 9 суток) часть клеток (2 - ЗхЮ5) отбирали для цитометрического исследования фенотипа. Оставшиеся клетки использовались для определения их функциональных свойств. Для исследования модулирующего влияния ИЛ-10 на свойства ДК использовался рекомбинантный человеческий ИЛ-10 в двух рабочих концентрациях 20 нг/мл и 100 нг/мл.
Для получения ДК в краткосрочных культурах использовали модифицированный метод Обермайера с соавт. [121].
Для культивирования готовили суспензию МНПК в ППС с концентрацией клеток 3 - 5 10б кл/мл и засевали в 24-луночные планшеты по Г мл на лунку. Полученные клеточные суспензии инкубировали 3 часа при 37 С и 5% СОг; Затем неадгезировавшиеся клетки осторожно отмывали DMEM (по 1 мл на лунку) 3 раза. Далее вносили DMEM и проводили визуальный контроль под микроскопом. Сливали DMEM и заливали в лунки среду с ИЛ-4 (20нг/мл) и ГМ-КСФ (100 нг/мл). Для исследования действия глюкокортикоидов-, на созревание- ДК в отдельные лунки ВНОСИЛИ ДЕКС ДО; концентрации 0,4 мкг/мл. Клетки культивировали; 2 суток при 37 G и 5%; СОг- Среду из лунок собирали; для? определения концентрации различных цитокинов и хранили при - 20 С до иммуноферментного анализа..
Затем среду из лунок собирали и вносили свежую среду, добавляли активаторы созревания в тех же концентрациях что; и в длинной системе. Через сутки часть клеток брали на исследование фенотипа,.остальные шлиша дальнейшие эксперименты. Среду из лунок также собирали; для определения концентрации цитокинов.
Одновременное культивирование обычных fastHK, и fast/IK модулированных в ходе созревания дексаметазоном в смешанной лейкоцитарной реакции
В данной работе, помимо ФНОа в качестве активаторов дозревания дендритных клеток использовались липополисахарид Salmonella typhi (ЛПС) и растворимая форма рекомбинантного человеческого CD40L (sCD154), а также их смесь с ФНОа.
Молекула GDI54 экспрессируется на Т-лимфоцитах и является костимулирующеи по отношению к дендритным клеткам в процессах их терминального созревания. Данная молекула, при образовании иммунного синапса ДК и лимфоцита, связывается с молекулой CD40, которая экспрессируется на мембране дендритных клеток. Это в свою очередь запускает процессы терминального созревания ДК [113].
Липополисахарид выступает в; качестве активатора дендритных клеток как микробный паттерн, связывающийся с рецептором TLR4 на ДК. Использование смеси активаторов позволила нам смоделировать близкий к реальному процесс терминального созревания fastflK. При воздействии на незрелые fastflK ФНОа в составе смеси активаторов моделируется провоспалительный сигнал, получаемый дендритными клетками в очаге воспаления от макрофагов, эндотелия сосудов и др. Воздействие ЛПС на fastflK сравнимо с влиянием компонентов клеточной стенки микроорганизмов на созревание дендритных клеток при бактериальной инфекции. И наконец, добавление в среду растворимой формы CD 154 моделирует костимулирующий эффект лимфоцитов на созревание fastflK. Процесс терминального созревания в таком случае происходит еще до контакта дендритных клеток с мембранной формой CD154 на поверхности Т-лимфоцитов в СЛР. При анализе фенотипа fastJJK пуповинной крови новорожденных детей и взрослых, активированных на втором этапе созревания посредством sCD154, ЛПС или их смеси с ФНОа показано, что в культуре появляются fastflK практически не отличающимся по фенотипу от fastflK, активированных ФНОа.
Помимо исследований фенотипических особенностей fastflK, полученных при различных условиях стимуляции, нами проведены исследования функциональных свойств этих клеток. На рис. 14 представлена продукция ИФНу лимфоцитами в культурах СЛР при контакте последних с fastflK. Наибольшей стимулирующей активностью по отношению к аллогенным Т-лимфоцитам обладают fast,HK-4, активированные на втором этапе созревания ЛПС, а также смесью активаторов. Также, большая концентрация ИФНу наблюдается в культурах СЛР с fast,HK-7, активированных смесью активаторов. Более того,1 в культурах СЛР с fast,HK-4 и fastflK-7 при1 индукции терминального созревания fastflK посредством ЛПС и смеси активаторов, значения продукции- ИФНу намного» выше, чем при использовании в качестве активатора только ФНОа. Растворимая форма CD 154 оказывает на fastflK менее выраженный эффект, и значимая продукция ИФНу наблюдается только в культуре с fastflK-4. Использование ИЛ-7 на первом этапе созревания моноцитов в дендритные клетки, при активации sCD154 практически не дает полученным дендритным клеткам способность индуцировать продукцию ИФНу.
Как и предполагалось, дексаметазон подавляет ИФН-индуцирующую активность fastflK вне зависимости от использованных активаторов второго этапа созревания.
Кроме того, существенных отличий в индукции ИФНу между fastHK новорожденных детей и взрослых в рамках данной серии экспериментов выявлено не было. 500
Продукция ИФНу в культурах fastflK, активированных на втором этапе созревания ФНОа, sCD154, ЛПС и смесью этих активаторов. Звездочкой обозначены статистически значимые отличия от продукции ИФНу нестимулированными лимфоцитами и лимфоцитами, росшими с моноцитами. Треугольником обозначены значимые отличия от fastHK, активированных ФНОа. Описание функциональных свойств fastflK, стимулированных разными активаторами было бы не полным без анализа способности fastflK индуцировать пролиферацию у аллогенных Т-лимфоцитов. Результаты подсчета пролиферативного ответа Т-лимфоцитов представлены на рис. 15. Данные по пролиферации лимфоцитов при контакте с fastflK взрослых и детей приведены вместе, так как в процессе анализа данных не было выявлено существенных различий в функциональных свойствах между обоими типами fast,TJK. Как и следовало ожидать, наиболее мощным стимулирующим эффектом по отношению к Т-лимфоцитам обладают fastnK-4 и fast,TJK-7. При активации созревания fast K посредством ФНОа и sCD154 наблюдается статистически значимые отличия в индукции пролиферативного ответа, между fast,HK-4 и fast,ZlK-7. Применение ИЛ-7 при дифференцировке моноцитов в дендритные клетки дает несколько сниженную стимулирующую способность fast,ZIK-7 по отношению к аллогенным Т-лимфоцитам.
Картина изменяется при" использовании в. качестве активаторов терминального созревания ЛПС и смеси активаторов. Значения пролиферативного ответа на fast,3K-4 и fast,HK-7 становятся практически одинаковыми за счет увеличения митогенной активности fastflK-7, активированных ЛПС, смесью активаторов по сравнению с ФНОа.
Наибольшие средние значения пролиферативного» ответа наблюдаются при активации fastflK-4 посредством sCD154. Средние значения пролиферативного ответа в культурах с fast,HK-4 при активации ФНОа, ЛПС и смесью активаторов статистически значимо не отличаются.
Последовательная стимуляция аллогенных лимфоцитов модулированными и обычными дендритными клетками, культивировавшимися в течение 8 суток
Продукция ИЛ-ір дендритными клетками заслуживает отдельного внимания. Моноциты характеризуются высоким уровнем продукции ИЛ-ір, что напрямую связано с его провоспалительными свойствами. Культивирование моноцитов в присутствии ГМ-КСФ индуцирует дополнительное двукратное увеличение продукции ИЛ-1 р. Данный факт можно объяснить созреванием моноцитов под действием ГМ-КСФ в клетки со свойствами характерными для макрофагов. Следует отметить, что созревшие культуры, росшие в присутствии одного, ГМ:КСФ; содержат значительное количество клеток с макрофагоподобной морфологией. Использование смеси ИЛ-7 и ГМ-КСФ дает тот же эффект на продукцию» ИЛ-1. В то же время, индукция созревания ДК с помощью ИЛ-4 и ГМ-КСФ значительно снижает продукцию ИЛ-1р. Дальнейшее созревание ДК под действием ФНОа, ЛПС, SCD154 вызывает дополнительное падение продукции ИЛ-ір; Не выявлено различий в. продукции ИЛ-ір между ДК детей и взрослых, что; возможно, характеризует данную- сторону естественной системы запуска воспаления у новорожденных вполне сформированной уже на начальных этапах развития ребенка..
Помимо особенностей созревания ДК новорожденных при различных условиях культивирования, в данной работе большое внимание уделено вопросам изменения, функциональных свойств ДК, как взрослых, так и новорожденных под действием модулирующих агентов. Модуляция свойств ДК веществами с иммуносупрессорными свойствами (дексаметазон, ИЛ110) приводит к колоссальным изменениям в морфологии, фенотипе и функции получаемых ДК. Эти изменения ярко выражены уже на начальных этапах созревания моноцитов в дендритные клетки и выявляются в трехсуточной системе культивирования fast,HK.
Действие дексаметазона откладывает отпечаток на экспрессию всех маркеров ДК. У fast-ДК-ДЕКС и восьмисуточных ДК-ДЕКС резко падает экспрессия молекул CD80, CD83 и CD86. Низкий уровень экспрессии костимулирующих молекул часто рассматривается как признак незрелости ДК. Однако, такой интерпретации результатов противоречит снижение остаточной экспрессии моноцитарного маркера CD 14 на обработанных дексаметазоном ДК новорожденных. Неожиданным проявлением действия дексаметазона является крайне высокая плотность экспрессии HLA-DR, а процент клеток, несущих данный маркер, стремится к 100%. Такие показатели экспрессии характерны в первую очередь, как это ни странно; для fast,ZIK-7-,DEKC. Данный факт наводит на мысль о том, что кооперация сигналов от рецептора для ИЛ-7 и внутриклеточных рецепторов глюкокортикоидов каким-то специфическим образом влияет на особенности экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости, как это имеет место в процессах поликлональнойактивации Т-лимфоцитов новорожденных детей после культивирования в среде с ИЛ-7 и дексаметазоном [3]. Возможно, синергизм действия дексаметазона и смеси ИЛ-7 и ГМ-КСФ обусловлен описанным ранее стимулирующим действием глюкокортикоидов на экспрессию генов цепей рецепторов.для этих цитокинов.
Стимулирующая способность обработанных дексаметозоном ДК по отношению к аллогенным лимфоцитам резко снижена, причем это одинаково характерно как для краткосрочных ґавіДК-ДЕКС, так и для восьмисуточных ДК-ДЕКС. Внесение интерлейкина-10 в культуру ДК также снижает стимулирующую способность последних. Нет отличий между дендритными клетками новорожденных и взрослых, обработанных дексаметазоном в плане олигоклональной стимуляции аллогенных лимфоцитов.
Наиболее существенные отличия дендритных клеток новорожденных и взрослых проявляются в продукции самими дендритными клетками ИЛ-10. Незрелые fastnK взрослых продуцируют значительные количества ИЛ-10; при этом наибольшая концентрация; этого цитокина обнаруживалась в двухсуточных культурах незрелых fastflK-4. В. то же время;., моноциты и незрелые fastflK новорожденных оказались чрезвычайно слабыми продуцентами ИЛ-10. Как известно ИЛ-10 является- фактором, сдерживающим пролиферацию и функционирование Т-лимфоцитов, особенно Т-хелперов; первого типа. Дефицит продукции ИЛ-10 незрелыми ДК новорожденных может являться одним из факторов;, создающих основу процесса развертывания! периферического, отдела: иммунной системы -бурной поликлональной;; пролиферации Т-клеток, регистрируемой в раннем детском возрасте;
Дексаметазон; угнетал продукцию ИЛ-10 незрелыми: дендритными; клетками детей и взрослых. После добавления ФНОсц. sGD154 , ЛИС или их смеси ситуация с продукцией ИЛ-10 заменялась, на зеркально! противоположную: fastflK детей и взросльщ.ранее подвергавшиеся-действию дексаметазона, начинали синтезировать, чрезвычайно большие количества ИЛ-10, тогда как продукция; ИЛ-10 в; необработанных дексаметазоном культурах fast,Z]K оставалась незначительной; или; прекращалась вовсе. Особенно- высокие концентрации ИЛ-10 продуцировали обработанные дексаметазоном ДК после их стимуляции-. ЛШЄ, использованным отдельно или в; смеси с другими стимуляторами.. Вероятно, данный, эффект связан с высоким уровнем фосфорилирования,. регулируемой; внеклеточными-сигналами киназой (ERK), что непосредственным; образом.; влияет на! продукцию? ИЛ-101 дендритными клетками. Действие глюкокортикоидов на процесс; фосфорилирования ERK доказан- Xia с соавт. [188,.. 127, 101]. Дополнительный эффект привносит аутокринная стимуляция продукции ИЛ-10 через,его рецептор. Кроме того, применение в качестве модулятора ИЛ-10 в некоторых вариантах экспериментов имеет прямое действие на ДК в плане
