Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 23
Глава 1. Современные представления о механизмах врожденного иммунитета слизистых оболочек 23
1.1. Основные компоненты врожденного иммунитета 23
1.1.1. Распознающие рецепторы системы врожденного иммунитета 28
1.1.2. Эффекторные молекулы врожденного иммунитета (противомикробные пептиды) 40
1.2. Полиморфизм генов, белковые продукты которых участвуют в реакциях системы врожденного иммунитета 49
1.3. Характеристика и функции слизистых оболочек 60
1.3.1. Механизмы развития толерантности к комменсалам на уровне слизистых оболочек 61
1.3.2. Иммунные механизмы слизистых оболочек различной локализации 64
1.3.2.1. Слизистые оболочки бронхо-легочного и желудочно-кишечного трактов 64
1.3.2.2. Роль слизистых оболочек урогенитального тракта женщин в защите от патогенов 65
1.3.2.3. Факторы системы врожденного иммунитета в развитии инфекционной патологии на уровне слизистой оболочки в урогенитальном тракте мужчин 76
1.3.2.4. Особенности реакций системы врожденного иммунитета в тканях органа зрения человека
ЧАСТЬ II. Собственные исследования 89
Глава 2. Материалы и методы 89
2.1. Характеристика клинических групп 89
2.2. Материалы 95
2.3. Методы
2.3.1. Работа с культурами клеток 97
2.3.2. Оценка цитопатического действия вирусов герпеса in vitro и in vivo 98
2.3.3. Выделение нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) 99
2.3.4. Реакция обратной транскрипции 99
2.3.5. Полимеразная цепная реакция 100
2.3.6. Рестрикционный анализ 102
2.3.7. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов 102
2.3.8. Выделение мононуклеарных клеток и нейтрофилов из периферической крови 103
2.3.9. Стимуляция клеток различными лигандами 103
2.3.10. Иммуноферментный анализ (ИФА) 104
2.3.11. Статистические методы анализа 104
Результаты и обсуждение 106
Глава 3. Оценка экспрессии генов молекул врожденного иммунитета в экспериментальных моделях инфекционного процесса in vitro и in vivo с помощью разработанных систем ОТ-ПЦР в режиме реального времени 106
3.1. Разработка систем ОТ-ПЦР в режиме реального времени для
оценки экспрессии генов Toll-подобных рецепторов, цитокинов, противомикробных пептидов и других молекул, участвующих в реакциях врожденного иммунитета 106
3.2. Определение экспрессии генов TLRs, дефенсинов и цитокинов в ответ на патогены в экспериментальных моделях in vitro и in vivo 121
3.2.1. Исследование факторов системы врожденного иммунитета на модели культуры перевиваемых линий клеток 122
3.2.2. Исследование экспрессии генов TLRs и выработки цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови женщин с физиологически протекающей беременностью и беременных с урогенитальной инфекцией.. 128
3.2.3. Динамика экспрессии и выработки нейтрофильных пептидов (сс-дефенсинов) нейтрофилами периферической крови здоровых беременных и беременных с урогенитальной инфекцией 134
3.2.4. Изучение экспрессии генов TLR9 BD-2 в эпителиальных клетках на модели герпетической инфекции in vivo 138
Глава 4. Комплексный анализ изменений показателей системы врожденного иммунитета у женщин с физиологически протекающей беременностью и у беременных с урогенитальной инфекцией 150
4.1. Исследование экспрессии/продукции TLRs, дефенсинов и цитокинов у женщин с инфекционной патологией при беременности 150
4.1.1. Изменение компонентов врожденного иммунитета в клетках слизистой цервикального канала и в периферической крови женщин с физиологически протекающей беременностью 150
4.1.2. Изменение показателей врожденного иммунитета (TLRs, дефенсинов) у женщин с неразвивающейся беременностью... 158
4.1.3. Исследование экспрессии генов TLRs и HBD-1 клетками слизистой цервикального канала беременных с урогенитальной инфекцией 166
4.2. Оценка роли TLR-опосредованного апоптоза в ткани плаценты при патологии инфекционного генеза у беременных женщин 181
4.2.1. Исследование экспрессии генов TLR2 и TLR4 в клетках плаценты 182
4.2.2. Экспрессия генов каспазы-8, каспазы-3 и ингибиторов каспазБЫР, XIAP в ткани плаценты 185
4.2.3. Анализ корреляционных связей уровней экспрессии генов каспаз, их ингибиторов и TLRs в клетках плаценты в исследуемых группах 191
4.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров в генах Toll-подобных рецепторов и противомикробных пептидов с патологией инфекционного генеза у беременных женщин 197
4.3.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Arg677Trp и Arg753Gln в гене TLR2 201
4.3.2. Изучение ассоциации полиморфных маркеров Asp299Gly и Thr399Ile в гене TLR4 206
4.3.3. Исследование ассоциации полиморфного маркера 2848G/A в гене TLR9 209
4.3.4. Изучение ассоциации полиморфных маркеров G(-20)A, C(-44)G, и G(-52)A гена DEFB1 211
4.3.5. Исследование ассоциации полиморфных маркеров в гене DEFB1 с уровнем экспрессии гена Р-дефенсина-1 220
Глава 5. Изучение роли TLRs, противомикробных пептидов и цитокинов на уровне слизистой уретры в патогенезе хронического простатита 226
5.1. Исследование изменения TLRs и противомикробных пептидов в клетках слизистой уретры при хроническом простатите 227
5.2. Изменение цитокинового профиля в семенной плазме и сыворотке периферической крови больных хроническим простатитом 231
Глава 6. Изучение роли компонентов врояоденного иммунитета (TLR9 и HBD-2) в слизистых оболочках глаза . 234
6.1. Изучение экспрессии генов TLR9 и HBD-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы и роговицы здоровых детей 234
6.2. Изменение уровня экспрессии генов TLR9 и HBD-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы и роговицы детей с герпетическим древовидным кератитом 236
6.3. Экспрессия генов TLR-9 и HBD2 в эпителиальных клетках конъюнктивы у детей, после проведенной противовирусной терапии 238
Глава 7. Заключение 241
Выводы 260
Список литературы
- Характеристика и функции слизистых оболочек
- Оценка цитопатического действия вирусов герпеса in vitro и in vivo
- Определение экспрессии генов TLRs, дефенсинов и цитокинов в ответ на патогены в экспериментальных моделях in vitro и in vivo
- Экспрессия генов каспазы-8, каспазы-3 и ингибиторов каспазБЫР, XIAP в ткани плаценты
Введение к работе
Актуальность исследования. Всемирная организация здравоохранения ставит инфекционные заболевания на одно из ведущих мест среди главных причин смертности (после ишемической болезни сердца, инсульта и др.) [ВОЗ, 2009]. По данным ВОЗ, ежегодно в мире умирает около 51 млн. человек, треть из них - от инфекционных болезней. Инфекционные заболевания остаются актуальной проблемой не только для развивающихся, но и для благополучных стран. В Российской Федерации ежегодно регистрируют около 35 млн. случаев инфекционных болезней [Онищенко Г.Г., 2006; Пальцев М.А., 2007].
В последние годы, благодаря прогрессу таких научных дисциплин как молекулярная биология, генетика, иммунология и клеточная биология, происходит накопление знаний о механизмах развития различных инфекционных заболеваний, а также становится возможным их точная диагностика и прогнозирование. Известно, что состояние резистентности к инфекции формируется с помощью многочисленных реакций иммунной системы, основная функция которой заключается в распознавании и элиминации инфекционных агентов, а также продуктов их жизнедеятельности [Ярилин А.А., 1999; Хаитов P.M., 2010; Ковальчук Л.В.,2010].
В последнее время все большее подтверждение получает гипотеза К. Janeway об исключительной важности системы врожденного иммунитета в защите от патогенов и в реализации начальных стадий реакций адаптивного иммунитета [Кокряков В.Н., 2006; Janeway, 2007; Лебедев К.А., 2008]. Клетки системы врожденного иммунитета распознают консервативные в эволюционном отношении молекулы, присущие одновременно большим систематическим группам микроорганизмов. Среди распознающих рецепторов системы врожденного иммунитета ключевая роль принадлежит Toll-подобным рецепторам (TLR). После взаимодействия TLR с лигандом происходит активация сигнальных путей, в результате которой продуцируются эффекторные молекулы, такие, как цитокины, противомикробные пептиды и др. При скоординированном функционировании факторов врожденного иммунитета в большинстве случаев происходит элиминация патогена. Однако гиперактивация или угнетение механизмов врожденного
2 иммунитета в свою очередь может приводить к развитию патологического процесса [Корр Е., 2003; Назаров П.Г., 2005; Макаров О.В., 2007; Семенов Б.Ф., 2009].
Исследования по оценке патологических состояний с точки зрения функционирования молекулярных механизмов системы врожденного иммунитета фактически начались совсем недавно [Семенов Б.Ф., Зверев В.В., 2007; Ковальчук Л.В., 2007].
Общепризнано, что развитие большинства инфекций, с которыми встречается организм, начинается с проникновения патогенов через барьерные ткани, в том числе через слизистые оболочки. Известно, что слизистые, являясь физиологическим барьером, участвуют в развитии защитных реакций врожденного иммунитета в ответ на патогены, в инициации реакций адаптивного иммунитета, в формировании толерантности к комменсалам, а также в развитии патологических процессов (аллергии, острого и хронического воспаления и др.). Таким образом, в настоящее время клетки (в том числе эпителиальные) слизистых оболочек рассматриваются в качестве одного из факторов врожденного иммунитета [Хаитов P.M., 2005; Лебедев К.А., 2008; Artis D., 2008; Coombes J.L., 2008; Семенов Б.Ф., 2009; ЯрилинА.А., 2010].
Комплексное исследование вышеперечисленных процессов при патологии инфекционного генеза (урогенитальной инфекции, внутриутробной инфекции, вирусном кератите и др.) позволит приблизиться к пониманию роли механизмов врожденного иммунитета и определить тонкую грань между процессами функционирования системы врожденного иммунитета, обеспечивающими защиту организма, и процессами, приводящими в конечном итоге к развитию патологии. Выяснение роли Toll-подобных рецепторов, цитокинов и противомикробных пептидов, экспрессированных в слизистых при инфекционных заболеваниях позволит более точно провести своевременную диагностику, заблаговременно спрогнозировать характер течения заболевания, изучить патогенетические аспекты развития патологии, а также обосновать выбор адекватной терапии.
Оценка системы врожденного иммунитета слизистых оболочек с использованием современных методов молекулярной биологии и генетики даст возможность выявить маркеры внутриутробного инфицирования плода,
з преждевременных родов и других патологических состояний. В дальнейшим накопленный фундаментальный базис позволит научно обосновать и разработать новые подходы к выбору адекватной терапии инфекционных заболеваний с учетом индивидуальных особенностей иммунной системы.
Цель работы - комплексное исследование на генетическом, экспрессионном и функциональном уровнях компонентов системы врожденного иммунитета (Toll-подобных рецепторов, противомикробных пептидов, цитокинов) в слизистых оболочках организма при патологии инфекционного генеза, а также разработка на основе полученных данных прогностических и диагностических критериев течения инфекционного процесса.
Задачи исследования:
1. Разработать системы ПЦР в режиме реального времени для количественной
оценки экспрессии генов Toll-подобных рецепторов (TLR1, TLR2, TLR4, TLR6,
TLR9), противомикробных пептидов (HNP-1, HBD-1, HBD-2), цитокина (ФНОсс) и
других молекул (NF-kB, каспазы 3, каспазы 8, ингибиторов каспаз FLIP и XIAP).
С помощью разработанных тест-систем на экспериментальных моделях инфекционного процесса in vitro и in vivo определить уровни экспрессии генов молекул врожденного иммунитета (TLRs, противомикробных пептидов, цитокинов).
Изучить изменение уровней экспрессии генов TLRs, дефенсинов и продукции цитокинов при урогенитальной инфекции (УГИ), внутриутробной инфекции (ВУИ) и преждевременных родах и определить их роль как возможных маркеров невынашивания беременности и реализации ВУИ.
4. Оценить значимость активации апоптоза в клетках плаценты, как одного из
механизмов развития преждевременных родов у беременных женщин с
урогенитальной инфекцией.
Изучить ассоциацию полиморфных маркеров, локализованных в генах TLR2, TLR4, TLR9 и HBD-1, с риском развития преждевременных родов, внутриутробного инфицирования плода.
Определить диагностическую значимость выявленных изменений уровней экспрессии генов TLRs, противомикробного пептида HBD-1 в клетках слизистой
4 оболочки урогенитального тракта и продукции цитокинов у больных хроническим простатитом.
7. Изучить роль сигнального рецептора TLR9 и противомикробного пептида
р-дефенсина 2 в эпителиальных клетках роговицы в развитии герпетического
кератита.
8. Обосновать комплексный подход к оценке TLR-опосредованных
механизмов врожденного иммунитета на уровне слизистых оболочек, основанный
на 1) изучении полиморфизма генов TLR и противомикробных пептидов, 2)
определении уровня их экспрессии и 3) функциональной активности для выявления
маркеров течения инфекционного процесса.
Научная новизна
Впервые представлен комплексный подход к оценке функционирования системы Toll-подобных рецепторов, основанный на изучении: экспрессии генов TLRs, транскрипционных факторов, эффекторных молекул (цитокинов, противомикробных пептидов и др.).
Впервые показано, что гиперэкспрессия TLR2 в эпителиальных клетках цервикального канала беременных женщин с урогенитальной инфекцией, сопровождающаяся повышенной продукцией ИЛ-8, ИФНу и сниженной экспрессией HBD-1, приводит к реализации внутриутробного инфицирования плода и к преждевременным родам. Выявлены новые маркеры ранней диагностики неразвивающейся беременности, преждевременных родов, внутриутробного инфицирования плода при урогенитальной инфекции, основанные на оценке уровня экспрессии генов TLR2, HBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала и HNP-1-3 в сыворотке периферической крови.
Впервые в клетках плаценты при преждевременных родах выявлен дисбаланс в экспрессии генов каспазы 3, каспазы 8 и ингибиторов апоптоза FLIP и XIAP, который заключается в повышении уровня экспрессии генов каспаз, коррелирующих с увеличенной экспрессией генов TLRs и со сниженной экспрессией генов ингибиторов каспаз.
Впервые исследована ассоциация полиморфных маркеров Arg677Trp и Arg753Gln в гене TLR2, Asp299Gly и Thr399Ile в гене TLR4, 2848G/A в гене TLR9, G(-20)А, C(-44)G, и G(-52)A в гене DEFB1 с урогенитальной инфекцией у беременных, преждевременными родами, реализацией внутриутробного инфицирования плода. Показана ассоциация аллеля А(-20) и генотипа GG (-52) гена DEFB1 с увеличением уровня экспрессии В-дефенсина 1 в эпителиальных клетках цервикального канала при выше указанной патологии.
Впервые определены прогностические критерии иммунодефицитного состояния при хроническом простатите на основе данных о снижении уровня экспрессии TLR2 в эпителиальных клетках уретры и дисбалансе про- и противовоспалительных цитокинов в секрете простаты.
- Впервые изучены показатели системы врожденного иммунитета в
конъюнктиве и роговице глаза у детей - уровень экспрессии распознающего
рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2, обеспечивающего
противовирусную и антибактериальную защиту тканей глаза. Установлено, что
комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов приводит к
нормализации экспрессии гена TLR9 в эпителиальных клетках роговицы глаза детей
с древовидным герпетическим кератитом и оказывает положительный
терапевтический эффект.
Получены новые данные по межлинейным различиям в развитии вирусного кератита и экспрессии гена TLR9 в роговице мышей линий C57BL/6 и BALB/c.
На клетках Vero изучена экспрессия генов TLR1, TLR2, TLR4, TLR9 и др. и определена функциональная активность клеток по выработке цитокинов в ответ на воздействие различных патогенов (вируса простого герпеса (ВПГ), C.albicans и др.).
Практическая значимость
Разработаны и внедрены в клиническую практику системы на основе ПЦР-РВ для определения экспрессии генов TLRs, цитокинов и противомикробных пептидов в качестве прогностических и диагностических критериев у женщин с преждевременными родами, реализацией внутриутробного инфицирования плода, а также у пациентов с хроническим простатитом и герпетическим кератитом.
С использованием разработанных систем определены маркеры риска развития преждевременных родов, внутриутробного инфицирования плода. Комплекс маркеров на основе исследования экспрессии генов TLRs, дефенсинов, продукции противомикробных пептидов и цитокинов в цервикальном канале женщин, позволяет с большей долей вероятности прогнозировать преждевременные роды и развитие внутриутробного инфицирования плода. При гиперэкспрессии TLR2 более, чем в 5 раз и снижении экспрессии FffiD-1 (в 2,5 раза и более) в 70% случаев наблюдаются преждевременные роды.
Определена панель полиморфных маркеров генов-кандидатов (TLR2, TLR9 DEFB-1) реализации внутриутробного инфицирования плода, преждевременных родов, что позволяет оценить риск развития патологического процесса во время беременности.
Разработаны экспериментальные системы оценки экспрессии генов и эффекторных молекул в культурах клеток {уего, HeLa), что позволяет исследовать действие препаратов на компоненты врожденного иммунитета.
Внедрен новый метод лабораторной диагностики определения уровня экспрессии гена сигнального рецептора TLR9 в эпителиальных клетках роговицы и конъюнктивы при герпетическом древовидном кератите у детей. Обосновано применение препарата Суперлимф в комплексной терапии герпетических кератитов у детей, позволяющей снизить уровень осложнений и добиться нормализации экспрессии TLR9.
Основные положения, выносимые на защиту
Разработаны системы для определения экспрессии генов молекул врожденного иммунитета Toll-подобных рецепторов (TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR9), противомикробных пептидов (HNP-1, HBD-1, HBD-2), цитокина (ФНОсс) и других молекул (NF-kB, каспазы 3, каспазы 8, ингибиторов каспаз FLIP и XIAP) и апробированы в моделях инфекционного процесса in vitro и in vivo.
С использованием разработанных систем определены новые маркеры ранней диагностики неразвивающейся беременности, преждевременных родов при
7 урогенитальной инфекции, внутриутробного инфицирования плода, основанные на оценке уровня экспрессии генов TLR2, HBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала и на ассоциации полиморфных маркеров генов, белковые продукты которых участвуют в реакциях врожденного иммунитета. Разработана концепция развития преждевременных родов, заключающаяся в гиперактивации ТЫ12-опосредованного апоптоза клеток плаценты. При преждевременных родах в клетках плаценты наблюдается дисбаланс в экспрессии генов каспазы 3, каспазы 8 и ингибиторов апоптоза FLIP и XIAP.
Развитие хронического простатита сопровождается снижением уровня экспрессии TLR2 в эпителиальных клетках уретры и дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов в секрете простаты.
При изучении уровня экспрессии распознающего рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2 в клетках конъюнктивы и роговицы глаза у детей, установлено, что комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) приводит к нормализации экспрессии гена TLR9 в эпителиальных клетках роговицы глаза детей с древовидным герпетическим кератитом, а также снижает частоту осложнений при указанной патологии.
5. Разработан комплексный подход к оценке TLR-опосредованных механизмов
врожденного иммунитета, основанный на изучении экспрессии генов TLR (при
действии различных лигандов); сигнальных молекул и транскрипционных факторов;
эффекторных молекул (цитокинов, противомикробных пептидов и др.). Анализ
компонентов TLR-системы проведен на уровне полиморфизма генов, экспрессии
мРНК, секреции эффекторных молекул.
Внедрение результатов работы
Результаты исследований, представленных в диссертационной работе, внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов, а также курс лекций по повышению квалификации врачей в Российской медицинской академии последипломного образования, Смоленской Государственной Медицинской Академии и Медицинском институте Орловского государственного университета.
8 Применение исследования экспрессии генов TLRs представлено в Патенте на изобретение №2334233: «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции». Официальный Бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам РФ №17 «Изобретения. Полезные модели» 20.09.2008 г.
Получено положительное решение о выдачи патента на изобретение (Заявка №2009108294/15(011092), дата подачи заявки 10.03.2009 г.).
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы доложены на заседании Бюро Отделения профилактической медицины РАМН (2009), Всероссийском научном Форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2004, 2006, 2007, 2009), Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005), Международной путинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2005, 2007, 2010), Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010), Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), Международной конференции «Генетика в России и в мире» (Москва, 2006), V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (Оренбург, 2006), Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), 6-th Parnas Conference Molecular Mechanisms of Cellular Signalling (Poland, Krakow, 2007), Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию Н.И.Вавилова (Киев, 2007), 8-th John Humphrey advanced summer school in immunology: Immunology and Viral Infection (Москва, 2007), VI конференции иммунологов Урала (Ижевск, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), XXVII Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Barcelona, Spain 2008), 6-th European Congress of Reproductive Immunology (Москва, 2008), IV Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-
9 Петербург, 2008), X Международном Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо (Казань, 2009), Съезде офтальмологов России (Москва, 2009), GA2LEN/EAACI Summer Allergy School (Great Britain, Norwich, 2009), 29-th Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Great Britain, London, 2010).
Апробация диссертации состоялась <=У мая 2010 года на заседании Ученого совета НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано в 68 печатных работы, в том числе 19 в изданиях, рекомендованных ВАК, материалы включены в монографию «Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет» // М. :«ГЭОТАР-Медиа». - 2007 и методическое пособие «Иммунология. Практикум.» // М. :«ГЭОТАР-Медиа». - 2010.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, главы «Обзор литературы», главы «Материалы и методы», 4-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 392 источника, из которых 105 отечественных и 287 зарубежных. Работа выполнена на 300 страницах машинописного текста, иллюстрирована 50 рисунками и 51 таблицей.
Характеристика и функции слизистых оболочек
Одним из важных обобщений иммунологии последних лет стало открытие молекулярных механизмов функционирования системы врожденного иммунитета, ее роли в развитии ответа на патогены. Механизмы врожденного иммунитета представляют первую филогенетически более древнюю линию защиты организма от различных патогенов, включая- вирусы, бактерии, грибы. Врожденный иммунитет обеспечивает быструю элиминацию патогенов и предотвращение инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще отсутствуют. Система врожденного иммунитета эволюционно сформировалась до приобретения способности к перегруппировке генов иммуноглобулинов и Т-клеточного рецептора, к узнаванию "своего", полноценной иммунной памяти. Реакции врожденного иммунитета играют большую роль на слизистых оболочках организма [55, 97, 153].
Клеточные компоненты врожденного иммунитета представлены моноцитами (Мо), макрофагами (МФ), дендритными клетками (ДК), нейтрофилами (НФ), тучными клетками, эозинофилами, базофилами, NK-клетками, NKT-клетками и др. Гуморальные факторы врожденного иммунитета включают естественные антитела, цитокины, белки системы комплемента, белки острой фазы, катионные противомикробные пептиды, лизоцим и др. Действие клеток врожденного иммунитета проявляется в реакциях фагоцитоза, цитолиза, в том числе бактериолиза и многих других. Так, к примеру, макрофаги совместно с нейтрофилами выполняют фагоцитарную функцию, а белки плазмы (белки системы комплемента, С-реактивный белок и другие), реагируют с углеводами бактерий. Факторы врожденного иммунитета, участвующие преимущественно в узнавании чужеродных белков и углеводов инфекционной природы, активируются сразу после воздействия инфекционного агента. Отличительной чертой клеток системы врожденного иммунитета является то, что они в отличие от клеток адаптивного иммунитета не образуют клонов и не проходят этапы позитивной и негативной селекции [60,77, 79].
Факторы врожденного иммунитета не изменяются в процессе жизни организма, контролируются генами зародышевой линии и передаются по наследству [234]. Подробная характеристика распознающих структур системы врожденного иммунитета будет представлена в следующих разделах.
Компоненты врожденного и приобретенного (адаптивного) иммунитета связаны по многим параметрам. В частности, дендритные клетки и макрофаги презентируют антиген Т- и В-лимфоцитам. Известно также, что компоненты комплемента крайне важны для развития и функционирования В-лимфоцитов. Цитокины, вырабатываемые Т-клетками, макрофагами, тучными клетками, оказывают взаиморегулирующее действие и т.д. [55]. Таким образом, физиологическое значение иммунной системы состоит в обеспечении иммунологической индивидуальности организма в течение его жизни за счет иммунного распознавания с участием компонентов врожденного и адаптивного иммунитета. Иммунная система тесно взаимодействует с другими системами организма, оказывая регуляторное влияние на многие жизненно важные функции организма [33, 214, 215].
На примере вирусной инфекции рассмотрим общие принципы развития механизмов врожденного иммунитета. Различные микроорганизмы, инфицирующие организм, встречаются с механическими факторами защиты, которые служат постоянным барьером на пути проникновения патогена, включая слизистую оболочку и нормальную бактериальную микрофлору. Секретируемые вещества - комплемент, противомикробные пептиды и природные IgM препятствуют взаимодействию микроорганизма с эпителиальными клетками [161, 230]. Комплемент оказывает нейтрализующее влияние на патоген. Свою активность система комплемента проявляет в виде каскада реакций, расщепляющих белки. Такие продукты расщепления, как СЗа и С5а, служат хемотаксинами для клеток воспаления и активаторами для макрофагов. Активация системы комплемента возможна по классическому или альтернативному пути. Однако многие микроорганизмы в процессе эволюции выработали многочисленные механизмы уклонения от иммунологического надзора. Так, был установлен один из вероятных механизмов инактивации вирусом простого герпеса (ВПГ) белков системы комплемента. Как выяснилось, он заключается в способности гликопротеина С оболочки ВПГ 1 типа (gC) связываться с СЗ компонентом и, тем самым, эффективно защищать вирусные частицы от нейтрализующего влияния комплемента [170, 264]. Естественные IgM антитела являются очень важным компонентом иммунитета. Секреция IgM в урогенитальном тракте осуществляется CD5+ В1-лимфоцитами. IgM весьма эффективно активируют систему комплемента, опсонизируют микроорганизмы или инфицированные клетки, таким образом, способствуя их фагоцитозу [156].
Взаимодействие микроорганизмов с паттерн-распознающими рецепторами макрофагов и эпителиальных клеток приводит к синтезу цитокинов. При вирусной инфекции особое значение имеет продукция интерферонов 1 типа (ИФНа и ИФНР) [28, 20, 59]. Эти цитокины начинают активно продуцироваться практически всеми инфицированными клетками уже в первые часы после заражения и приводят еще неинфицированные клетки в состояние повышенной готовности к запуску механизмов противовирусной защиты. ИФНа и ИФНР взаимодействуют с общим рецептором на клеточной поверхности, что вызывает возникновение в клетке соответствующего сигнала. Контакт рецептора с ИФН запускает каскад событий, сопровождающихся активацией киназ Jakl и Тук-2, которые фосфорилируют STAT1 и STAT2 молекулы, что в итоге приводит к усилению транскрипции около 100 интерферон-стимулированных генов. Поэтому интерфероны угнетают репродукцию многих вирусов [105, 145, 267]. Помимо ИФН I типа активация TLRs приводит к транскрипции генов провоспалительных цитокинов, хемокинов, которые активируют клетки системы врожденного иммунитета (Рис. 1.).
Механизмы врожденного иммунитета представляют первую линию защиты от проникновения патогенов. Вначале вирус подвергается атаке таких белков врожденного иммунитета, как комплемент, противомикробные пептиды, природные IgM. На эпителиальных клетках слизистых и клетках врожденного иммунитета (макрофагах, дендритных клетках, нейтрофилах и др.)экспрессируются различные паттерн-распознающие рецепторы (TLR 1-9).Эти рецепторы распознают общие молекулярные последовательности-паттерны.
Так TLR2 распознает гликопротеины оболочки і вируса герпеса простого, TLR9 распознает неметиллировааные CpG - богатые мотивы вирусной ДНК [268]. В результате взаимодействия с рецепторами происходит активация сигнальных путей через ядерный фактор транскрипции NF-kB и увеличивается экспрессия генов провоспалительных цитокинов и интерферонов 1 типа. Плазмацитоидные дендритные клетки являются главными продуцентами интерферонов 1 типа, активирующих NK и NKT лимфоциты. Активация NK-клеток наблюдается в течение 2-х суток вирусной инфекции. Развивается локальная воспалительная реакция. Миелоидные дендритные клетки, пришедшие в очаг инфицирования, фагоцитируют разрушенные вирус-инфицированные клетки, и вирусные пептиды встраиваются в молекулы HLA-классов 1 и II .затем эти клетки созревают и мигрируют в региональный лимфатический узел, где происходит презентация вирусных пептидов специфическим клонам ТЪ0 и CD8+Т-лимфоцитов [33, 274].
Оценка цитопатического действия вирусов герпеса in vitro и in vivo
Система врожденного иммунитета при инфекционной патологии беременности. В патогенезе различных гестационных осложнений большую роль играют инфекционные факторы, но молекулярные механизмы влияния инфекции на течение беременности точно не установлены.
Одной из важнейших проблем практического акушерства является проблема невынашивания беременности. Частота невынашивания составляет от 10 до 25% от общего числа беременностей и, несмотря на использование разнообразных современных методов диагностики и лечения, этот показатель продолжает оставаться стабильным. Самопроизвольными абортами заканчивается 10-15% беременностей [80]. В настоящее время среди причин невынашивания беременности в 40% являются инфекции, передаваемые половым путем, и связанные с ними, нарушения иммунитета [249]. Преждевременные роды в сроки до 30 недель беременности в 80% случаев связаны с инфекционной патологией [182]. Бактериальный вагиноз выявлен у 33,3% женщин с неразвившейся беременностью и у 56,9% женщин с диагнозом «невынашивание» инфекционного генеза, включая хориоамнионит, эндометрит и инфицирование плода [64, 80, 252].
Внутриутробное инфицирование плода (ВУИ) представляет собой проникновение микроорганизмов в ткани плода и его заражение. Наиболее типично ВУИ у новорожденных проявляется в виде пневмонии, гепатита, конъюнктивита, отита, ринита, сепсиса и др. [81]. Согласно исследованиям Шабалова Н.П. [100], около 2% детей инфицируются внутриутробно и почти 10% - во время родов. Так, по данным ряда авторов [6, 17], ВУИ развивается у 27,4-36,6% детей, рожденных живыми, а в структуре смертности новорожденных инфекционная патология занимает ведущее положение, обуславливая 10-45% потерь. В развитых странах 10-25% мертворождений обусловлены заболеваний, передающихся половым путем, большое внимание уделяется инфекционными патогенами [183].
Условием для возникновения внутриутробной инфекции является наличие у беременных острого или хронического инфекционного процесса, при этом наибольшее значение имеют острые инфекционные заболевания (ветряная оспа, герпетическая инфекция, краснуха и др.) и хронические инфекции. Возбудителями ВУИ являются бактерии, вирусы, грибы, простейшие. При генитальных инфекциях значительная роль отводится ассоциациям аэробно-анаэробной флоры. В связи с ростом частоты хламидийной, микоплазменной, уреаплазменной инфекции, а также стрептококковой, цитомегаловирусной и герпетической инфекции [37]. На протяжении последних десятилетий " изменилась структура инфекционной заболеваемости, возросла роль условно-патогенной микрофлоры в инфицировании плода и новорожденных. Среди них важная роль принадлежит грамотрицательным бактериям и облигатно анаэробным бактериям, что обусловлено широким применением антибиотиков, подавляющих аэробную микрофлору.
Выделена группа вирусных, бактериальных и других инфекций, которые при значительном разнообразии структурных и биологических свойств возбудителей вызывают у детей сходные клинические проявления, а впоследствии и стойкие структурные дефекты, многих органов и систем, особенно ЦНС. Для обозначения инфекций этой группы была предложена аббревиатура TORCH-комплекс {Toxoplasmosis, Others, Rubeola, Cytomegalia, Herpes). Специфичность поражения плода зависит от пути проникновения инфекции: восходящий путь, трансплацентарный путь, нисходящий путь, интранатальный путь и смешанный путь [9, 42, 56, 88].
Роль факторов системы врожденного иммунитета при инфекционной патологии у беременных женщин изучена недостаточно. Группа исследователей из Чикагского университета установила увеличение экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 и секреции ФНОа при бактериальных вагинозах, так секреция ФНОа возрастала при воздействии Mycoplasma hominis и Gardnerella vaginalis [313, 390].
ПМП были исследованы при некоторых осложнениях беременности, включая выкидыши в отсутствии и присутствии- хориамнита, ВУИ, преждевременный разрыв плодных оболочек и гестоз. Концентрации HNPs и в амниотической жидкости, и в материнской сыворотке были предложены в качестве биомаркеров внутриутробного инфицирования, высокий уровень HNP в сыворотке матери - маркер наличия хориамнита. Увеличенные концентрации HNPs, вероятно, связаны с активацией нейтрофилов, внутриутробным воспалением и инфекцией. Увеличенные концентрации HBD-2 в амниотической жидкости пациенток с внутриутробным инфицированием и с выкидышем отмечены в исследованиях [166]. Уровень дефенсина может быть увеличен за счет воспалительных процессов и вследствие инфекции, приводящей к усилению антибактериальной защиты [12].
ЛПС бактерий приводит к росту синтеза ИЛ-ір, что в свою очередь приводит к увеличению секреции ФНОа, ИЛ-б и ИЛ-8, усилению пролиферации и миграции лейкоцитов, изменению белков внеклеточного матрикса, к митогенному и цитотоксическому эффектам, возникновению лихорадки [158, 163]. Действие ИЛ-1 заключается в увеличении синтеза простагландинов в тканях, в частности, в миометрии, децидуальной ткани и амнионе [139]. Повышение активности протеаз может привести к изменению структуры плодных оболочек и к преждевременному разрыву. По данным Сидельниковой В.М., уровни провоспалительных цитокинов в третьем триместре у беременных с привычным невынашиванием могут быть маркерами риска преждевременных родов [80, 98,266].
В исследованиях Кан с соавторами показано, что развитие ВУИ сопровождалось более высоким содержанием провоспалительных цитокинов ИЛ-1(3 (во всех исследуемых биологических средах) и ФНОа (в сыворотке периферической крови и в амниотической жидкости) относительно этих показателей в группе сравнения [24].
Таким образом, исследование экспрессии и функции TLRs, противомикробных пептидов и цитокинов при инфекционной патологии беременности является новым актуальным разделом репродуктивной иммунологии.
Определение экспрессии генов TLRs, дефенсинов и цитокинов в ответ на патогены в экспериментальных моделях in vitro и in vivo
Группу сравнения составили 25 беременных с урогенитальной инфекцией, беременность которых закончилась своевременными родами. Контрольную группу составили 94 беременных с физиологически протекающей беременностью после своевременных родов с рождением здорового жизнеспособного ребенка. У всех женщин контрольной группы бьша исключена урогенитальная инфекция.
Среди обследованных беременных контрольной группы большинство женщин (70,5 %) были в возрасте до 30 лет, тогда как 29,5 % составили группу 30 лет и старше. Возраст всех пациенток находился в интервале от 19 до 42 лет. Большую часть пациенток основной группы составили беременные в возрасте 25-34 лет (60% и 73% соответственно), однако в основной группе возраст пациенток свыше 35 отмечен статистически достоверно чаще, чем в контрольной группе (16,9% и 6,7% соответственно, р 0;05), и не имел достоверных отличий с группой сравнения.
Все пациентки с патологией беременности прошли обследование по стандартной схеме, включавшей- подробный сбор анамнестических данных, объективный осмотр; специальное акушерское исследование, ультразвуковое исследование (при помощи аппарата АІока 4000 (Япония) с использованием трансабдоминальных и эндовагинальных датчиков), определение гормонов щитовидной железы (метод ИФА, наборы фирмы DRG, США), бактериологическое исследование из цервикального канала и влагалища, исследование клеток цервикального канала на наличие ВПГ-2, ЦМВ, Chlamidia trachomatis, Ureaplasma urealiticum, Micoplasma hominis (в лаборатории клинической генетики фирмы «ЛИТЕХ» НИИ физико-химической медицины МЗ РФ), определение концентрации иммуноглобулинов класса G, М к вирусу простого герпеса 2 типа и цитомегаловирусу. Группы пациентов с хроническим простатитом.
Клинические исследования проводились в 2006 - 2008гг. на базе кафедры урологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (зав. кафедрой, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Е. Б. Мазо аспирант Д.Н. Суренков). Определение уровня экспрессии генов в клетках слизистой уретры проводилось на 15 больных ХБП, 15 больных ХАП/СХТБ воспалительного характера с наличием внутриклеточной инфекции (средний возраст составлял 25±4 года) и 10 здоровых добровольцев (средний возраст - 20±2,1 года). Всего у больных ХБП было выделено и идентифицировано 19 штаммов бактерий: 68,4% грамположительных и 31,6% грамотрицательных. В качестве возбудителей ХАП/СХТБ воспалительного характера выявлены Clamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealiticum. При этом у 40% больных выявлена смешанная инфекция.
Исследование уровня цитокинов в сыворотке проводилось на 20 здоровых добровольцев (средний возраст - 21,7±2 года), 40 больных ХБП и 40 больных ХАП/СХТБ воспалительного характера с наличием внутриклеточной инфекции (средний возраст - 36,3±5,5 лет). У больных ХАП/СХТБ воспалительного характера, по данным исследования соскобов из уретры на внутриклеточные микроорганизмы методом ПЦР, инфекционные агенты в виде единственного возбудителя были выявлены у 6 (40%), смешанная инфекция у 9 (60%) больных. Выявлены: Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealiticum. Всего от 40 больных ХБП было выделено и идентифицировано 43 штамма бактерий: 62,8% грамположительных и 37,2% грамотрицательных бактерий.
У больных ХАП/СХТБ воспалительного характера, по данным исследования соскобов из уретры на внутриклеточные микроорганизмы, инфекционные агенты в виде единственного возбудителя выявлены у 25 (62,5%), смешанная инфекция у 15 (37,5%) больных. При этом выявлены: Ureaplasma urealiticum, Mycoplasma genitalium n Chlamydia trachomatis.
Группы пациентов с вирусным кератитом. Клинические исследования в группах пациентов с вирусным древовидным кератитом проводились в 2008 - 2010гг. на базе кафедры офтальмологии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава в Морозовской детской городской клинической больнице г. Москвы (зав. кафедрой, член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор Е.И. Сидоренко, д.м.н., профессор М.Р. Гусева, аспирант Н.С. Джамбинова).
Молекулярно-биологические исследования проводились на клиническом материале, полученном от 37 детей в возрасте от 2 до 14 лет. Дети были разделены на две группы: здоровые дети (23 человека), дети с диагнозом герпетический древовидный кератит (14 человек).
Всем пациентам проводили стандартное обследование, которое включало визометрию (определение остроты зрения), авторефрактометрию (определение рефракции), биомикроскопию (определение состояния конъюнктивы и роговицы), офтальмоскопию (исследование глазного дна). Клинический диагноз подтверждали исследованиями анализа крови: определение антител (IgM, IgG) к вирусу простого герпеса методом ИФА в вирусологической лаборатории Морозовской детской городской клинической больнице. У детей в группе от 2 до 5 лет определялись как антитела IgG - 85,2%), так и антитела IgM - 75,9%. В возрастной группе 6-14 лет в подавляющем большинстве определялись антитела IgG - в 95,6% случаев.
Всем пациентам в соответствии с выраженностью патологического процесса проводили стандартное лечение, которое включало противовирусную (интерферон, офтальмоферон, зовиракс), антибактериальную (левомицетин, тетрациклиновая мазь), противовоспалительную (наклоф; диклоф), сосудоукрепляющую (аскорутин, диционин), десенсебилизирующую (супрастин, тавегил), эпителизирующую терапию (солкосерил, корнерегель). Дополнительно в основной группе проводили инстилляции препаратом Суперлимф (по 1 капле через каждые 5 минут в течение 1 часа 1 раз в день).
Взятие клинического материала проходило в 2 этапа: в момент поступления ребенка в стационар и через неделю после лечения (стандартного или комплексного с препаратом Суперлимф).
Экспрессия генов каспазы-8, каспазы-3 и ингибиторов каспазБЫР, XIAP в ткани плаценты
Плацента является высоко специализированным барьером, защищающим плод от инфекции. Клетки трофобласта могут взаимодействовать с микроорганизмами в зоне имплантации и способны, инициировать иммунный ответ. Т.о. трофобласт функционирует как активный компонент системы врожденного иммунитета.
В последние годы появляются работы о роли TLR-опосредованного апоптоза в ткани плаценты при патологии беременности. Koga К с соавторами описывают потенциальные функции TLRs в клетках трофобласта, распознавание ими микроорганизмов и их роль в реакциях врожденного иммунитета [231, 232]. Предполагается, что клетки в зоне фетоплацентарного комплекса через TLRs распознают патогены, которые могут поставить под угрозу нормальное течение беременности. Однако гиперактивация механизмов врожденного иммунитета может привести к чрезмерному воспалительному процессу или к апоптозу клеток плаценты [72, 108].
В результате внутриутробного инфицирования через плаценту или из низлежащих отделов женского репродуктивного тракта патогены могут проникать в матку [184]. Внутриутробное инфицирование приводят к таким патологиям беременности, как задержка внутриутробного развития плода, гестоз и др. [117, 316]. Механизмы, с помощью которых инфекция может привести к таким осложнениям беременности, остаются в значительной степени неизученными. Считается, что избыточное воспаление, некроз клеток и другие процессы вносят значительный вклад в патологию беременности [269, 316]; В дополнение к основному сигнальному пути с TLRs, который приводит к выработке цитокинов и к развитию воспалительных реакций, активация TLRs может также приводить к запуску процессов апоптоза [115,143, 164, 210, 320].
В настоящее время показано, что ткань плаценты экспрессирует практически все TLRs. Известно, что апоптоз может быть индуцирован активацией TLR4 или TLR2 [143, 262].
Abrahams с соавторами показали, что клетки трофобласта экспрессируют TLR2 и TLR1, при этом уровень экспрессии TLR6 был незначителен. Введение пептидогликана (лиганд TLR2) беременным мышам приводит к обширному плацентарному апоптозу. Следует отметить, что гиперэкспрессия TLR6 приводит к блокировке апоптоза и к выработке ИЛ-6 и ИЛ-8 клетками трофобласта [107, 108]. Установлено, что введение больших доз пептидогликана животным приводит к преждевременным родам [209].
В экспериментах in vitro на клеточных линиях (HTR8 и ЗА) показано, что апоптоз индуцируется взаимодействием лиганда (пептидогликана) с TLR2. Известно, что HTR8 и ЗА линии клеток трофобласта экспрессируют только TLR2 и TLR1 [107]. При блокировании экспрессии TLR2 PDG-индуцированная активация каспазного каскада была значительно снижена.
На основании накопленных в литературе знаний была выдвинута гипотеза, что в ткани плаценты процесс апоптоза может быть активирован через рецепторы системы врожденного иммунитета (TLR2, TLR4).
В связи с этим, нами были изучены уровни экспрессии генов TLR2 и TLR4 в ткани плаценты женщин с преждевременными родами инфекционного генеза и у женщин с урогенитальной инфекцией и срочными родами. Результаты исследований представлены в таблице 30. На рисунке 37 представлены изменения уровней экспрессией генов TLR2, TLR4 в группах с патологией беременности относительно показателя в группе женщин с физиологически протекающей беременностью.
В таблице представлено относительное количество копий исследуемого гена в десятичных логарифмах, в скобках даны значения количества копий кДНК относительно 106 копий актина.
При сопоставлении уровня экспрессии TLR2 клетками плаценты у беременных в третьем триместре (контрольная группа) с аналогичным показателем при урогенитальной инфекции (за исключением УГИ со срочными родами) отмечено значительное увеличение показателя - в 8,5 раз, а при реализации внутриутробной инфекции - в 7 раз. Статистически достоверных различий в экспрессии гена TLR2 клетками плаценты при преждевременных родах на фоне бактериальной, вирусной или смешанной инфекции не было выявлено. Также не было достоверных изменений в экспрессии гена TLR4 в клетках плаценты.
Увеличение экспрессии гена TLR2 в клетках плаценты может быть связано с прямым действием патогенов или быть следствием действия провоспалительных цитокинов, продуцируемых в ответ на инфекционные лиганды. Эти изменения можно рассматривать как механизм положительной обратной связи, усиливающей воспалительный ответ в матке, что может являться причиной преждевременных родов и обеспечивает тем самым защиту материнского организма от инфекции путем избавления от инфицированного плода. Возможно, гиперэкспрессия гена TLR2 непосредственно активирует гибель клеток трофобласта путем апоптоза, а также является причиной ряда осложнений беременности (плацентарной недостаточности и др.).
По данным литературы известно, что апоптоз в клетках может быть вызван цитокинами, дефицитом факторов роста, токсическими веществами и др. К индукторам апоптоза относятся члены суперсемейства ФНО, такие как ФНОос, FasL и TRAIL [260], которые действуют через рецепторы на поверхности клетки (ФНОШ, Fas/CD95, DR3, DR4/TRAIL R1 и DR5/TRAIL R2) [78, 119]. Показано, что плацента содержит большое количество молекул семейства ФНО [179, 304], которые в определенных условиях могут вызывать апоптоз клеток плаценты. Например, ФНОа вызывает апоптоз клеток цитотрофобласта in vitro [386]. Система FasL/Fas может также вызвать апоптоз в ткани плаценты, приводящей к развитию хориоамнионита [121]. В ткани плаценты, полученной при рождении от больных цитомегаловирусной инфекцией, наблюдались нарушения цитотрофобласта. Chan G с соавторами на модели культуры клеток, трофобласта установил, что цитомегаловирус удваивает частоту апоптоза [142]. Несмотря на сведения, приведенные в работах, опубликованных в последнее время, информации, касающейся вопроса о том, как инфекция вызывает воспаление и апоптоз в структуре плаценты, недостаточно.
В данном разделе работы проведено исследование уровней экспрессии генов инициаторной каспазы-8 (CASP 8) и эффекторной каспазы-3 (CASP 3). Белок FLIP участвует в регуляции активности каспазы-8, a XIAP является ингибитором эффекторной каспазы-3. Поэтому нами также были изучены уровни экспрессии генов этих ингибиторов каспаз, для оценки их роли в развитии преждевременных родов инфекционного генеза.
