Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о механизмах нарушения иммунной и цитокиновой систем, основных молекулярно-биологических и гене тических маркерах, регулирующих апоптоз и пролиферацию, некоторых компонентах фибринолитической системы у больных с заболеваниями щитовидной железы (обзор литературы) 23
1.1. Механизмы иммунопатогенеза при опухолевом канцерогенезе у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы 24
1.2. Оценка уровней экспрессии тканевых маркеров апоптоза и пролиферации, сериновых протеаз и их ингибиторов в норме при солидных опухолях и аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы 51
1.2.1. Оценка маркеров пролиферации и апоптоза при канцерогенезе у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы 51
1.2.2. Роль сериновых протеаз в формировании неоангиогене-за, инвазии и метастазирования опухолей щитовидной железы 65
1.3. Молекулярно-биологические генные дефекты и мутации при опухолях и заболеваниях щитовидной железы 71
CLASS ГЛАВА 2. Общая характеристика материалов и методов исследовани CLASS я 75
2.1. Характеристика материала клинических исследований 75
2.2. Методы исследования 79
2.2.1. Получение и хранение тканей и плазмы крови 79
2.2.2. Метод проточной цитометрии 80
2.2.3. Оценка поверхностных рецепторов субпопуляций периферических лейкоцитов, маркеров апоптоза и пролиферации 81
2.2.4. Методы оценки цитокинов и соотношений (индексов) цитокинов в крови больных 83
2.2.5. Подготовка материала для исследования поверхностных рецепторов субпопуляций клеток крови и клеточной суспензии, полученной из тканей щитовидной железы 84
2.2.6. Методы оценки внутриклеточных маркеров апоптоза и пролиферации 85
2.3. Иммунохимические и молекулярно-биологические методы исследования в тканях (цитозолях, парафиновых блоках) щитовидной железы 86
2.3.1. Подготовка глубокозамороженной ткани щитовидной железы для исследования белков, регулирующих апоптоз и пролиферацию 86
2.3.2. Подготовка цитозолеи из тканей щитовидной железы для исследования компонентов системы активации плазминогена 87
2.3.3. Подготовка парафиновых блоков для проведения моле-кулярно-генетических исследований 87
2.4. Методы исследования тканей щитовидной железы 88
2.4.1. Определение маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию в свежезамороженных образцах 89
2.4.2. Определение содержания uPA, PAI-1 и tPA в цитозолях тканей щитовидной железы 93
2.4.3. Метод полимеразной цепной реакции для оценки мутаций онкогена р53 в парафиновых блоках 95
4 2.4.3.1. Подготовка материала для проведения полимеразной цепной реакции 96
2A3.2. Амплификация выделенного материала 97
2.4.3.3. Детекция продуктов амплификации 100
2.5. Оценка некоторых гормональных и иммунологических показателей у больных с заболеваниями щитовидной железы 101
2.6. Статистический анализ данных 102
ГЛАВА 3. Изменения некоторых параметров иммунной системы, мембранных белков апоптоза в крови больных с заболеваниями щитовидной железы (проточная цитометрия) 105
3.1. Оценка уровней клеточного и гуморального иммунитета у больных с аутоиммунными заболеваниями, злокачественными и доброкачественными опухолями щитовидной
железы 106
3.2. Оценка функциональных и аутоиммунных свойств у больных с аутоиммунной патологией, злокачественными и доброкачественными опухолями щитовидной железы 119
3.3. Сравнительная количественная оценка уровней некоторых цитокинов и их соотношений в плазме крови больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными опухолями щитовидной железы 123
3.4. Исследование FAS-L на основных субпопуляциях лимфоцитов и оценка диагностической эффективности этого белка у больных раком щитовидной железы 146
ГЛАВА 4. Оценка маркеров, регулирующих апоптоз, пролиферацию (проточная цитометрия), и уровня сериновых протеаз в нормальных и патологических тканях щитовидной железы 158
41 . Исследование молекулярно-биологических маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, у больных с заболеваниями щитовидной железы (проточная цитометрия) 159
4.1.1. Сравнительное исследование маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, их диагностическая эффективность в тканях щитовидной железы при аутоиммунных заболеваниях, доброкачественных и злокачественных опухолях 159
4.1.2. Исследование маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, оценка их диагностической эффективности в тканях щитовидной железы при папиллярном и фолликулярном раке щитовидной железы 191
4.1.3. Сравнительное исследование общих и комбинированных маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, их диагностическая эффективность в опухолях и «нормальных» тканях больных раком щитовидной железы 204
4.1.4. Исследование маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, оценка их диагностической эффективности в тканях у больных с разными вариантами аденомы щитовидной железы 215
4.1.5. Сравнительное исследование общих и комбинированных тканевых белков, регулирующих апоптоз и пролиферацию, их диагностическая эффективность в аденомах и «нормальных» тканях щитовидной железы 231
4.2. Сравнительный анализ содержания uPA, tPA и PAI-1 в злокачественных и доброкачественных новообразованиях щитовидной железы 240
ГЛАВА 5. Молекулярно-генетическии маркер р53 при заболеваниях щитовидной железы (по дан ным метода амплификации нуклеиновых кислот) 250
Заключение 254
Выводы 288
Практические рекомендации 291
Список литературы 294
- Оценка маркеров пролиферации и апоптоза при канцерогенезе у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы
- Подготовка материала для исследования поверхностных рецепторов субпопуляций клеток крови и клеточной суспензии, полученной из тканей щитовидной железы
- Оценка функциональных и аутоиммунных свойств у больных с аутоиммунной патологией, злокачественными и доброкачественными опухолями щитовидной железы
- Сравнительное исследование общих и комбинированных маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, их диагностическая эффективность в опухолях и «нормальных» тканях больных раком щитовидной железы
Оценка маркеров пролиферации и апоптоза при канцерогенезе у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы
Известно, что опухолевые клетки отличаются от нормальных клеток морфологически и функционально, а также способностью к безграничному росту. Трансформация нормальных клеток в опухолевые приводит к нарушению баланса между процессами обновления (пролиферации) и гибели (апоптоза) клеток, которые характерны для тканей и органов взрослых особей. Бесконтрольная пролиферация трансформированных, фенотипически отличающихся опухолевых клеток приводит к накоплению в организме в огромных количествах опухолевых клеток одного клона, которые могут образовывать солидные опухоли или доминировать среди циркулирующих клеток крови при гемобластозах. Неконтролируемое деление раковых клеток связывают с нарушением экспрессии в клетках одного или нескольких нормальных генов пролиферации и дифференцировки клеток так называемых протоонкогенов. В нормальных клетках белки, кодируемые протоонкогена-ми, необходимы для регуляции роста клеток (они могут работать как гены синтеза ростовых факторов или рецепторов к ним, а также как гены, контролирующие в клетке синтез различных сигнальных и транскрибирующих факторов).
Запрограммированная гибель клетки, не связанная с патологией, описана почти 50 лет назад, а термин «апоптоз» был предложен Y. Kerr и соавт. в 1972 г. Апоптоз принимает участие в регуляции массы как нормаль ной ткани, так и опухолевой. К маркерам апоптоза в настоящее время приня то относить белки FAS (Аро-1, CD95+) и FAS-L (FAS-лиганд, CD178+), р53 (продукт гена р53), Lewis-Y, bcl-2 (продукт гена bcl-2) и др.; причем некото рые исследователи протоонкогену bcl-2 отводят ключевую роль в регуляции апоптоза при некоторых онкологических заболеваниях [52, 85, 86, ПО, 188]. bcl-2 предотвращает вход клеток в апоптоз и удлиняет время выживания клеток. Его экспрессия циклически колеблется, коррелируя с менструальным циклом, что свидетельствует о его гормональной регуляции [93]. Имеются сведения о том, что увеличение экспрессии этого фактора может приводить к повышению резистентности опухолевых клеток к действию химических факторов, в норме вызывающих апоптоз [57]. Существует семейство bcl-подобных белков, являющихся модуляторами апоптоза. Некоторые из них (bcl-xl, Bag и сам bcl-2) препятствуют развитию апоптоза, тогда как другие (bcl-xs, Вах, Bad, Bak и Bid), наоборот, служат промоторами этого процесса [52, 287]. Наиболее хорошо изученным из всех генов данного семейства, участвующих в развитии апоптоза, является ген bcl-2. Он обнару жен в клетках фолликулярной В-клеточной лимфомы при изучении трансло ) } 53 кации t (q32-q31), при которой ген bcl-2 перемещается в локус lgh. Вследствие такой мутации происходит злокачественная трансформация. При ряде злокачественных новообразований наблюдается его гиперэкспрессия, которая не связана с транслокацией. Продукты гена (белки) экспрессируются на мембране митохондрий, в меньшей степени - на поверхности клеток [15, 234]. Многочисленные исследования показывают, что экспрессия bcl-2 может блокировать апоптоз, индуцированный рядом сигналов, в том числе радиацией, химиотерапевтическими препаратами, удалением факторов роста, стероидами и тепловым шоком [190, 221]. bcl-2 также способен защищать клетку от апоптоза, регулируемого р53, что предполагает супрессию феноти-пического сигнала и встречается при опухолевой трансформации [52, 205, 234]. Белок bcl-2 может блокировать апоптоз даже в присутствии высокого уровня дикого белка р53 в клетке, что может быть свидетельством того, что его действие направлено на элементы сигнального каскада, следующие за р53 [65]. Наличие повышенной экспрессии белка bcl-2 по одним данным служит маркером плохого прогноза, маркером повышенной агрессивности [142] и маркером потери дифференциации у больных с тиреоидной карциномой [284], а по другим обеспечивает лучшую выживаемость [156]. Кроме того, по данным некоторых исследователей [21, 63], резистентность опухолей к воздействию противоопухолевых препаратов и облучению может быть обусловлена повышенной экспрессией bcl-2, поскольку гибель опухолевых клеток происходит по механизму апоптоза [320].
Помимо bcl-2 важным регулятором апоптоза является ген-супрессор р53, однако во многих случаях ( в 50%) он подвергается мутациям, поэтому его проапоптотический эффект оказывается блокированным [52, 65, 110]. р53 — ядерный фосфопротеин, открытый в sV40 трансформированных клетках, в которых он связан с Т-антигеном. Повышенная экспрессия р53 была обнаружена во многих раковых клеточных линиях. В ранних экспериментах вставка клонированного р53 была найдена в иммортализованных клетках, в связи с чем его назвали онкогеном с обычной доминантной функ 54 цией. Но все трансформирующие формы р53 выключались- в мутантных формах белка. Поэтому они попали в категорию доминантных негативных мутантов, которые функционируют через подавление функции в диком типе. Наиболее общей формой доминантного негативного мутанта является та, которая формирует гетеродимерный белок, объединяющий субъединицу мутировавшего и дикого типа, в котором субъединица дикого типа не функционирует. Вероятно, р53 существует как тетрамер.
В отличие от дикого типа, мутантные формы белка не способны связывать Т-антиген. Связывание дикого типа р53 с Т-антигеном коррелирует с его способностью стимулировать репликацию вируса. р53 дикого типа связывается с клеточными аналогами Т-антигена, при этом ингибируется активность последнего. У мутантных форм такая способность теряется.
Белок р53 является ДНК-связывающим белком, узнающим специфичный мотив из 10 п.о. в активном промоторе, который содержит этот мотив. Для некоторых генов р53 может быть супрессором, он также регулирует экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл [47]. Этот белок связывается с последовательностью ДНК PuPuPuC (А/Т)(Т/А) GpyPyPy, которая содержится в некоторых промоторах.
Подготовка материала для исследования поверхностных рецепторов субпопуляций клеток крови и клеточной суспензии, полученной из тканей щитовидной железы
Для исследования использовалась свежая (хранению не подлежит) стабилизированная ЭДТА периферическая кровь пациентов. При этом для оценки субпопуляционной структуры клеточного звена иммунитета в пластиковую пробирку забиралось 20 мкл моноклональных антител, добавлялось 100 мкл крови и тщательно перемешивалось на вортексе без образования вспенивания для конъюгации. Образец хранился 15 мин при комнатной температуре, в темном месте. После 15 мин добавляли 500 мл однокомпонентного лизирующего раствора OptiLyse С фирмы «Beckman Coulter» (США) и содержимое тщательно перемешивали. Данный раствор лизировал эритроциты, не изменяя структуру лейкоцитов. Через 15 мин инкубации в темном месте к образцу добавляли 500 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) и через 5 мин образец был готов для исследования в проточном цитофлуори-метре. В ряде случаев использовали модифицированный нами метод подготовки клеток к исследованию в проточном цитометре (Рацпредложение № 1486/19 от 20.12.2001 г., ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, Москва). Проводились исследования относительного и абсолютного количества клеток, а также подсчитывалось общее число поверхностных маркеров (в усл. ед.) по средней интенсивности свечения флуоресценции (MFI), пропорциональной номеру канала, измеренного в логарифмическом режиме (плотность экспрессии рецепторов в исследуемой группе клеток). Для оценки абсолютного количества субпопуляций выполняли исследования абсолютного количества лейко 85 цитов. в крови обследуемых на: аппарате «MICROS 60-ОТ» фирмы «АВХ DIAGNOSTICS» (Франция) и подсчет лимфоцитов в формуле крови микроскопическим методом.
При исследовании внутриклеточных и мембранных маркеров апопто-за (bcl-2, р53, CD95, CD95L) и пролиферации (Кі-67) в клеточной суспенции, приготовленной из тканей щитовидной железы, пользовались реактивами для пермебилизации клеток «INTRAPREP» фирмы «CALTAG» (США) по специальной методике.
Суспензия клеток из тканей готовилась по описанной ниже методике. После окончания периода инкубации еще раз осторожно перемешивали клетки и переносили по 100 мкл клеточной суспензии в пробирки 12x75 мм. Добавляли 5 мкл моноклональных антител для окрашивания поверхностно-клеточных маркеров.
Инкубировали 15 мин при комнатной температуре, в темноте. Добавляли 100 мкл пермебилизирующего реагента из набора «INTRAPREP», осторожно перемешивали и инкубировали еще 15 мин при комнатной температуре, в темноте.
Промывали дважды средой (ФСБ+1% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% NaN3). Осадок после второй промывки становился менее плотным, поэтому во избежание потери клеток проводили их подсчет. К промытым клеткам добавляли 100 мкл фиксирующего реагента из набора «INTRAPREP» и 1-10 мкл моноклональных антител к внутриклеточным .цитокинам (маркерам). Инкубировали 20 мин при температуре 4С, в темноте.
Дважды промывали средой и ресуспендировали осадок в 1% растворе формальдегида в PBS. Анализировали на цитометре в стандартных двухпа-раметрических или трехпараметрических протоколах. 2.31 Иммунохимические и молекулярно-биологические методы исследования в тканях (цитозолях, парафиновых блоках) щитовидной железы
Для исследования гиперплазированных тканей, тканей, пораженных аутоиммунным процессами, тканей доброкачественных и злокачественных солидных опухолей исследовали глубокозамороженные образцы участков тканей, цитозолей, приготовленных из тканей щитовидной железы, а также материал из парафиновых блоков, приготовленных из тканей щитовидной железы, которые были забраны для гистологических исследований.
Замороженные фрагменты ткани перемещали из морозильника (-70С) на предметное стекло, где путем размельчения скальпелем на маленькие кусочки в ФСБ получали гетерогенную суспензию клеток. Полученное содержимое собирали в пластиковую пробирку объемом 5-10 мл, прибавляя 1-2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) без ионов Са4" и Mg"4", содержащего 0,25% раствор трипсина и ЭДТА 1 ммоль. Помещали на 2 ч в термостат Cobas фирмы «РОШ» при температуре 37С в режиме постоянного перемешивания. Встряхивали на вортексе и переливали жидкость в коническую пробирку через нейлоновые фильтры «Filcons» диаметром 35-50 мкм фирмы «Partec» (ФРГ). Отмывали суспензию профильтрованных клеток 2 раза в ФСБ и центрифугированием ресуспендировали осадок, прибавляя или удаляя необходимое количество ФСБ до конечной концентрации 1-2 106 клетки в литре. Конечную концентрацию определяли на аппарате MICROS 60-ot фирмы «АВХ DIAGNOSTICS» (Франция), который позволял рассчитать общее количество клеток по их размерам.
Из полученной гетерогенной суспензии готовили цитологический препарат, который после окрашивания изучался врачами-морфологами микроскопические для подтверждения- выданных ранее гистологических заключений о принадлежности препарата изучаемым нозологиям.
После приготовления суспензии проводили исследование мебранных и внутриклеточных маркеров в проточном цитометре с использованием единого стандартного протокола и едиными настройками прибора по описанной выше методике и подсчетом не менее 100 000 событий в одном образце.
Оценка функциональных и аутоиммунных свойств у больных с аутоиммунной патологией, злокачественными и доброкачественными опухолями щитовидной железы
Функциональные свойства щитовидной железы в группе практически здоровых людей и у больных с аутоиммунными заболеваниями, злокачественными и доброкачественными новообразованиями ЩЖ не зависели от нозологии (см. табл. 8).
Однако у больных РЩЖ обнаружены более выраженные функциональные расстройства ЩЖ, чем у больных АЩЖ. Функциональные расстройства характеризовались у больных РЩЖ повышенным показателем Т4, который составлял 119,55±8,73 нмоль/л и статистически достоверно отличался от такового показателя в группе АЩЖ (р 0,05). Концентрации ТЗ, Т4, Т3(с), Т4(с) не имели определенной тенденции и находились в пределах нормальных величин. Уровень ТТГ отражал состояние гипотиреоза или гипертиреоза в зависимости от степени вовлечения в опухолевый процесс клеток, синтезирующих гормоны, и активности опухолевого процесса. При этом концентрация ТТГ у пациентов с аутоиммунными поражениями ЩЖ была наиболее высокой, выходила за пределы нормальных величин и составила 4,2±3,74 МКЕ/мл; статистически значимые различия в показателях ТТГ , гдеколичество ЄЗ-компонентахоставило .0 55+0;23 г/л. Показатели! СЗ-компонента комплемента были значимыми и достоверно отличались от показателей группы контроля.
С4-компонент комплемента во всех группах больных в отличие от СЗ-компонента комплемента в контроле имел тенденцию к снижению. Однако сколько-нибудь значимых различий этого показателя при статистической обработке данных получено не было. В то же время отмечена тенденция к повышению при анализе этого показателя у больных с аутоиммунной патологией ЩЖ и аденомой ЩЖ относительно контроля.
Анализ данных специфического звена гуморального иммунитета и циркулирующих иммунных комплексов у больных аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными опухолями ШЖ показал, что между группами отмечены различия (см. табл. 7). Так, количество иммуноглобулинов А было наибольшее при злокачественных заболеваниях ЩЖ (3,2+2,06 г/л), а наименьшим - при доброкачественных опухолях ЩЖ (1,9+0,177 г/л). Количество иммуноглобулинов А в группе с аутоиммунными между группами не выявлены. Концентрация» паратиреоидного гормона: в-обследуемых группах не имела значимой динамики и находилась в пределах нормальных значений.
Количественный анализ наличия антител к тиреоглобулину и тирео-пероксидазе, исследуемых электрохемилюминесцентным методом в обследованных группах, показал, что выявлены статистически значимые различия в концентрации этих антител между группами (см. табл. 9). Так, получены статистически значимые различия (р 0,05) при сравнении количества антител к тиреоглобулину между группами с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ, где этот показатель составил 431,9+125,71 МЕ/мл, и группой контроля, у которых количество антител составило 15,9+5,61 МЕ/мл.Также получены статистически значимые различия в концентрациях антител к тиреоглобулину между группой больных злокачественными опухолями ЩЖ (268,89±167,87 МЕ/мл) и контролем (15,9±5,61 МЕ/мл) (р 0,05). Проведенный сравнительный анализ в группах больных злокачественными и доброкачественными опухолями ЩЖ показал, что имеются достоверные различия по количественному определению антител к тиреоглобулину в этих группах. Так, количество антител в группе с доброкачественными опухолями ЩЖ составило 12,91±7,42 МЕ/мл, а у пациентов в группе со злокачественными новообразованиями - 268,89± 167,87 МЕ/мл (р=0,047).
Анализ данных по сравнению между группами показателей антител к тиреопероксидазе показал наличие статистически достоверных различий (р=0,036) в группах пациентов с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ и в группе контроля. Так, среднее количество антител к тиреопероксидазе в группе с аутоиммунными заболеваниями составило 290,53±217,26 МЕ/мл и статистически отличалось от количества антител к тиреопероксидазе в труп пе контроля; где их количество составило 12,2±11,9і МЕ/мл. Была отмечена тенденция к повышению количества антител к тиреопероксидазе у больных с ! РЩЖ (41,19±26,9 МЕ/мл) по сравнению с АЩЖ (17,93±12,2 МЕ/мл) и і контролем (12,2±11,9 МЕ/мл). Проведены исследования антител к тиреоглобулину и микросомаль ( ной фракции полуколичественным методом, основанным на РНГА, в группах I пациентов со злокачественными и доброкачественными новообразованиями \ ЩЖ. Результаты исследования аутоиммунных нарушений у больных ново образованиями ЩЖ представлены в табл. 10. Установлено, что аутоиммун ч ) ные нарушения в тканях ЩЖ отмечены в 34-42% наблюдений у больных РЩЖ и у 39-51% пациентов с доброкачественными новообразованиями ЩЖ.
Сравнительное исследование общих и комбинированных маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, их диагностическая эффективность в опухолях и «нормальных» тканях больных раком щитовидной железы
Проведено сравнительное исследование количества клеток, комбинированных групп клеток и плотности распределения рецепторов/белков основных маркеров, принимающих участие в механизмах апоптоза и пролиферации, в участках морфологически «нормальной» ткани ШЖ и тканей опухолей у больных с гистологически верифицированными папиллярными РЩЖ.
При этом образцы «нормальной» ткани ЩЖ забирались из другой неизмененной опухолевым процессом доли (перешейка) ЩЖ, и по морфологическим признакам эта ткань не отличалась от ткани ЩЖ практически здоровых людей. Результаты сравнительного исследования количества клеток и плотности распределения рецепторов/белков, регулирующих апоптоз и пролиферацию в этих группах тканей ЩЖ, представлены в табл. 35.
Выявлено статистически достоверное увеличение (р=0,016) количества CD95-icieTOK в образцах с морфологически не измененными участками ткани (3,99±2,07%) по сравнению с образцами опухоли (1,2±0,57%). В то же время статистические результаты не выявили достоверных различий по показателям плотности распределения CD95-рецептора (р=0,345) в образцах «нормальной» ткани и опухоли у больных РЩЖ.
Отмечена тенденция к незначительному увеличению количества клеток с маркером CD95L и значительному увеличению плотности экспрессии CD95L мембранного рецептора в С095Ь-позитивных клетках в образцах «нормальной» ткани ЩЖ в отличие от опухолевой. Так, количество клеток с маркером CD95L и плотность экспрессии CD95L в образцах «нормальной» ткани ЩЖ составили 6,88±2,4% и 27,72±11,81 соответственно против этих же показателей в образцах с РТТТЖ - 5,06±2,29% и 21,86±5,95 соответственно.
Не обнаружены статистически значимые различия по количественному составу р53-клеток. При этом показатели количества клеток с р53-белком как.в одной; так и.в другой-группе сравнения, не отличались друг от. друга и составили 63,81±11,09% в «нормальной» ткани и 65,68±8,23% в опухоли. Выявлены статистически значимые результаты (р=0,021) по показателю плотности экспрессии белка р53 в р53-позитивных клетках в образцах «нормальной» ткани ЩЖ (3,17±0,32) и опухолевой ткани (2,47±0,37).
Обнаружена тенденция к увеличению количества р53 ""-клеток в образцах тканей опухоли до 54,79± 10,61% в сравнении с «нормальными» образцами тканей ЩЖ, где этот показатель составлял 47,34± 12,44%. При этом плотность распределения белка р53 в р53 ""-клетках в образцах, не пораженных опухолью тканей, была достоверна (р=0,021) в сравнении с образцами ткани РЩЖ.
Отмечена обратная тенденция к снижению количества р53 ng клеток в образцах ткани РЩЖ до уровня 7,24±1,69% по сравнению с образцами «нормальной» ткани ЩЖ, где этот показатель был выше и составлял 10,91±4,62%. Значения плотности экспрессии белка р53 в р53Ьпе 1-клетках были сопоставимы в обеих группах сравнения.
Не обнаружены достоверные различия между образцами «нормальной» ткани ЩЖ и опухолями по показателю количества bcl-2-клеток. Наибольшее количество bcl-2-клеток выявляли в образцах «нормальной» ткани (72,31±10,85%). Незначимо меньше содержалось bcl-2-клеток (70,77±8,31%) в образцах опухоли ЩЖ. Выявлены достоверные различия (р=0,005) по показателям плотности распределения bcl-2-белка в этой группе клеток, которые составили 3,19±0,37 для «нормальной» ткани и 2,56±0,25 для опухолей ЩЖ.
Показатели общего количества Ьс1-2а т-клеток как в «нормальной» ткани, так и в опухоли составили 52,88±9,43 и 60,01±9,71% соответственно, при этом не отмечено статистически значимых различий по этому показателю в сравниваемых группах. Не выявлено достоверных различий между образцами-, «нормальной» ткани и опухоли по показателю плотности распре 207 деления ЬсІ-2-белка в группе, общих bcl-2 dim-no3HTHBHbix клеткок. Этот показатель при РЩЖ составил 1,58±0,12, а в «нормальных» тканях - 1,6±0,18.
Выявлены статистически значимые различия по количеству bcl-2 п -клеток (р=0,001) в исследумых группах. Так, величина количества bcl-2bnsht-клеток была повышенной (10,83±2,53%) в образцах «нормальной» ткани ЩЖ и в опухоли (6,86±0,96%). Плотность bcl-2-белка в группе Ьс1-2ЬпеЬ1-клеток находилась на одном уровне в группах сравнения и составила 10,42±0,56 в образцах «нормальной» ткани из другой доли ЩЖ и 10,23±1,4 в образцах опухоли.
Таким образом, невзирая на морфологический состав образцов (наличие опухолевых клеток или их отсутствие), в тканях ЩЖ, пораженных опухолевым процессом (раком), на молекулярном уровне отмечаются характерные признаки нарушений процессов апоптоза, свойственных злокачественным опухолям. Причем эти процессы не носят локального характера, а распространяются по всей ткани органа, подтверждая генетически детерминированную гипотезу развития злокачественных процессов.
Анализ пролиферативной активности в сравниваемых образцах ткани ЩЖ показал, что количество Кі-67-клеток было наиболее высоким в образцах «нормальной» ткани ЩЖ (1,97±0,36%) по сравнению с опухолевыми образцами (1,01±0,24%); при этом получены статистически достоверные различия (р=0,001). Величина плотности экспрессии белка Кі-67 в группе Ki-67-положительных клеток «нормальной» ткани ЩЖ была достоверно (р=0,001) выше и составила 1,55±0,1, в то же время этот показатель в образцах с опухолью снижался (1,25±0,13).
Таким образом, исследование количества клеток и плотности распределения рецепторов/белков основных маркеров апоптоза и пролиферации в образцах «нормальной» ткани и РЩЖ выявило незначительные различия. Даже в показателях, где были выявлены достоверные различия (CD95, Кі-67, bcl-2 r 8 1), реальные количественные значения отличались невыраженно, что позволяет предполагать наличие малочисленных параметров, по которым можно отличать эти два типа ткани вне зависимости от их изначальной морфологической линии. Полученные данные позволяют предположить, что, при;развитии.РЩЖ в отдельной доле ЩЖ, по-данным-маркеров.апоптоза, патологический процесс на молекулярном уровне распространяется также и на непораженные участки ЩЖ, подчас расположенные в другой доле (перешейке) ЩЖ. Все это подтверждает генетически детерминированный характер развития злокачественного опухолевого процесса в органе, а не в отдельно взятом участке ткани ЩЖ.
Были рассчитаны критические значения и диагностическая эффективность изученных маркеров, которые имеют достоверные различия при сравнении двух образцов тканей, взятых из одного пораженного опухолевым процессом органа. Полученные данные представлены в табл. 36.
В дифференциальной диагностике-образцов,«нормальных» и опухолег вых тканей ЩЖ рекомендуем использовать критические значения показателей количества клеток с маркером CD95. Так, значение менее 1,89 при относительно невысоких показателях чувствительности (87,5%), специфичности (75%) и точности (81,25%) позволяет обнаружить образцы РЩЖ.
Дополнительными дифференциально-диагностическими критериями по оценке образцов «нормальной» и опухолевой ткани ЩЖ выявлены как показатели плотности экспрессии белка р53 в р53-позитивных клетках, так и показатели плотности белка р53 в р53 ""-позитивных клетках. Так, значения менее 2,56 и менее 1,67 соответственно при чувствительности 75%, специфичности 87,5 и 75% и точности метода 81,25 и 75% соответственно позволяли обнаружить образцы РЩЖ.
Пожалуй, наибольшее значение имеют показатели количества Ki-67-клеток и величины плотности экспрессии Кі-67 в Ki-67-позитивных клетках, которые позволяют отличить «нормальную» ткань ЩЖ и трансформированную опухоль. Этот показатель обладал наибольшей чувствительностью (87,5%), специфичностью (99,9%) и точностью метода (93,7%) и при значениях менее 1,3% и менее 1,35 с высокой достоверностью свидетельствовал о наличии папиллярного РЩЖ, а при значениях более 1,3% и более 1,35 при тех же показателях чувствительности и специфичности метода свидетельствовал о наличии в исследованном образце «нормальной» ткани ЩЖ.
При сравнительном анализе двух вышеуказанных типов тканей ЩЖ их отличал показатель плотности распределения белка bcl-2 в общей группе bcl-2-клеток. Так, если этот показатель был менее 2,58, то при относительно невысокой чувствительности (75%), специфичности (99,9%) и точности метода (87,45%) можно утверждать о патологическом (опухолевом) характере клеток в образце ткани, а при показателе более 2,58 — о «нормальной» ткани ЩЖ.
