Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 16
1.1 Т-клетки памяти 16
1.1.1 Формирование Т-клеток памяти 16
1.1.2 Поддержание Т-клеток памяти 19
1.1.3 Т-клетки памяти и вторичный иммунный ответ 20
1.1.4 Методы определения Т-клеток памяти 22
1.2. Т-В клеточные взаимодействия 25
1.2.1 Хемокины и их рецепторы 26
1.2.2 Костимулирующие молекулы 26
1.2.3 Регуляция дифференцировки Т- и В-лимфоцитов (Bcl-6 / Blimp-1) 28
1.2.4 Интерлейкин 21 и другие цитокины 30
1.2.5 Созревание аффинитета и переключение изотипов антител 31
1.3 Иммунный ответ 32
1.3.1 Первичное распознавание и миграция лимфоцитов 32
1.3.2 Первичный иммунный ответ 33
1.3.3 Формирование плазматических клеток и В-клеток иммунологической памяти 34
1.3.4 Перемещение клеток в зародышевом центре 36
1.3.5 В-клетки памяти, долгоживущие плазматические клетки и вторичный иммунный ответ 39
1.4 Корь, краснуха, эпидемический паротит и тривалентная вакцина против них 40
1.4.1 Корь 40
1.4.2 Краснуха 44
1.4.3 Эпидемический паротит 45
1.4.4 Тривакцина против кори, краснухи и паротита 46
1.5 Изменения в иммунной системе при вирусных инфекциях (корь, краснуха, эпидемический паротит) 47
1.5.1 Лимфопения 47
1.5.2 Изменения в составе субпопуляций лимфоцитов 49
1.5.3 Изменения в функциональной активности лимфоцитов 50
1.5.4 Изменения цитокинового профиля 51
1.5.5 Специфический гуморальный ответ 52
1.6 Изменения в иммунной системе при вакцинации (корь, краснуха, эпидемический паротит) 53
1.6.1 Лимфопения 53
1.6.2 Изменения в составе субпопуляций лимфоцитов 53
1.6.3 Изменения в функциональной активности лимфоцитов 54
1.6.4 Изменения цитокинового профиля в ответ на вакцинацию 54
1.6.5 Специфический гуморальный ответ на вакцинацию 56
1.7 Использование иммунокорректоров при вакцинации 57
Глава 2 Общая характеристика обследованных лиц и методы исследования 60
2.1 Общая характеристика когорты обследованных лиц 60
2.2 Вакцины и лекарственные препараты 64
2.3 Сбор и процессинг крови 64
2.4 Определение численности субпопуляций лимфоцитов периферической крови 64
2.5 Определение количества иммуноглобулинов классов А, М, G 70
2.6 Определение количества иммуноглобулина класса Е 70
2.7 Определение уровня субклассов IgG 71
2.8 Определение количества специфических иммуноглобулинов классов А, М, G 71
2.9 Определение субклассов специфических IgG 2.10 Определение авидности специфических IgG-антител 74
2.11 Определение содержания цитокинов в сыворотке крови и культуральной жидкости 74
2.12 Определение содержания интерлейкина 17А в сыворотке крови и культуральной жидкости 76
2.13 Определение содержания трансформирующего фактора роста бета в сыворотке крови и культуральной жидкости 76
2.14 Определение содержания общего (свободного и связанного) интерлейкина 10 и общего фактора некроза опухолей-альфа в сыворотке крови 77
2.15 Оценка клеточной пролиферации методом прижизненной окраски лимфоцитов 5 и 6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфира 77
2.16 Определение специфически индуцированной дегрануляции цитотоксических Т клеток 79
2.17 Методы математической обработки полученных результатов 81
Результаты собственных исследований 84
Глава 3 Неспецифические реакции иммунной системы в ответ на введение живой вирусной вакцины Приорикс 84
3.1 Клинико-лабораторное обследование состояния здоровья прививаемых детей 84
3.2 Изменение количества клеток основных субпопуляций лимфоцитов 87
3.3 Изменение количества Т- и В-клеток памяти в ответ на прививку Приорикс 90
3.4 Экспрессия поверхностных маркеров CD46 и CD, являющихся рецепторами для вирусов кори 101
3.5 Влияние вакцинации «Приорикс» на общее количество иммуноглобулинов классов А, М, G и Е
3.6 Влияние вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита на уровень цитокинов в сыворотке крови у детей 107
3.7 Оценка направления дифференцировки Т-хелперов после вакцинации «Приорикс»... 110
3.8 Анализ иммунофенотипических маркеров Т-регуляторных клеток и Thl7 у
детей, привитых Приорикс 116
3.9 Влияние вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита на количе
ство иммунорегуляторных цитокинов в сыворотке крови у детей 119
3.10 Экспрессия маркеров активации на Т-лимфоцитах периферической крови детей,
привитых и ревакцинированных Приорикс 122
Глава 4 Специфический иммунный ответ на вакцинацию Приорикс 127
4.1 Формирование специфического гуморального ответа на прививку Приорикс 127
4.2 Спектр субклассов специфических иммуноглобулинов G у детей, привитых Приорикс 132
4.3 Созревание и поддержание специфического гуморального ответа на прививку и ревакцинацию Приорикс 134
4.4 Оценка диагностической значимости определения субклассов специфических IgG-антител у привитых вакциной Приорикс 139
4.5 Специфический гуморальный иммунный ответ у ранее привитых и не привитых больных корью 142
4.6 Пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови на антигены вирусов кори и краснухи у интактных и иммунных детей
4.6.1 Митоген-индуцировнный пролиферативный ответ у привитых детей 149
4.6.2 Специфически индуцированный пролиферативный ответ на антигены вирусов кори и краснухи у интактных и иммунных детей 151
4.7 Оценка антиген-индуцированной продукции цитокинов in vitro лимфоцитами периферической крови впервые привитых и ревакцинированных детей 154
4.7.1 Оценка спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокинов in vitro лимфоцитами периферической крови привитых и ревакцинированных детей 154
4.7.2 Оценка антиген-индуцированной продукции цитокинов in vitro лимфоцитами периферической крови привитых детей 156
4.8 Специфически индуцированная дегрануляция цитотоксических клеток у впервые привитых и ревакцинированных детей 158
Глава 5 Математическое моделирование процессов формирования и поддержания им мунологической памяти у детей, привитых Приорикс 170
5.1 Корреляционный анализ 171
5.2 Метод байесовских сетей доверия 183
5.3 Метод главных компонент 190
Глава 6 Обсуждение 205
6.1 Общие реакции иммунной системы на прививку Приорикс 205
6.2 Специфический иммунный ответ на вакцинацию Приорикс 223
6.3 Математическое моделирование 245
Заключение 253
Выводы 258
Рекомендации и перспективы 260
Список литературы
- Т-клетки памяти и вторичный иммунный ответ
- Определение численности субпопуляций лимфоцитов периферической крови
- Экспрессия поверхностных маркеров CD46 и CD, являющихся рецепторами для вирусов кори
- Оценка антиген-индуцированной продукции цитокинов in vitro лимфоцитами периферической крови привитых детей
Т-клетки памяти и вторичный иммунный ответ
Антигенная стимуляция наивных Т клеток является необходимым условием для формирования иммунологической памяти [311, 346]. Также доказано, что степень выраженности клеточной пролиферации в процессе формирования первичного иммунного ответа предопределяет размер пула соответствующих Тт [309, 337, 449]. Образовавшийся пул антигенспецифических Тт превосходит изначальный пул наивных Т-клеток, специфичных к данному антигену в 200-1000 раз [179]. Использование адъювантов при вакцинации как раз направлено на усиление активации и пролиферации наивных лимфоцитов с целью увеличения популяции клеток памяти. Поскольку адъюванты напрямую влияют на антиген-презентирующие клетки, полагают, что факторы, стимулирующие врожденный иммунитет, такие как интерферон-а (IFN-а) или Toll 17 подобные рецепторы на антиген-презентирующих клетках [95, 135], могут усиливать адаптивный иммунный ответ и, в особенности, увеличивать количество Т клеток памяти.
До сих пор нет единого мнения о том, образуются ли Тт непосредственно из Т эффекторов, или из отдельной субпопуляции предшественников Тт, дифференцирующихся из активированных Т клеток, независимо от эффекторов [348, 381, 568]. Было показано, что CD8 виру-соспецифические Тт развиваются сразу вслед за формированием Т-эффекторов из наивных Т-лимфоцитов [294, 329, 333, 346, 475], однако, в других исследованиях было обнаружено, что формирование эффекторов не является необходимым для формирования Тт [417]. На ранних этапах формирования иммунного ответа одновременно определяют субпопуляции короткожи-вущих эффекторов первичного иммунного ответа и предшественников памяти [343]. Также нет единого мнения в вопросе дифференцировки CD4 Т клеток памяти. Образуются ли они из уже поляризованных (Thl и Th2) эффекторов или из отдельной субпопуляции неполяризованных хелперов с промежуточным фенотипом [254, 311]. Позже выяснилось, что даже уже сформировавшиеся и четко дифференцированные CD4 Тт при повторной стимуляции антигеном способны продуцировать типично «свои» цитокины, то есть IFN-y для Thl или интерлейкин (IL)-4 для Th2, так и прямо противоположные. Иными словами, наблюдается определенная степень пластичности даже у полностью дифференцированных зрелых CD4 Тт [375, 398].
Комбинированная модель развития клеток памяти, предложенная S.M. Kaech и E.J. Wherry [349], состоит в том, что предшественники Тт образуются на ранних этапах первичного иммунного ответа, но это еще не вполне зрелые Тт и им требуются дополнительные стимулы и диф-ференцировка. На этом этапе они могут дифференцироваться как в зрелые Тт (преимущественно), так и в эффекторы первичного иммунного ответа, если получат дополнительные провоспа-лительные сигналы. Также показано, что IL-10 и IL-21 способствуют формированию зрелых Тт, повышая экспрессию SOCS3, который ограничивает STAT-сигналинг, поступающий от рецепторов провоспалительных цитокинов [ 184].
Поскольку активация и пролиферация Т клеток требует экспрессии соответствующих молекул костимуляции, они также принимают участие в формировании Тт. Пролиферация и образование CD4 клеток памяти в значительной степени зависит от экспрессии CD28, CD40L (CD 154) и ОХ40 [262, 490, 635]. Для формирования CD8+ клеток памяти наиболее важными оказались CD40L, CD27 (CD70L) и CD28 [138, 302, 305, 397, 577, 582]. Кроме того, показано, что для формирования Тт необходим и третий, цитокиновый сигнал. Наиболее важными являются IL-2, IFN-y и фактор некроза опухолей (TNF)-a [118, 294]
Также для образования CD8 клеток памяти необходимы сигналы, поступающие от CD4 клеток на ранних стадиях первичного иммунного ответа [335, 555, 576]. Основываясь на экспрессии различных хоминг-рецепторов на CD4 и CD8 субпопуляциях клеток памяти, таких как хемокиновый рецептор 7 (CCR7) и L-селектин (CD62L) были выделены субпопуляции центральных и эффекторных Тт [320, 529, 631]. Центральные Т клетки памяти несут маркеры CCR7 CD62L , они располагаются во вторичных лимфоидных органах, продуцируют IL-2, но не IFN -у и не имеют перфорина и гранзимов. Они отвечают за поддержание пула Т клеток памяти и демонстрируют высокую пролиферативную активность. Эф-фекторные клетки памяти имеют фенотип CCR7" CD62L , они не заходят в лимфатические узлы, но обнаруживаются в селезенке [345], циркулируют через нелимфоидные периферические ткани и продуцируют IFN-y и IL-4, но не JL-2. Эти клетки отличаются низкой пролиферативной активностью и отвечают за немедленную элиминацию антигена из организма, для чего вооружены гранзмами и перфорином [116, 422, 521, 529]. Остается не вполне ясным, происходят ли эти две субпопуляции из одних предшественников. Так N. Manjunath et al. обнаружил, что эффекторы памяти происходят из полностью дифференцированных Т-эффекторов, а центральные клетки памяти - из отдельного пула предшественников [417]. Напротив Ahmed et al. показали на модели вирусной инфекции у мышей, что обе субпопуляции CD8 клеток памяти происходят из полностью дифференцированных Т-эффекторов [634]. По-видимому, важную роль в выборе пути дифференцировки играет хемокиновый рецептор CXCR3. Оказалось, что дефицит CXCR3 приводил к резкому сдвигу в сторону CD8 Тт и практически полному отсутствию короткожи-вущих CD8 -эффекторов [312, 369].
Также было показано, что полностью дифференцированные Т-эффекторы при стимуляции антигеном экспрессируют молекулы CD137 (4-1ВВ) и CD278 (ICOS) в следствие чего они обретают возможность вновь экспрессировать CD28 и активно пролиферировать [619].
Последние исследования в этой области, проведенные с одновременной оценкой 17 поверхностных клеточных маркеров (в частности, CD62L, CD45RA, CD45RO, CD27, CD43, and KLRG1) и 9 функциональных параметров, включающих 6 различных цитокинов, гранзим и перфорин, субпопуляций CD8 Т клеток человека [458], показало, что Tnaive клетки имеют фенотип (CD45RA+ CD27+ CD62L+ CCR7+), центральные CD8+ Tm (CD45RA" CD27+ CD62L+ CCR7+), эффекторные CD8+ Tm (CD45RA" CD27" CD62L" CCR7") и окончательно дифференцированные эффекторы (CD45RA+ CD27" CD62L" CD28" KLRG1+ CD57+)
Недавно была описана еще одна субпопуляция CD8 Тт резидентные эффекторы. Эти клетки описаны в барьерных тканях, слюнных железах, легких, головном мозге [338, 423]. Резидентные эффекторы вообще не рециркулируют, они экспрессируют CD103 и CD69 [556, 423]. Весьма важным представляется наблюдение, что в течение первого месяца после введения антигена все Тт являются резидентными, то есть не выходят в циркуляцию [252]. У созревающих Tm не обнаружены механизмы подобные соматической гипермутации рецепторов В-клеток. Однако у наивных Т-лимфоцитов репертуар Т-клеточных рецепторов (TCR) достаточно разнообразен [108], а контакт с антигеном в процессе первичного иммунного ответа приводит к значительным изменениям специфичности TCR у клеток памяти по сравнению с наивными клетками. Репертуар TCR CD4 клеток памяти оказался значительно более узким, по сравнению с наивными лимфоцитами [108, 428]. Кроме того, оказалось, что Тт имеют более высокоаффинные рецепторы, нежели наивные лимфоциты [92, 148, 354, 519, 539]. Самым простым объяснением этого наблюдения является преимущество в выживании лимфоцитов, несущих высокоаффинный рецептор в результате конкурентной борьбы за антиген [188, 354, 650]. Для CD8 показано, что репертуар Т-клеточных рецепторов клеток памяти практически точно совпадает с репертуаром Т-эффекторов, образовавшихся в первичном иммунном ответе [149, 571]. У CD4 созревание аффинности продолжается в течение нескольких недель [428, 660].
С возрастом увеличивается количество клеток памяти. Это увеличение связывают как с перенесенными ранее острыми инфекциями и вакцинациями, так и с наличием хронических персистирующих инфекций [213, 368]. Первоначально была высказана гипотеза, что клетки памяти поддерживаются в организме многие годы за счет небольшого количества специфического антигена, оставшегося после первичного иммунного ответа [662]. Но эта идея не подтвердилась, так как многими независимыми исследователями было доказано, что клетки памяти, как CD4 так и CD8 сохраняются годами даже в отсутствии всякого контакта со специфическим антигеном [247, 309, 382, 419, 445, 586]. Альтернативная гипотеза предполагала, что клетки памяти выживают за счет контакта с перекрестно-реагирующими антигенами хозяина [133]. Однако оказалось, что Тт утеряли способность к перекрестным реакциям. На модели переноса клеток памяти нокаутным мышам МНС"" было показано, что клетки памяти как CD4 , так и CD8 могут длительно поддерживаться [311, 450, 580]. Таким образом, было показано, что для выживания клетки памяти не нуждаются в стимуляции через TCR. Было показано, что на стадии поддержания Тт в крови обнаруживается намного больше CD62L нежели CD6210 Тт [355, 542]. Возможно, это связано с тем, что центральные Тт лучше рециркулируют, чем эффектор-ные Тт.
Для поддержания антигеннезависимой гомеостатической пролиферации Тт, как и для поддержания популяции наивных лимфоцитов, необходимо присутствие гомеостатических ци-токинов [186, 377, 595, 658]. В многочисленных опытах было показано, что для CD8 клеток памяти главным гомеостатическим цитокином является IL-15 [343, 356, 359, 377, 420, 461, 525, 544, 598, 658]. Альфа-цепь рецептора IL-15 необходима как для выживания, так и для обновления CD8 клеток памяти [147, 598, 658]. Также необходима высокая экспрессия CD122 (Р-цепь рецептора IL-2), которая одновременно является частью рецептора для IL-15 [350, 377, 598]. В то же время, IL-2 ингибирует гомеостатическую пролиферацию CD8 клеток памяти [186, 377]. Позднее было показано, что это действие опосредуется Т регуляторными клетками фенотипа CD425+ [350, 448]. A IL-7 действует синергично с IL-15, повышая экспрессию ан-тиапоптотических молекул Вс1-2 и Bcl-XL [536, 543, 578]. Долго оставалось неясным, какой ци-токин является гомеостатическим для CD4 клеток памяти. Экспрессия CD 122 на этих клетках крайне низкая [658]. Оказалось также, что CD4 клетки памяти, в противоположность CD8 , хорошо выживают у ус"" нокаутных мышей [380]. Поскольку у-цепь участвует в формировании рецепторов для IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 и IL-15, складывается впечатление, что для выживания CD4 клеток памяти эти цитокины не столь важны. Было показано, что как центральные, так и эффекторные CD4 клетки памяти синтезируют IL-21, в отличие от наивных и активированных CD4 клеток [474]. Высказано предположение, что этот цитокин может играть важную роль для поддержания CD4 клеток памяти. Однако для передачи сигнала IL-21 использует ту же у-цепь рецептора JL-2 [109], так что вопрос о поддержании CD4 клеток памяти оставался открытым. К настоящему моменту считается хорошо доказанным, что в гомеостазе CD4 Tm ведущую роль играют те же IL-7 и IL-15 [504, 578]. Сумятицу в этот вопрос вносили так называемые суррогатные или «memory phenotype» CD4 клетки. Эти клетки образуются в результате гомеостати-ческой пролиферации при лимфопении и, являясь по сути - наивными клетками, имеют поверхностные маркеры как у Тт. Условия адоптивного переноса искусственно создавали ситуацию лимфопении, такие клетки активно размножались и имитировали выживание CD4 Тт в отсутствии IL-15 [607].
Определение численности субпопуляций лимфоцитов периферической крови
Полученные результаты были подвергнуты обработке методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (M±SE). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием параметрических (t-критерий Фишера-Стьюдента) и непараметрических (U-критерий Вилкоксона) методов. Значимыми считали различия при р 0,05. Для оценки соответствия полученных результатов теоретической гипотезе использовали % -критерий. Корреляции оценивали с помощью критерия Пирсона. Расчеты проводились с использованием компьютерных программ «Statgraf», « Microsoft Office Excel 2003» и «Statistica 6.0». Анализ диагностической и прогностической значимости исследуемых параметров, а также оценку уровня пороговых значений показателей осуществляли методом характеристических кривых (receiver operator characteristic, ROC-кривых). Для количественного сопоставления рассчитывали площади под ROC-кривыми (AUC). ROC-анализ проводили с использование программы SPSS 16.0
Обычно для оценки некоего воздействия на тот или иной параметр используют парный критерий (параметрический или непараметрический). Однако эти методы позволяют оценить только два состояния - до и после воздействия [16].
Для оценки динамических изменений, когда параметры после воздействия изучаемого фактора определяют 2 и более раз, применяют метод графического дифференцирования, позволяющий оценить скорость и направление изменений изучаемых параметров [5]. При этом первая производная от исследуемой функции if соответствует скорости изменения концентрации тех или иных параметров, тогда как вторая производная, соответствующая интенсивности изменения этой скорости, характеризует также и направленность всего процесса. Отрицательные значения второй производной if") соответствуют динамике изменения параметра - повышение после воздействия и дальнейшее снижение, тогда как в случаях положительной /" исследуемый параметр сначала понижался, а затем повышался. Такой подход позволяет расклассифицировать динамические изменения параметров на два альтернативных типа для дальнейшего анализа.
Корреляционный анализ проводили методом многомерного корреляционного анализа, с помощью пакета программ Statistics Toolbox MATLAB R2014a 8.3 (http://www.mathworks.com/products/statistics/). Уровень значимости для выделения значимых корреляций составлял 0,05 (р 0,05). Сначала вычисляли корреляции по всем параметрам и наблюдениям, далее проводили внутригрупповой корреляционный анализ, выделяя значимые корреляции.
Метод главных компонент является вариантом факторного и регрессионного анализа. Анализ данных также проводили с помощью пакета программ MATLAB R2014a 8.3, пакет Statistics Toolbox, был воспроизведен РСА алгоритм. Цель такого подхода заключается в том, чтобы сформировать некоррелированные линейные комбинации наблюдаемых переменных. Первый компонент имеет максимальную дисперсию. Последовательно получаемые компоненты объясняют все меньшие доли дисперсии, и все они не коррелированны между собой. Применялся метод вращения факторов по методу квартимакс, что позволяет минимизировать число факторов, необходимых для объяснения каждой переменной. Каждая выбранная группа наиболее информативных факторов именуется главной компонентой. Таких групп, соответственно компонент, может быть несколько. Далее методом множественной регрессии рассчитываются коэффициенты для уравнения регрессии. Уровень значимости составлял 0,05 (р 0,05).
Байесовские сети (БС) традиционно применяют для моделирования процессов, характеризующихся неопределенностью из-за неполных знаний или случайных событий, что часто встречается в медицинской практике [402, 253]. БС представляет собой графическую вероятностную модель, которая представлена в виде ациклического графа, каждой вершине которого соответствует одна таблица условных вероятностей (Рисунок 2.10).
Примерный граф байесовской сети с наивной топологией Вершины графа, называемые узлами, представляют собой экспериментально наблюдаемые, скрытые или классифицируемые переменные. Узлы графа связаны стрелками, указывающими направление предполагаемой модели. Если стрелка выходит из узла, то такой узел называют родителем, а если стрелка указывает на узел, то такие узлы называют детьми. Узел, не имеющий родителей, именуется корнем, а если узел не имеет детей, то листом. При этом вероятность того или иного состояния каждого конкретного узла зависит лишь от состояния его родителей. Таблица условных вероятностей содержит вероятности наблюдений каждого конкретного узла при разных состояниях его родительских узлов. Эти вероятности могут быть заданы либо на основе мнений экспертов, либо как результат обучения БС. В процессе опроса БС определяют вероятность состояния данного узла в зависимости от данных экспериментов, содержащихся в других узлах. Конечной точкой (КТ) называют узел, которому отвечает переменная база дан 84 ных, соответствующая искомому предсказанию. Важным моментом является выбор топологии БС. В данном исследовании мы выбрали наивную топологию, при которой у всех узлов есть один общий родитель (корневой узел, он же КТ), а от него зависят все другие узлы. Данная топология наиболее проста и удобна. Она позволяет получить простое выражение для полной вероятности, минимизирует количество таблиц вероятностей, и, что особенно важно для медицины, обходится минимальным количеством данных для обучения. Построение БС осуществлялось с помощью программы NetGen (Network Generating). Для оценки способности БС к предсказанию использовали метод ROC-кривых, метод «исключения по одному». В процессе работы программы из базы данных убирался один пациент, на остальных пациентах проходило обучение БС и затем удаленный пациент тестировался на обученной БС. В завершении каждого цикла генерировалась ROC-таблица, в каждой строке которой содержался реальный исход и условная вероятность наступление такого исхода. После сортировки таблицы по величине уловной вероятности на ее основе строили ROC-кривую и рассчитывали величину AUC. Оценку качества предсказаний на основе вычисленных AUC производили с помощью программы ANN (AUC for Native Network). Одной из проблем математического моделирования является выделение подмножества переменных, имеющих критическое значение для способности верно предсказывать конечное событие и устранение несущественно или отрицательно влияющих переменных из общего множества изученных параметров. В результате такой оптимизации БС из всего множества узлов-листьев выбирается минимальное количество, способное давать максимальную вероятность правильного предсказания КТ. Оптимизацию БС проводили на основании расчета AUC с помощью программы SiLVIA (Simple Learn Variable Influence Analyzer).
Клинико-лабораторное обследование состояния здоровья прививаемых детей Раздел выполнен самостоятельно. Все дети удовлетворяли критериям включения-исключения в исследование. При осмотре детей педиатром не отмечалось признаков патологии. Оценка состояния здоровья при визитах к врачу проводилась по следующим критериям: температура тела, наличие высыпаний на коже, состояние слизистых зева, наличие ринореи, кашля, увеличения лимфатических узлов, результаты аускультации (дыхание и сердцебиение) и пальпации живота. Состояние здоровья оценивалось по бальной системе, согласно рекомендациям GCP. Здоровые дети имели оценку в 6 баллов, за наличие каких-либо симптомов начислялись дополнительные баллы в зависимости от степени выраженности симптомов (см. Приложение 2). При первом визите состояние здоровья детей оценивалось в 6,07 ± 0,035 баллов, на момент прививки также 6,07 ± 0,035, на второй визит 6,06 ± 0,03 и на третий визит - 6,0 баллов. Дополнительные баллы были начислены 7 детям с остаточными явлениями атопического дерматита. Полученные в результате лабораторного обследования показатели подсчета формулы крови на гематологическом анализаторе, и показатели общего анализа мочи на мочевом анализаторе находились в пределах возрастных норм. Все обследованные дети были разбиты на 2 группы по таким критериям как наличие в анамнезе простудных заболеваний и соответствие показателей исходного иммунного статуса возрастной норме.
Группу здоровых детей составили 48 человек, которые за свои 1-1,5 года жизни ни разу не болели и имели показатели иммунного статуса, соответствующие возрастной норме. Эти дети были включены в группу 1. Все остальные (48 человек) были отнесены к группе с условным названием «иммунокомпрометированные дети». У всех этих детей прошлом отмечались 2-3 эпизода простудных заболеваний, а также у большинства из них наблюдалось снижение показателей иммунного статуса. Строго говоря, этих детей нельзя было идентифицировать как часто и длительно болеющих, так как этот термин относится к детям более старшего возраста, да и количество эпизодов простудных заболеваний было небольшим. Следует отметить, что это были единственные дети из семей с материальным достатком, позволяющим обеспечить детей всем необходимым, проживающих в отдельных квартирах, привозящих детей на обследование на собственных автомобилях, то есть контакт с инфекционными носителями был максимально исключен. Родители были достаточно образованными людьми, нацеленными сделать все для здоровья своих детей. При таких условиях ребенок первого года жизни вообще не должен болеть. Необходимо также помнить, что на первые годы жизни приходится период интенсивного формирования и созревания иммунной системы. Эти процессы, естественно, идут с неодинаковой скоростью у разных детей, что обусловлено комбинацией генетических особенностей и факторов окружающей среды, создающей неповторимые варианты в каждом конкретном случае. На данный момент трудно сказать, то ли дети, отнесенные в данную группу, изначально немного отставали по скорости созревания иммунной системы от своих сверстников из первой группы, то ли перенесенные респираторные заболевания, пусть даже их было не очень много, но наложили негативный отпечаток на эти процессы. Мы отдаем себе отчет, что термин иммуноком-прометированный подразумевает куда более тяжелые заболевания и состояния, но и совсем здоровыми их тоже нельзя было назвать. Мы предполагали, что у этих детей возможны особенности формирования поствакцинального иммунитета. «Иммунокомпрометированные» дети были рандомизированно поделены на две группы. Группу 2 составили 26 «иммунокомпрометиро-ванных» детей. В дальнейшем эти дети, как и дети из группы 1, получали вакцину Приорикс однократно подкожно 0,5 мл. Двадцать два «иммунокомпрометированных» ребенка были отнесены в группу 3. Эти дети одновременно с вакцинацией Приорикс по той же схеме, получали иммунокорректор полиоксидоний 3 мг однократно. Средние показатели иммунного статуса до вакцинации, характерные для группы здоровых детей (группа 1) и группы «иммунокомпрометированных» детей (группы 2 и 3), представлены на Рисунке 3.1. На рисунке видно, что по всем исследованным параметрам клеточного иммунитета выделенные группы отличаются друг от друга с высокой степенью значимости (р 0,005). Тем не менее, значения средних не выходят за пределы возрастных норм (в качестве последних были использованы показатели для детей исследуемого возраста, наработанные в лаборатории по изучению клеточных и молекулярных основ иммунитета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (зав. д.м.н., профессор М.С. Бля-хер)). Однако при анализе показателей иммунного статуса каждого ребенка из первой группы, все параметры укладывались в пределы возрастной нормы, а в группе «иммунокомпрометированных» детей те или иные параметры оказывались ниже возрастных норм.
Экспрессия поверхностных маркеров CD46 и CD, являющихся рецепторами для вирусов кори
Преобладающим субклассом специфических IgG у непривитых больных разного возраста в активной фазе заболевания оказался IgG3, IgGl представлены в меньшем проценте; специфические антитела IgG2 и IgG4 субклассов отсутствовали. У пациентов в стадии реконвалесцен-ции противокоревой иммунный ответ был представлен всеми субклассами IgG в соотношении 26,9%) -IgGl, 36,9% -IgG2, 29,l%o-IgG3 и 7,l% -IgG4. В сыворотках взрослых (группы больных с вакцинацией в анамнезе, здоровых вакцинированных и здоровых переболевших) преобладали специфические антитела субкласса IgGl, которые составили 80,7%, 69,8% и 41,3% от всего количества противокоревых IgG, соответственно. Показатели содержания IgG3 субкласса в этих трех группах практически не различались - 15,1%, 17,3% и 17,6%, соответственно. Уровень антител IgG4 субкласса был незначительным, однако у переболевших ранее он в 1,8 раза превышала среднее значение в группе здоровых привитых. Существенные различия в концентрации специфических антител субкласса IgG2 были выявлены в перечисленных группах взрослых: минимальный уровень отмечен у привитых больных, выше у привитых здоровых, и максимальный у взрослых, переболевших ранее. Различия в спектре субклассов специфических антител у не привитых взрослых пациентов в активной фазе заболевания, отвечающих на инфекцию первичным иммунным ответом, и у привитых взрослых пациентов также в активной фазе заболевания, но отвечающих на инфекцию вторичным иммунным ответом, оказались высоко достоверными.
При анализе динамики показателей содержания антител разных классов и субклассов в активной фазе заболевания по сравнению со стадией реконвалесценции (13 парных сывороток, полученных на 5 и 14 день после появления сыпи), показали, что количество специфических IgM-антител увеличилось незначительно. Уровень противокоревых IgA снизился, а концентрация IgG статистически значимо увеличилась; прирост специфических IgG-антител осуществлялся как за счет IgGl-, так и за счет IgG3-субкласса. При этом на ранних сроках преобладали антитела субкласса IgG3, значимо превосходя показатель IgGl-субкласса, а на позднем сроке преимущество явно осталось за антителами субкласса IgGl. Антитела субклассов IgG2 и IgG4 у данных пациентов выявлены не были.
Для разграничения первичного и вторичного гуморального ответа на вирус кори у больных этой инфекцией получены значения cut-off для IgGl-субкласса - 48,06%, а для IgG3-субкласса - 40,9%. Количество противокоревых антител IgGl-субкласса ниже 48,06% и количество антител IgG3-субкласса больше 40,9% позволяет с вероятностью более 99% оценить гу 169 моральный иммунный ответ обследуемого человека как первичный; соответственно количество противокоревых антител IgGl-субкласса выше 48,06%, а количество антител IgG3-субкласса ниже 40,9% характеризует иммунный ответ как вторичный. При вычислении cut-off для общего количества противокоревых IgG-антител у больных оказалось, что при общем количестве специфических IgG выше 11,583 Ме/мл с вероятностью более 99% иммунный ответ соответствует вторичному типу.
При оценке антиген-индуцированного пролиферативного ответа установлено, что лимфоциты впервые привитых детей до вакцинации не отвечали пролиферативной реакцией на добавление в культуру антигенов вирусов кори или краснухи; через неделю после вакцинации также не отмечалось пролиферации в ответ на внесение антигенов; хорошо выраженная пролиферация получена через 6 недель после вакцинации. Перед ревакцинацией (через 5-6 лет после первичной вакцинации) исходно отмечалась отчетливая пролиферация на оба антигена, уровень которой был значимо ниже уровня впервые привитых детей через 6 недель после вакцинации. Через неделю после ревакцинации обнаружено значимое снижение, по сравнению с исходным, пролиферативного ответа как на антигены вируса кори и вируса краснухи; и через 6 недель после ревакцинации выявлено значимое, по сравнению с исходным, повышение уровня пролиферации на оба применявшихся антигена. При проведении ROC-анализа для оценки специфичности и чувствительности этого метода установлено, что для впервые привитых уровень cut-off на антигены краснухи составил 12,5%. В группе ревакцинированных cut-off на антигены кори составил 14%, а для антигенов вирусов краснухи cut-off оказался равен 13,5%. При оценке специфически индуцированной пролиферации лимфоцитов на антигены вирусов кори и краснухи независимо от прививочного анамнеза cut-off для антигенов кори составил 12%, а для антигенов краснухи - 12,5%.
При оценке спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов in vitro лимфоцитами периферической крови привитых детей отмечено, что через 1 неделю после вакцинации выявлен подъем продукции IL-1 и снижение IL-2, IL-4 и IL-12. Спонтанная продукция IL-10, TNF-a и IFN-y повышается на 7-ой день после вакцинации, а индуцированная - падает через 1 неделю и повышается через 6 недель после прививки. В группе ревакцинированных детей также наблюдался подъем спонтанной и индуцированной продукции IL -1 и IL -4; спонтанная продукция TNF-a и IFN-y повышалась через 1 неделю и оставалась повышенной через 6 недель после ревакцинации. При оценке антиген-индуцированной продукции цитокинов in vitro лимфоцитами периферической крови привитых детей установлено, что у впервые привитых детей добавление антигенов вирусов кори или краснухи не вызывали значимого синтеза цитокинов ни до вакцинации, ни через 1 неделю после нее; через 6 недель отмечалось значимое повышение продукции IL-4, TNF-a и IFN-y в ответ на антигены вирусов кори, а для краснухи - только IFN-y. В группе ревакцинированных детей антиген-индуцированный синтез цитокинов отмечался еще до ревакцинации, что свидетельствует в пользу присутствия в организме раннее привитых детей антигенспецифичеких Т-клеток памяти. Через 1 неделю, а тем более через 6 недель после ревакцинации синтез цитокинов в ответ на антигены вирусов кори и краснухи усиливался в несколько раз. Уровень продукции цитокинов лимфоцитами периферической крови при стимуляции антигенами вирусов кори и краснухи у впервые привитых и ревакцинированных детей различались на порядок, и в группе ревакцинированных детей спектр цитокинов, отвечающих на вирусные антигены, был значительно шире, чем у впервые привитых; это свидетельствует в пользу синтеза цитокинов именно антигенспецифическими Т-клетками памяти.
При оценке специфически индуцированной дегрануляции цитотоксических клеток у впервые привитых и ревакцинированных детей отмечено, что спонтанный уровень дегрануляции CD8 lg лимфоцитов во всех группах детей не превышал 1%. Антиген-индуцированная деграну-ляция CD8 lg клеток у впервые привитых детей как до вакцинации, так и через неделю после нее не отличалась от спонтанного уровня; через 6 недель после вакцинации было обнаружено значимое повышение количества дегранулировавших CD8 lg лимфоцитов как при добавлении антигенов вируса кори и вируса краснухи. Перед ревакцинацией уровень специфической дегрануляции CD8 lg клеток был значимо ниже, чем у первично привитых детей через 6 недель после прививки. Через 7 дней после ревакцинации обнаружено статистически значимое повышение процента дегранулировавших CD8 lg клеток как в ответ на антигены вируса кори и краснухи, через 6 недель после ревакцинации выявлена тенденция к снижению дегрануляции. В группе давно переболевших корью и краснухой взрослых обнаружено значимое количество CD8 lg клеток, отвечающих дегрануляцией на добавление в культуру лимфоцитов антигенов кори или краснухи. Для оценки специфичности и чувствительности метода специфической дегрануляции CD8 lg клеток на антигены вирусов кори или краснухи был проведен ROC-анализ полученных данных; по результатам теста дегрануляции CD8 lg клеток на антигены вирусов кори или краснухи можно с вероятностью 98,2% для антигенов кори и 99,7% для антигенов краснухи прогнозировать наличие специфического клеточного иммунного ответа на антигены указанных вирусов при превышении процента дегрануляции 2,005% при стимуляции антигенами вирусов кори и 1,77% для вирусов краснухи.
Оценка антиген-индуцированной продукции цитокинов in vitro лимфоцитами периферической крови привитых детей
Одной из проблем современной вакцинопрофилактики является наиболее точное прогнозирование результата вакцинации. В качестве положительных результатов следует рассматривать как формирование защитных уровней специфических антител через 1-2 месяца после прививки, так и длительное поддержание этих защитных уровней антител максимально долго, или хотя бы до срока ревакцинации. Декретируемые сроки ревакцинации являются средними, возможно для лиц, склонных быстро терять защитные уровни антител, необходимо обоснование индивидуальных сроков и количества ревакцинаций.
Бурное развитие иммунологии и лабораторных технологий привели к накоплению огромных массивов данных. Лабораторная служба может измерить огромное количество параметров иммунитета, однако остается неясным, какие именно параметры наиболее тесно связаны с интересующими нас результатами. Иммунная система работает по принципу сетей, поэтому изменение какого-то одного параметра приводит к изменению многих других. Учитывая тот факт, что иммунная система отвечает на введение антигенов вакцины не отдельными звеньями, а как целостная система, возникают множественные каскады изменений параметров иммунитета, на которые накладываются генетические особенности и воздействие факторов окружающей среды. Не вызывает сомнений, что состояние иммунной системы на момент вакцинации, а следовательно, измеренные параметры иммунного статуса могут как-то влиять на результат вакцинации, но реальных зависимостей ранее обнаружено не было. В таких условиях перспективно применение современных методов математического моделирования, которые позволяют проводить содержательный анализ огромных объемов изучаемых параметров и выделить наиболее информативные из них.
Исходя из концепции о связи различных параметров иммунной системы с результатами вакцинации, на первом этапе наших исследований в качестве потенциальных маркеров-предикторов результативности прививки Приорикс были выбраны параметры, входящие в классический иммунный статус (количество лейкоцитов и лимфоцитов, абсолютные и относительные количества субпопуляций CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3"CD19+ CD3"CD16/56+, и общее количество IgM, IgG и IgA), а также содержание в сыворотке трех наиболее часто исследуемых цитокинов-маркеров ТЫ- и Тп2-типа иммунного ответа IFN-y, IL-4 и провоспалитель-ного цитокина TNF-a. Всего было проанализировано 19 параметров до вакцинации, через 1 неделю и через 4 недели после прививки. Для оценки результата вакцинации были использованы данные о количестве специфических сывороточных антител против антигенов вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита класса IgG и субклассов специфических антител: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, измеренные через 4 недели и через 1 год после вакцинации. Для успешного прогнозирования результатов вакцинации через 4 недели после прививки с помощью байесовских сетей были выделены 7 предикторов для вирусов краснухи: [IFN-y], [CD3 ], [лимфоциты0/ ], [CD19+%], [TNF-a], [IgM] и [IL-4] и 7 предикторов для вирусов эпидемического паротита: [IFN-y], [CD3+], [лимфоциты], [CD19+%], [CD3+CD8+%], [CD3+CD4+%] и [CD3+%]. Интересно, что часть параметров повторяется, в частности [IFN-y], [CD3 ], [лимфоциты], [CD 19 %], другие различаются для разных вирусов. Для прогнозирования результатов вакцинации к антигенам вирусов кори через 4 недели после прививки наиболее информативными оказались 4 параметра иммунного статуса: [CD3+CD4+], [CD3"CD16/56+], [IgA] и [IL-4]. Используя байесовскую сеть, по значениям этих параметров до вакцинации можно рассчитать вероятность формирования у конкретного ребенка защитных уровней антител к каждому из вирусов через 4 недели после прививки. Предложенный способ оценки эффективности прививки продемонстрировал высокое качество прогнозирования на независимой выборке привитых (р 0,05). При внимательном анализе анамнестических данных 3-х детей, у которых был предсказан защитный уровень антител к антигенам вируса эпидемического паротита, а в реальности таковым не оказался, выяснилось, что все три ребенка имели диагноз атопический дерматит в стадии ремиссии. Для всех трех детей был характерен высокий уровень общего IgE в крови (более 300 Me/мл). Можно полагать, что БС правильно предсказала высокий синтез антител, только в виду наличия сопутствующего аллергического заболевания этот активный синтез касался уже имевшейся продукции аллергических IgE антител, а не защитных антител на прививку. Ввиду малого количества наблюдений это, всего лишь, предположение, однако интересно в будущем детально исследовать эту проблему.
Используя метод прогнозирования с помощью БС, было проведено сопоставление результатов прогноза и реального количества специфических антител в группе «иммунокомпромети-рованных» детей, привитых одновременно с полиоксидонием. Результат оказался статистически значимым, тем не менее, было выявлено 3 ребенка, у которых прогноз не подтвердился для двух из трех вирусов вакцины. Так у пациента № 7 дважды прогноз не совпал с реальностью (антитела к вирусу краснухи оказались выше прогноза, а к вирусу эпидемического паротита -ниже). Также дважды прогноз не совпал у пациента № 14 (антитела к вирусу кори оказались ниже прогноза, а к вирусу краснухи - выше). С определенной натяжкой, у пациента № 2 тоже выявлено 2 несовпадения (антитела к вирусу кори оказались ниже спрогнозированных и антитела к вирусу эпидемического паротита отсутствовали), что было менее вероятным исходом (30%), спрогнозированным для него. Из анамнеза ребенка № 2 известно, что ему на первом году жизни был поставлен диагноз тимомегалия (?). На момент обращения в прививочный кабинет ребенку было 3 года, и диагноз был снят. Предварительно проведенное нами дополнительное обследование (УЗИ тимуса) никакой патологии не выявило, параметры иммунного статуса у ребенка были на нижней границе возрастной нормы, из анамнеза было известно, что ребенок перенес 3 ОРВИ, на основании чего ребенок был отнесен в группу «иммунокомпрометирован-ные» дети. Тем не менее, результаты вакцинации оказались удовлетворительными только для вируса краснухи. Антител к вирусам кори и эпидемического паротита у данного ребенка не было обнаружено ни через год, ни через 5 лет, ни после ревакцинации, что свидетельствует в пользу наличия у данного ребенка некой частичной недостаточности иммунной системы. Не исключено, что у двух других детей с неудачами прогнозирования тоже имелась какая-то скрытая недостаточность иммунной системы, которую, несмотря на тщательное иммунологическое обследование, нам выявить не удалось.
Предложенный метод оценки эффективности прививки позволяет еще до вакцинации из общего контингента привитых выделить когорту лиц, попадающих в группу риска, то есть угрожаемых по отсутствию защитных уровней специфических антител через месяц после прививки (первичные вакцинальные неудачи). Таких людей, по статистике 5-10%.
На следующем этапе мы предприняли попытку оценить, насколько хорошо сохраняются защитные уровни антител в крови через год после прививки. Для этого раздела наиболее успешным оказался корреляционный анализ. Было выявлено 3 предиктора для вирусов эпидемического паротита: [IL-4], [TNF-a] и [IgA], а для вируса кори 2 предиктора: [IL-4] и [лимфоциты]. Для вирусов краснухи таких предикторов выявлено не было, так как ни один из наблюдаемых нами детей не потерял защитного уровня антител к краснухе через год после прививки. Для каждого из предикторов был определен пороговый критерий cut off так, что если значения указанных параметров до вакцинации у конкретного ребенка окажутся ниже cut off, то такой ребенок, вероятнее всего, утеряет защитные уровни антител к конкретному вирусу через год после вакцинации (вторичная вакцинальная неудача). Если же значения параметров окажутся выше cut off, то защитные уровни антител данного ребенка сохраняться через 1 год после прививки. Предложенный метод позволяет еще до прививки выделить когорту лиц (группу риска), угрожаемых по быстрому снижению уровней антител в крови ниже защитного. Такие люди составляют примерно 10% от общего количества привитых.
