Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 13
1.1. Влияние микрогравитации на культивируемые клетки 13
1.2. Влияние клиностатирования на культивируемые клетки 19
1.3. Морфофункциональные характеристики эндотелия 24
1.4. Морфофункциональные характеристики мезенхимальных стволовых клеток человека 31
1.5. Цитоскслет, структура и функции. Изменения цитоскелета в условиях измененной силы тяжести 44
1.6. Цитокины и их функция в организме 50
1.7. Молекулы клеточной адгезии 57
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 61
1. Культуры клеток 61
1.1. Химические реактивы, культуральные среды и пластик 61
1.2. Приготовление сыворотки пуповинной крови 61
1.3. Выделение и культивирование эндотелиальных клеток пупочной вены человека 62
1.4. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека 63
1.5. Криоконсервация мезенхимальных стволовых клеток человека 64
2. Исследование свойств клеточных культур в условиях измененного вектора гравитации 64
2.1. Моделирование гипогравитации 64
2.2. Анализ пролиферативной активности эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток человека 66
2.3. Выявление актиновых филаментов методом флуоресцентной микроскопии 67
2.4. Определение количественного содержания цитокинов в культуральной среде мезенхимальных стволовых клеток и эндотелиальных клеток человека 67
2.5. Исследование экспрессии молекул клеточной адгезии 70
2.6. Проточная цнтофлуориметрия 71
2.6.1. Фенотипирование МСК костного мозга человека 71
2.6.2. Оценка жизнеспособности клеток после криоконссрвации 73
2.7. Статистический анализ 74
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 75
1. Исследование влияния клиностатирования на культуру эндотелиальных клеток пупочной вены человека 75
1.1. Характеристика эндотелиальных клеток пупочной вены человека 75
1.2. Пролиферативная активность эндотелиальных клеток пупочной вены человека при клиностатировании 77
1.3 Ремоделирование актиновых филаментов культивируемых эндотелиальных клеток человека в условиях клиностатирования 85
1.4, Определение количественного содержания цитокинов в культуральной среде ЭК человека 101
1.5. Исследование экспрессии молекул клеточной адгезии при клиностатировании 104
2. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека в условиях клиностатирования 107
2.1. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека 107
2.2. Оценка жизнеспособности МСК человека после криоконсервации 113
2.3. Анализ пролиферативной активности мезенхимальных стволовых клеток человека при клиностатировании 114
2.4. Ремоделирование актиновых филамснтов мезенхимальных стволовых клеток человека в условиях клиностатирования 118
2.5. Определение количественного содержания цитокинов в культуралыюй среде МСК человека 125
2.6. Иммунофенотипнрование МСК после клиностатирования 128
Заключение 134
Выводы 141
Список литературы 143
- Цитоскслет, структура и функции. Изменения цитоскелета в условиях измененной силы тяжести
- Определение количественного содержания цитокинов в культуральной среде мезенхимальных стволовых клеток и эндотелиальных клеток человека
- Пролиферативная активность эндотелиальных клеток пупочной вены человека при клиностатировании
- Анализ пролиферативной активности мезенхимальных стволовых клеток человека при клиностатировании
Введение к работе
Гравитация является фундаментальной основой, определяющей нормальное функционирование и морфологию организмов на протяжении всего существования органического мира. Развитие жизни на Земле происходило в условиях постоянного гравитационного поля, и как следствие, структура и функции органов, тканей и всего организма в течение длительной эволюции многих поколений приспосабливались к этим условиям.
Одним из основных факторов космического полета, изменяющим привычное существование человека, является невесомость. В настоящее время существует большое количество данных, демонстрирующих влияние измененной силы тяжести на состояние физиологических систем живых организмов [Газенко, 1984; Григорьев, Егоров, 1997; Kozlovskaya et al, 1981; Oganov et al, 2000]. Исследования, проведенные в условиях космического полета и в модельных экспериментах, свидетельствуют, что вряд ли найдется система, неизменно функционирующая в условиях гипогравитации и невесомости. И хотя клеточные механизмы наблюдаемых изменений до настоящего времени остаются не до конца ясными, совершенно очевидно, что на один из основных вопросов гравитационной биологии - о возможности влияния измененной силы тяжести на клетку, однозначно можно ответить положительно. Большое число экспериментальных данных, выполненных на разных типах клеток в условиях космического полета и моделируемой гипогравитации, неоспоримо свидетельствуют, что клетка является структурой, чувствительной к гравитационному стимулу и отвечает на него изменением структуры и функциональной активности [Таирбеков, 2002; Gmiinder, Cogoli, 1988; Cogoli et al, 1989; Cogoli, Gmunder, 1991; Buravkova, Romanov, 2000].
Одним из наиболее перспективных направлений исследований в космической биологии и медицине должно стать изучение клеточных механизмов, определяющих изменения, происходящие в живом организме в условиях измененной силы тяжести, и определение компонентов, обуславливающих взаимосвязь клеточного и организменного уровня организации живой системы. Накопленный к настоящему времени экспериментальный материал о структурно-функциональной организации и морфологических характеристиках различных типов клеток в условиях измененной силы тяжести дает основание выдвинуть ряд предположений о путях и способах адаптации живых систем к условиям гипогравитации на клеточном уровне [Романов, Буравкова, 2000; Таирбеков, 2002; Cogoli et al, 1990; Lewis, 1999; Lewis, 2002]. Тем не менее, вопрос о механизмах влияния гравитационного фактора на функционирование организма человека на уровне клеточной организации крайне сложен и до сих пор остается открытым. Несомненно, что его решение важно как для формирования представлений о процессах, лежащих в основе перестроек живых организмов в условиях микрогравитации, и в первую очередь, человека, так и для использования результатов исследований в практике космической биологии и медицины с целью совершенствования систем жизнеобеспечения и разработки космических биотехнологий.
Актуальность исследования. Исследования, проведенные с использованием различных клеточных моделей в условиях реальной и моделируемой микрогравитации выявили разнообразные морфофункциональные изменения культивируемых клеток [Cogoli, Tschopp, 1984; Genty, 1993, Hammond et al, 2000; Papaseit et al, 2000]. При этом различия в выявленных эффектах могут быть объяснены как различной гравичувствительностью клеток, так и методами моделирования и исследуемыми параметрами. Концепция о гравитационной индифферентности клеток, выдвинутая в 1970ых — 1980ьгх годах прошлого столетия [Парфенов, 1981; Таирбеков,
Парфенов, 1981], в настоящее время существенно скорректирована [Cogoli, 1996; Schmitt et al, 1996; Lewis et al, 1998; Hughes-Fulford, 2001; Романов, Буравкова, 2000; Таирбеков, 2002].
Несмотря на широкий спектр используемых в гравитационной биологии клеточных культур, чувствительность эндотелиальных клеток к гравитационному стимулу не изучалась, хотя результаты фундаментальных исследований говорят о непосредственном участии клеточных элементов сосудистой стенки в формировании ответа организма на микрогравитацию [Convertino ct al, 1997]. Например, в экспериментах с моделированием измененной силы тяжести была выявлена реорганизация структуры сосудов крыс [Мао et al, 1998]. В основе регистрируемых эффектов микрогравитации, таких как снижение объема циркулирующей крови, нарушение регуляции сосудистого тонуса, ортостатическая неустойчивость, могут лежать изменения реактивности сосудов и модификация составных компонентов сосудистой стенки, в том числе, и эндотелия [Zhang, 2001].
К тому же известно, что именно эндотелий, обладая механочувствительностью, регулирует сосудистый тонус через взаимодействие с гладкомышечными клетками [Ткачук, 1998; Tkachuk, Voyno-Yasenetskaya, 1991; Ivanov et al, 2001; Vanhoutte, Mombouli, 1996] и, следовательно, может играть важную роль в функционировании сердечно-сосудистой системы в условиях измененной гравитации. Немаловажным фактором, привлекающим внимание к исследованию свойств эндотелия, является его биологическая активность, а также участие в воспалительных и иммунных реакциях организма, регуляции кроветворения и процессов свертывания крови [Becker et al, 2000].
Снижение пролиферативной активности разных типов клеток, ингибирование митогенных сигналов в условиях микрогравитации [Rucci et al, 2002; Hughes-Fulford, Lewis, 1996], а также атрофические перестройки опорно-двигательного аппарата
[Oganov et al, 1991; Шенкман, 2002], изменение способности к восстановлению и самообновлению тканей в условиях космического полета [Mitashov et al, 1996] позволяют предположить, что в основе действия механических факторов (в том числе микро гравитации) на опорно-двигательный аппарат могут лежать морфофункциональные модификации мезенхимальных стволовых клеток (МСК), точнее перестройка их функциональной активности, и способности диффреренцировки в тканевые элементы. Возможно, именно такие изменения могут приводить к нарушению процессов физиологической регенерации тканей, особенно костной и мышечной, преобразованию их клеточного, белкового и минерального состава, так как известно, что обновление тканей организма человека и их репарация в случае повреждения осуществляются при непосредственном участии низкодифференцированных клеток-предшественников, так называемых «стволовых клеток».
Основным источником стволовых клеток у взрослых организмов является костный мозг, способный генерировать как гемопоэтическис, так и мезенхимальные клетки, которые могут дифференцироваться в большинство известных клеточных типов, таких как остеобласты, хондроциты, адипоциты, а также другие типы клеток. Недавно несколькими исследовательскими группами описано получение эндотелиальных клеток и их предшественников из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга [Reyes et al, 2002; Pittenger, Martin, 2004; Oswald et al, 2004]. Это открывает широкие перспективы для использования костномозговых клеток в терапевтических целях. МСК могут являться источником эндотелиальных клеток и участвовать в ангиогенезе трансплантированных органов, ишемических тканей и восстановлении поврежденных сосудов [Kassem et al, 2004; Tateishi-Yuyama et al, 2001; Pittenger, Martin, 2004].
Таким образом, исследования свойств низкодифференцированных мезенхимальных стволовых клеток — элемента слаженной системы функционирования органов
человека в условиях измененной силы тяжести становится необходимым и важным наряду с изучением другого ее значимого компонента, тесно связанным с МСК -дифференцированным сосудистым эндотелием.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение
морфофуїікционапьньїх особенностей эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток человека в модельных условиях измененной силы тяжести in vitro.
В соответствии с поставленной целью решались следующие основные задачи:
- исследование пролиферативной активности эндотелиальных клеток человека при
длительном клиностатировании;
- изучение особенностей организации актинового цитоскелета ЭК человека в
условиях измененного вектора гравитации;
определение продукции цитокинов и экспрессии молекул адгезии эндотелиальными клетками при клиностатировании;
- отработка методов культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного
мозга человека, изучение пролиферативной активности и экспрессии маркеров
МСК при длительном клиностатировании;
исследование особенностей организации актинового цитоскелета мезенхимальных стволовых клеток человека в условиях измененного направления вектора гравитации;
- определение продукции цитокинов МСК при длительном изменении вектора
гравитации in vitro.
Научная новизна. Получены первые доказательства высокой чувствительности
культивируемых ЭК пупочной вены человека и МСК костного мозга человека к
изменению гравитационного окружения. Впервые выявлено угнетение
пролиферативной активности культивируемого эндотелия при длительном воздействии измененного направления вектора гравитации. Впервые установлено, что
реорганизация архитектуры актиновых филамептов эндотелия начинается уже в первые часы клиностатирования, при этом ремоделирование в ответ на изменение гравитационного окружения носит обратимый характер и протекает быстрее, чем его восстановление. Выявленное увеличение концентрации «стрессового» провоспалитсльного цитокина ИЛ-6 (интерлейкина-6) в культуральной среде эндотелиальных клеток после кратковременного клиностатирования также указывает на их чувствительность к гравитационному стимулу.
Впервые показано снижение пролиферативной активности культивируемых МСК человека при длительном клиностатировании, которое является обратимым и восстанавливается при возвращении клеток в стандартные условия культивирования. Выявлена реорганизация структуры актинового цитоскелета как в первые часы изменяющегося вектора гравитации, так и при более длительном воздействии. Установлено повышение концентрации ИЛ-6 в культуральной среде МСК человека при кратковременном клиностатировании. Впервые показано изменение экспрессии клеточных маркеров a-SMA (a-актина гладкомышечных клеток), CD105, HLA class I при длительном культивировании под воздействием измененного гравитационного микроокружения.
Научно-практическая значимость работы. Представленные экспериментальные
данные являются важным шагом на пути к пониманию механизмов действия
гравитационного сигнала на клетку. Результаты исследования способствуют
расширению сложившихся представлений о клеточной биологии эндотелия и
мезенхимальных стволовых клеток человека в условиях измененного
гравитационного окружения. Полученные данные позволяют приблизиться к более
глубокому пониманию влияния измененной гравитации на
низкодифференцированные стволовые и дифференцированные эндотелиальные клетки человека. Результаты работы необходимо учитывать при анализе
функциональных изменений сердечно-сосудистой системы и процессов регенерации в условиях микрогравитации.
Положения, выносимые на защиту:
Экспериментально доказана гравитационная чувствительность культивируемых эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток человека.
Условия измененной силы тяжести (клиностатирование) приводят к реорганизации элементов цитоскелета (F-актин) ЭК и МСК, при этом перестройка структуры актиновых филаментов носит обратимый характер.
При одновременном действии клиностатирования и активации клеток провоспалительным цитокином ФНОа модифицируется экспрессия молекул клеточной адгезии (Е-селектина, VCAM-1, ICAM-1) на поверхности ЭК, что может приводить к изменению взаимодействия «клетка - субстрат» и «клетка — клетка».
Различные типы культивируемых клеток человека: дифференцированные (ЭК) и низкодифференцированные (МСК) демонстрируют сходные ответные реакции, проявляющиеся в снижении пролиферативной активности, увеличении продукции ИЛ-6 и перестройке актинового цитоскелета.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2003 г.), Конференциях молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2003,2004, 2005 г.), 54th International Astronautical Congress (Bremen, Germany, 2003 г.), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность», посвященном памяти академика Г.М. Франка (Пущино, Россия, 2004), 25th International Gravitational Physiology Meeting (Moscow, 2004), Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005).
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая биология и физиология».
Цитоскслет, структура и функции. Изменения цитоскелета в условиях измененной силы тяжести
Исследование процессов, происходящих в клетке - структурной и функциональной единицы организма, является основой для понимания механизмов функционирования живых существ в условиях измененной силы тяжести. Космические эксперименты составляют важную часть гравитационной клеточной биологии, которая исследует действие гравитации на организмы на клеточном уровне.
Достаточно хорошо изучены свойства клеток крови и иммунной системы в космических полетах на биоспутниках, космических кораблях и орбитальных станциях, что отчасти объясняется доступностью материала и удобством ведения таких культур. Исследования, проведенные на Spacelab SLS-1 с использованием активированных конканавалином А Т-лимфоцитов и моноцитов, закрепленных на микрочастицах, показали, что митогенная активность у прикрепленных клеток в условиях гипогравитации была вдвое выше, чем у контрольных и ингибировалась у неприкрепленных лимфоцитов [Becher et al, 1992; Cogoli et al, 1993]. В ресуспепдированных клетках продукция ИЛ-1 моноцитами была практически равна нулю по сравнению с контролями, также достаточно низкой в условиях космического полета была экспрессия ФНО-а. Увеличение митогепной активности Т-лимофоцитов на микроносителях кореллировало с увеличением ими продукции ИФН-7 и ИЛ-2 в условиях микрогравитации по сравнению с контролями [Cogoli et al, 1993]. Исследования лимфоцитов, активированных конканавалином А выявили агрегацию клеток в условиях микрогравитации [Cogoli et al, 1984]. Лимфоциты выглядели сильно поврежденными, тогда как контрольные клетки обладали нормальной митотической активностью и полноценно функционировали. Ультраструктурные изменения, наблюдаемые в лимфоцитах, могли быть связаны с процессами апоптоза в условиях микрогравитации, что согласовывалось с данными о синтезе ДНК [Cogoli et al, 1993]. Архитектура и организация моноцитов выглядела интактной, но мембрана обладала большим количеством псевдоподий [Cogoli et al, 1988,1993]. Клетки, которые культивировались на микрочастицах, обнаруживали сильное прикрепление к субстрату в условиях микрогравитации, и меньше изменялись по сравнению с суспензионными [Cogoli et al, 1993]. Эти результаты указывают на изменение адгезивных свойств в условиях микрогравитации.
Интересные данные были получены в экспериментах по исследованию межклеточного взаимодействия NK-лимфоцитов и клеток линии К562 человека, проведенных на борту МКС. Объединение суспензии двух культур осуществляли в условиях микрогравитации, и затем после инкубации отделяли Намеченные клетки на специальный фильтр. Результаты показали, что лимфоциты - естественные киллеры сохраняли цитотоксическую активность к клеткам-мишеням в условиях микрогравитации. Продукция ИФН-у во время взаимодействия иммунных клеток и клеток-мишеней не изменялась по сравнению с наземными образцами [Buravkova et al, 2004].
Неоднозначные данные получены при культивировании гибридом в условиях космического полета. Так, во время двух полетов на Spacelab с участием клеток-гибридом, полученных при слиянии клеток миеломы и В-лимфоцитов, не выявили различий в пролиферации между опытными и контрольными образцами [Beaure d Augeres et al, 1986]. С другой стороны, гибридомы линии 7E3-N, продуцирующие моноклональные антитела против липосахаридсвязывающего белка, культивировали в Biorack на Spacelab IML-1 [Bechler et al, 1993]. Было показано увеличение скорости пролиферации, подтвержденное данными о синтезе ДНК, при длительном культивировании, по сравнению с контролями. При кратковременном культивировании (в течение 2 суток) значительных изменений пролиферативной активности выявлено не было. В то же время гравитационная разгрузка оказывала влияние на метаболизм гибридом. Продукция клетками моноклональных антител, потребление глюкозы и глутамина, а также секреция лактата и аммония были более низкими по сравнению с контролем, несмотря на увеличение скорости пролиферации.
В экспериментах с клетками эмбриональных легких человека линии WI38, культивируемых в течение длительного времени (28 дней) на Skylab не было замечено влияния гипогравитации на lag-фазу или скорость роста клеток, хотя наблюдалось увеличение потребления глюкозы из среды культивирования по сравнению с наземными контролями [Montgomeri et al, 1978]. Кинематографическая съемка, фазовая, электронная и сканирующая микроскопия не обнаружили изменений в структуре клеток и клеточной миграции в условиях полета.
Исследование культур HeLa клеток, последовательно подвергнутых пяти - шести орбитальным полетам не выявило изменений митотического индекса [Zhukov-Verezhnikov etal, 1971].
Во время двух полетах на шаттлах проведено исследование эритроцитов, полученных от разных доноров (здоровых и больных), находящихся в аутологичной плазме и хранившихся при температуре окружающей среды. Результаты продемонстрировали сильное снижение агрегации клеток по сравнению с наземными контролями, которое авторы объясняли изменением функциональной активности мембран в условиях микрогравитации [Dintenfass et al, 1986, 1990].
На клетках крови были поставлены эксперименты по изучению апоптоза - важного процесса, регулирующего баланс пролиферации и гибели клеточных популяций, в условиях измененной силы тяжести. На борту шаттла STS-76 были проведены исследования с культурами клеток Jurkat (производных Т-лимфоцитов и клеток лейкемии). После 4 часов микрогравитации было выявлено увеличение количества апоптотических клеток по сравнению с наземным контролем и повышение количества растворимого Fas/APO-І-белка в культуральной среде [Lewis et al, 1998]. Повторное использование в экспериментах на борту шаттлов STS-80, 95 культур той же линии продемонстрировало зависимость увеличения высвобождения растворимого Fas/APO-1 - белка от факторов времени и микрогравитации. Также в культурах наблюдали увеличение количества клеток, экспрессирующих мембраносвязанный белок Fas и повышение числа апоптотических клеток в условиях измененной силы тяжести [Gubano, Lewis, 2000].
Определение количественного содержания цитокинов в культуральной среде мезенхимальных стволовых клеток и эндотелиальных клеток человека
Для подсчета количества клеток использовали метод компьютеризированной видео-микроскопии (использовался микроскоп Axiovert 25 (Zeiss, Германия), оборудованный цифровой видеокамерой Mintron OS-75D, (Тайвань); изображение передавалось на компьютер через видеокарту с отдельным входом). Клетки на полученных фотографиях подсчитывали с использованием программы анализа SigmaScanPro (Sigma-Aldrich, США). Фотографирование опытных и контрольных культур ЭК человека проводили через 2, 4, 8, 24 часа культивирования с последующим возвращением клиностатированных клеток на 4 часа в стандартные условия роста, а также через 48, 72, 96, 120 и 144 часа с последующим культивированием клиностатируемых клеток в стационарных условиях в течение 24 часов. Фотографирование МСК человека производили через 24, 48, 72, 120 часов и 144 часа культивирования с последующим возвращением клиностатируемых культур на 24 часа в стандартные условия роста. Для получения статистически значимых результатов было произведено по 6 серий экспериментов in vitro с МСК и ЭК человека в трех повторах. В каждом флаконе было изучено не менее трех стационарных полей (равные полям зрения микроскопа площадью 1,55 мм ), в которых подсчитывали число клеток.
Выявление актиновых филаментов методом флуоресцентной микроскопии. Для выявления актиновых филаментов (F-актина) культуры отмывали от среды роста солевым раствором Эрла, фиксировали 4% раствором параформальдегида на фосфатном буфере Дульбекко с добавлением 0,1% раствора тритона Х-100 в течение 15 мин [Lacerda et al, 1996]. Для окрашивания F-актиновых волокон клетки выдерживали 15 минут в 1мкг/мл растворе РИТЦ-фаллоидина. Затем культуры клеток отмывали фосфатным буфером Дюльбекко. Готовые препараты анализировали и осуществляли цифровую фотосъемку на флуоресцентном микроскопе Axiovert 25 или Axiovert 200 (Zeiss) (К = 450 - 490 нм).
Определение количественного содержания цитокинов в культуральной среде мезенхимальных стволовых клеток и эндотелиальных клеток человека. Уровень интерлейкинов измеряли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов "Human IL-la", "Human IL-6", "Human TNF-a", "Human VEGF" в среде роста контрольных культур мезенхимальных стволовых клеток и культур после клиностатирования. Система основана на твердофазной сэндвич-ферментативной иммуносорбентной количественной методике. На первой стадии к носителю с иммобилизированными антителами к цитокинам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе первой инкубации на твердой фазе образуется специфический комплекс антиген-антитело. Носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют биотилинизированные вторые моноклональные антитела, специфично связывающиеся с антигеном. После удаления излишка вторых антител добавляется стрептовидин-пероксидаза (фермент), который взаимодействует с биотилинизированными антителами, завершая образование четырехкомпонентного «сэндвича». Таким образом, на стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизированных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения в литературе названия «сэндвич» - метод [Егоров и др., 1991]. После отмывки - удаления несвязавшегося фермента добавляется субстрат, который создает фермент-субстратный комплекс, дающий окрашивание. Интенсивность полученного окрашенного продукта прямо пропорциональна концентрации цитокина, присутствующего в пробе.
Для анализа пробы среды роста МСК, каждую в двух повторностях, отбирали из культуральных флаконов с рабочей площадью поверхности 25 см2 непосредственно после 2, 4, 6 и 24 часов клиностатирования и замораживали при t= -30С. Также определяли уровень интерлейкинов в среде роста контрольных культур ЭК человека и опытных культур после 3, 5 и 24 часов воздействия измененного вектора гравитации, отбор и хранение проб осуществлялось по схеме, использованной для МСК.
Для определения количественного содержания цитокинов пробы размораживали непосредственно перед измерением при t = +37С в термостате (Sanyo, Япония).
При измерении уровня ИЛ-1а в культуральной среде стандартный дилюентный раствор помещали в ячейки «бланка» (нулевого контроля). Одновременно стандартный калибровочный раствор с концентрацией 3,9 пг/мл - 500 пг/мл, опытные и контрольные образцы помещали в ячейки планшета и дополнительно вносили инкубационный раствор во все ячейки, кроме нулевого контроля. Добавляли коньюгат биотина (биотинилизированные антитела к ИЛ-1а) во все ячейки кроме ячеек «бланка» и перемешивали содержимое планшета. Затем планшет накрывали защитной пленкой и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После окончания периода инкубации раствор удаляли, промывали ячейки 4 раза промывочным буфером и высушивали на промывателе для планшет PW 40 (Bio-Rad Laborarories, США), Во все пустые ячейки помещали раствор стрепгавидина-HRP, кроме ячеек бланка. Планшет снова накрывали защитной лленкой и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации раствор удаляли, ячейки промывали 4 раза промывочным буфером и высушивали на планшетном промывателе. Во вес ячейки добавляли раствор стабилизирующего хромагена и инкубировали в течение 15—20 минут при комнатной температуре в темноте. В конце периода инкубации раствор приобретал голубую окраску. Реакцию останавливали добавлением ингибирующего раствора. Сигналом о завершении реакции служило изменение цвета раствора с голубого на желтый. Планшет перемешивали и анализировали на планшетном фотометре PR 21100 (Bio-Rad laboratories, США) . = 450 им).
При измерении уровня ИЛ-6 стандартный калибровочный раствор с концентрацией от 7,8 пг/мл до 500 пг/мл, опытные и контрольные пробы помещали в ячейки планшета. Одновременно в ячейки бланка помещали стандартный буфер. Во все ячейки добавляли конъюгат биотина (биотинилизированного антитела к ИЛ-6), кроме ячеек бланка и перемешивали их содержимое. Затем планшет накрывали защитной пленкой и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Дальнейший анализ совпадал с протоколом для Ш1-1а.
Пролиферативная активность эндотелиальных клеток пупочной вены человека при клиностатировании
Изменение пролиферации в условиях измененной силы тяжести было показано на разных типах клеток, таких как лимфоциты, остеобласты, фибробласты [Таирбеков, 1997; Cogoli et al, 1993; Hughes-Fulford, 2003]. Эти данные позволяют предположить, что если ЭК чувствительны к гравитационному стимулу, - они должны отвечать соответствующим изменением скорости роста. Для проверки данного предположения были исследована пролиферативная активность культуры эндотелиальных клеток in vitro в условиях кратковременного и длительного клиностатирования.
Полученные результаты не выявили значительных изменений пролиферации в первые часы клиностатирования (рис.3). Пролиферативная активность клиностатируемых ЭК практически не отличалась после 2 часов воздействия от контрольных ЭК: число клиностатируемых клеток увеличивалось на 6,3% по отношению к фону, а число контрольных клеток - на 9,81% по отношению к базальному уровню (рис 4). Через 4 часа клиностатирования прирост экспериментальной культуры составлял 11,14% по отношению к фону, а прирост контрольной — 16,01%, что также свидетельствовало о незначительных изменениях пролиферации клиностатируемых культур. 24 часа воздействия измененного гравитационного стимула показали более выраженный эффект клиностатирования на темпы пролиферации ЭК in vitro. Число клиностатируемых клеток увеличивалось на 44,82% по отношению к базальному уровню, а число контрольных клеток - на 58,29% (р 0,05). После 4 часов культивирования в стандартных условиях ЭК, клиностатируемых в течение 24 часов увеличение их количества достигало 50,87% по сравнению с фоном, а контрольных культур - 68,72% (р 0,05), что свидетельствовало о незначительном повышении скорости роста клеток, возвращенных в статические условия.
Снижение пролиферативной активности ЭК, выявленные в условиях горизонтального клиностатирования, позволили нам предположить возможность схожего эффекта в условиях вертикального клиностатирования, при изменении положения культур и изменении направления вращения клеток относительно земного вектора гравитации,. Сочетание двух видов клиностатирования может позволить более полно моделировать ключевые аспекты микрогравитации.
Анализ данных, полученных при вертикальном клиностатироваиии, показывает, что после 4 часов воздействия измененного направления вектора гравитации пролиферация клиностатируемых клеток незначительно уменьшалась по сравнению с контрольными культурами и составляла 2,95% прироста по отношению к фоновому значению, по сравнению с контрольными культурами, у которых пролиферация была равной 7,73% относительно базального уровня (рис.5). Клиностатирование в течение 8 часов выявило более выраженное снижение пролиферативной активности ЭК (5,71%) относительно темпов роста культур, находящихся в стандартных условиях (13,24%) (р 0,01). Через 24 часа воздействия пролиферация клиностатированных клеток была значительно меньше пролиферации контрольных культур (14,25% - клиностатируемые ЭК и 39,55% - контрольные ЭК) (р 0,01). Сниженные темпы пролиферации сохранялись и после 4 часов экспозиции в нормальных условиях культивирования, последовавших после 24 часов клиностатирования (17,06% - клиностат, 47,69% - контроль) (р 0,01).
Сопоставление результатов экспериментов по исследованию пролиферации ЭК при горизональном и вертикальном клиностатироваиии показало, что в случае горизонтального клиностатирования после 4 часов воздействия разница прироста между контрольными и клиностатируемыми культурами составляла 1,87%, через 24 часа — 3,47%, а после 4 часов культивирования в нормальных условиях ЭК, клиностатированных в течение 24 часов -17,85%. При вертикальном клиностатироваиии через 4 часа разница прироста между коїпрольньїми и клиностатируемыми ЭК составляла 4,78%, через 24 часа - 25,3%, а после 4 часов культивирования в нормальных условиях ЭК, клиностатированных в течение 24 часов - 30,63%. Полученные данные свидетельствуют о о снижении пролиферативной активности культур ЭК человека в условиях вертикального клиностатирования.
При длительном клиностатировании было обнаружено, что после 24 часов воздействия разница в проценте прироста между клиностатируемыми и контрольными ЭК составляла примерно 13,6%, что соответствовало выявленному ранее в экспериментах с кратковременным клиностатированием. Таким образом, прирост ЭК составлял 4,08% у опытных культур и 18,4% - у контрольных клеток (рис.6). При продолжении клиностатирования наблюдалось дальнейшее снижение темпов пролиферации ЭК, причем низкая пролиферативная активность клиностатируемых культур сохранялась во время всего периода клиностатирования и была в среднем в 1,7 раза ниже, чем пролиферация контрольных клеток (различия статистически достоверны). Эти результаты согласуются с показанным ранее снижением пролиферации ЭК человека при длительном клиностатировании [Романов, Буравкова, 2000]. Возвращение культур в стандартные условия после 144 часов клиностатирования приводило к восстановлению темпов пролиферации: прирост опытных культур достигал 368,91% по отношению к фону, а контрольных - 492,83%. Максимальная плотность эндотелиальных монослоев, сформированных в условиях клиностатирования составляет примерно 670±52 клеток на 1 мм , а максимальная плотность контрольных культур приблизительно равна 820±25 клеткам на 1 мм2.
Морфологический анализ культур позволил выявить еще одну интересную особенность формирования монослоя при клиностатировании. Клетки, растущие в условиях измененного направления вектора гравитации выглядели более распластанными и достигали состояния преконфлуэнтного монослоя (весь пластик покрыт клетками без промежутков между ними) раньше, чем контрольные. Вероятно, сниженная скорость роста ЭК в условиях клиностатирования несколько компенсируется увеличением степени распластанности клеток, что способствует более раннему формированию межклеточных контактов, необходимых для нормального функционирования эндотелия. Таким образом, данное исследование продемонстрировало и подтвердило значительное снижение пролиферативной активности эндотелиальных клеток человека в условиях длительного клиностатирования по сравнению с стандартными условиями культивирования.
Анализ пролиферативной активности мезенхимальных стволовых клеток человека при клиностатировании
На основании результатов экспериментов можно сделать вывод, что горизонтальное клиностатирование, как и вертикальное, приводит к изменению структуры актинового цитоскелета эндотелиальных клеток человека. Полученные данные свидетельствуют о том, что цитоскелет культивируемых ЭК является структурой, чувствительной к изменению направления вектора гравитации, и его реорганизация начинается уже в первые часы клиностатирования. Возможно, что именно эти процессы при изменении гравитационного окружения приводят к модификации формы клеток и их подвижности. Ремоделирование актинового цитоскелета в ответ на изменение гравитационного окружения носит обратимый характер и протекает быстрее, чем его восстановление. При сопоставлении литературных данных и результатов наших экспериментов можно заключить, что разные типы механочувствительных клеток, по-видимому, дают сходную ответную реакцию на изменение вектора гравитации, что может свидетельствовать об их гравичувствительности [Hughes-Fulford, 2001].
Исследования, выполненные позднее в «Rotating Wall Vessel» на эндотелиальных клетках пупочной вены человека, выращенных на бусинах Cytodex 3 показали дезорганизацию актиновых фибрилл и формирование ими кластеров в перинуклеарной области клеток после 4 часов воздействия. После 144 часов культивирования исследователи наблюдали исчезновение кластеров и уменьшение количества стресс-фибрилл [Carlsson et al, 2003]. Следует отметить, что изменения в организации актинового цитоскелета наблюдались и у клеток, культивируемых на бусинах без воздействия измененного направления вектора гравитации. Именно этим можно объяснить некоторое расхождение между данными Carlsson et al и результатами наших исследований.
Ряд исследователей предполагает, что проведение гравитационного стимула может осуществляться через комплекс фокальной адгезии [Ingber, 1999]. С явлением фокальной адгезии связано взаимодействие движущейся клетки с субстратом и ее распластывание на поверхности, которое также осуществляется с помощью актиновых филаментов. Обнаруженное ранее изменение скорости миграции и распластанности ЭК при клиностатировании [Романов, Буравкова, 2001] указывает на вовлеченность фокальных контактов в реструктуризацию клеток в этих условиях. Также известно, что актиновые филаменты ассоциируются с комплексом фокальной адгезии и фокальными контактами, участвуют в взаимодействии клетки с субстратом и вовлечены в траясдукцию и трансформацию механического сипіала в клетку, в том числе, и гравитационного стимула.
Учитывая все вышесказанное, можно предположить, что актиновые фибриллы, ассоциированные с комплексом фокальной адгезии, участвуют в трансдукции и трансформации гравитационного сипіала в клетку, и их реорганизация может являться частью ответа клетки на механическое воздействие. Обнаружено, что цитоскелетные белки, в том числе и актин, могут участвовать в контроле структуры и функции ядра благодаря ассоциации с ядерными компонентами и факторами транскрипции [Janmey, 1998; Olave et al, 2002]. Также известно, что mPHK-содержащие полисомы ассоциированы с актиновыми филаментами, и активность комплекса трансляции зависит от организации актинового цитоскелета [Jansen, 1999]. Следовательно, можно предположить, что реорганизация F-актина может привести к изменениям структуры ядра и экспрессии ряда белков в условиях микрогравитации [Hughes-Fulford, 2001].
Ремоделирование микрофиламентов, участвующих в локализации и функционировании ферментов ключевых процессов метаболизма, таких как гликолиз, липидный и энергетический обмен, вероятно, могут привести к перестройкам биохимических реакций, происходящих в клетке. Известны данные о изменении внутриклеточного распределения и уровня активности важного регуляторного компонента — протеинкиназы С в условиях моделируемой гипогравитации [Gallery et al, 2002], что в совокупности с реорганизацией актинового цитоскелета может служить доказательством значительных изменений в механизме внутриклеточной передачи сигнала и во взаимодействиях протеинкиназ с белками-мишенями.
Обнаруженное изменение клеточной подвижности ЭК in vitro в условиях измененного вектора гравитации на модели «wound-healing» [Романов, Буравкова, 2001], может быть прямо связано с модификацией цитоскелета. Выявленное снижение пролиферативной активности ЭК, вероятно, ассоциировано с ремоделироваЕшем архитектоники актинового цитоскелета и повышенной распластанностыо клиностатированных клеток. Обобщая все вышесказанное, можно сделать вывод о том, что в условиях измененной силы тяжести происходит сложный процесс реорганизации компонентов клетки, модификация ее архитектуры и изменение функциональной активности, что является важным составляющим звеном клеточной адаптации, приводящим, в конечном итоге, к приспособлению клетки к новым условиям существования.
Известно, что изменения внешних условий существования, в том числе механических факторов, могут вызывать повышение секреции связанных со стрессом цитокинов [Kawai et al, 2002]. Так, было показано, что в модифицированных условиях культивирования в геле с низким натяжением (на мягкой подложке) у фибробластов происходило уменьшение внутреннего напряжения клеток и дезорганизация цитоскелета, сопряженные с увеличением экспрессии ИЛ-6 и ИЛ-1 [Lambert et al, 2000], Кроме того, недавно сообщалось, что устойчивое растяжение в эндотелиальных клетках синусоиды после эмболизации главного входа вены индуцировало секрецию ИЛ-6 [Kawai et al, 2002].
Экспрессия ИЛ-6 является чувствительной к механическому [Kawai et al, 2002; Kobayashi et al. 2003], и в частности, гравитационному стимулу [Kumei et al, 1996; Lambert et al, 2000]. Вероятно, данный цитокин участвует в сигнальных путях механотранедукции в клетке [Kawai et al, 2002; Lambert et al, 2000]. Эти данные позволили предположить, что в условиях постоянно изменяющегося направления вектора гравитации продукция ИЛ-6 эндотелиальными клетками человека будет изменяться, подтверждая гипотезу о чувствительности ЭК не только к механическому напряжению и «сдвигу жидкости» (shear stress), но и к гравитационному стимулу.
