Введение к работе
Актуальность темы. Статистические данные с каждым годом констатируют увеличение числа вновь диагностируемых случаев рака молочной железы (РМЖ) в России, как н в большинстве стран Европы и Северной Америки (В.Г.Иванов, 2004; М.И.Давыдов и соавт., 2007). В структуре онкологической заболеваемости России и многих стран запада раку этой локализации принадлежит 1-е место с 1985 г. (Kris M.G. et al., 2011).
Этиология РМЖ, как и большинства опухолей, не известна, патогенез изучен не до конца. Поэтому любые исследования в этой области представляют интерес, прежде всего для практических онкологов, расширяют наши представления о патогенетических механизмах в развитии заболевания и выявляют новые мишени для таргетной терапии РМЖ (М.И.Давыдов и соавт., 2010; Isakoff S.J. et al., 2011).
Одним из фундаментальных свойств злокачественных опухолей, в том числе и РМЖ, считается их способность к инвазии в окружающие ткани и метастазирование в отдаленные органы (Е.С.Герштейн и соавт., 2007; Chabner В.А. et al., 2011). При этом, важным механизмом этих процессов является разрушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса ассоциированными с опухолью протеазами (Е.В.Кллшо и соавт., 2003; Е.С.Герштейн и соавт., 20046). Известно, что в инвазии и метастазировании задействовано несколько іспассов протеаз, важными из которых является мультигенное семейство матриксных металлопротеиназ (ММП), названных так за свою способность специфически гидролизовать все основные белки внеклеточного матрикса, в первую очередь, коллаген (Н.Е.Кушлинский и соавт., 2010; Deryugina E.I. et al., 2006).
Семейство ММП состоит из более 20 секретируемых или связанных с поверхностью клетки цинк-зависимых эндопептндаз, субстратами которых помимо большинства компонентов внеклеточного матрикса могут быть также другие протеазы, хемотаксическне молекулы, латентные формы факторов роста, растворимые и мембранно-ассоцнированные белки, связывающие факторы роста (Westermarck J. et al., 1999; Nelson A.R. e al., 2000). При этом, активность ММП в межклеточном пространстве специфически подавляется тканевыми ингибиторами (ТИМП) (Ramnath N. et al., 2004). Показано, что активация ММП в опухолях происходит по паракринному механизму с участием факторов роста и цнтокннов,
секретируемых инфильтрирующими опухоль макрофагами и лимфоцитами, а также клетками опухолевой стромы (WestermaTck J. et а\., 1999).
В связи с этим различные ММП и ТИМП рассматриваю в качестве возможных биологических маркеров прогноза и лекарственной чувствительности злокачественных опухолей, в том числе и РМЖ, а использование природных и синтетических ингибиторов ММП считается перспективным подходом к лекарственной терапии опухолей, мало чувствительных к классическим противоопухолевым препаратам (Watson S.A. et al., 1999; Yonemura Y. et al., 2001; Sounni N.E. et al., 2003; Sivula A. et al., 2005).
Во многих экспериментальных исследованиях доказана корреляционная взаимосвязь между повышением экспрессии ММП опухолевыми и/или стромальными клетками с метастазированием и ангиогенезом (Nelson A.R. et al., 2000; Deryugina ЕЛ. et al., 2010), при этом ключевым активатором неоангиогенеза считают фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) (Н.В.Жуков и соавт., 2008; Fox S. et al., 2007). С одной стороны, коллагеназы индуцируют секрецию VEGF опухолевыми клетками (Zhang A. et al., 2006), а, с другой, секретируемый опухолью VEGF регулирует экспрессию коллагеназ в строме, влияя на инвазивную способность первичной опухоли (Belotti D. et al., 2008). В последние годы интерес у исследователей вызывают растворимые формы рецепторов VEGF (VEGFR-1, VEGFR-2), клиническая значимость которых до настоящего времени не изучена.
Поэтому одновременный анализ содержания ММП-2, ММП-9 и VEGFR-2 в опухоли и сыворотке крови больных РМЖ является своевременным и актуальным. Цель исследования - сравнительный анализ перспектив клинического исследования содержания некоторых представителей семейства матриксных металлопротеиназ (ММП-2 и ММП-9), рецептора фактора роста эндотелия сосудов 2 типа (VEGFR-2) в сыворотке крови, опухоли и гистологически неизмененной ткани молочной железы больных РМЖ, взаимосвязь этих маркеров с экспрессией РЭ, РП, Her-2/neu в опухоли, основными морфологическими особенностями и клиническим течением заболевания.
Задачи исследования. 1. Иммуноферментными методами определить содержание ММП-2 и ММП-9 в
опухолях, гистологически неизмененной ткани молочной железы и сыворотке
крови больных РМЖ.
-
Исследовать уровни VEGFR-2 в сыворотке крови больных РМЖ.
-
Проанализировать соотношение концентрации ММП-2, ММП-9 в сыворотке крови с уровнем их экспрессии в первичной опухоли, а также с содержанием сывороточного VEGFR-2.
-
Изучить взаимосвязь уровня изучаемых маркеров в опухолях и сыворотке крови с основными клинико-морфологическими особенностями РМЖ (стадией процесса, гистологическим строением опухоли и степенью ее дифференцировки, репродуктивным статусом пациенток).
-
Провести анализ ММП-2, ММП-9 в опухоли, неизмененной ткани и сыворотке крови больных РМЖ с учетом рецепторного фенотипа первичной опухоли (РЭ, РП, Her-2/neu) и оцепить их связь с клиническими и морфологическими характеристиками опухоли.
-
Изучить возможность комплексного использования клинических, морфологических и биохимических факторов в оценке клинического течения заболевания, инвазивного и метастатического потенциала РМЖ.
Научная новизна
Впервые в отечественной практике на большом клиническом материале проведено одновременное сравнительное иммуноферментное определение содержания нескольких биохимических маркеров (ММП-2, ММП-9, РЭ, РП, Нег-2/neu) в опухоли, неизмененной ткани молочной железы, а (ММП-2, ММП-9, VEGFR-2) в сыворотке крови больных РМЖ с учетом их связи с основными клинико-морфологическими характеристиками опухоли и их клиническим течением.
Показано, что в преобладающем числе опухолей (87,3%) больных РМЖ обнаружено достоверно высокое содержание ММП-2 по сравнению с гистологически неизмененной тканью (медианы соответственно 38,9 и 13,0 нг/мг белка). При этом, концентрации ММП-2 в сыворотке крови до и после лечения не различались (соответственно 240 до 260 нг/мл).
У 51,7% больных РМЖ выявлено достоверное увеличение уровней ММП-9 в опухоли по сравнению с неизмененной тканью (медианы соответственно 10,7 и 0,7 нг/мг белка), а также в сыворотке крови у 86,2% пациенток после лечения (медианы соответственно 208 до 284 нг/мл).
Установлена достоверная корреляционная зависимость между концентрациями ММП в сыворотке крови больных РМЖ до и после лечения (для ММП-2 - г=0,42; р=0,001; для ММП-9 - г=0,44; р=0,0001).
Медианы содержания ММП-2 в неизмененной ткани молочной железы были достоверно выше при неблагоприятных факторах РМЖ: критерии Т4, низкой степени дифференцировки опухоли, при Her-2/neu(+) и РЭ(-) опухолях, в репродуктивном возрасте. Многофакторный анализ подтвердил высоко достоверную связь показателей ММП-2 в неизмененной ткани молочной железы с репродуктивным статусом (р=0,001) и критерием Т (р=0,04).
Обнаружено, что показатели ММП-2 в опухоли больных РМЖ не были связаны с основными клинико-морфологическими факторами РМЖ. При этом, медианы ММП-2 в сыворотке крови больных РМЖ до лечения были достоверно выше при наличии множественных метастазов и недостоверно высокими при Ша-Шс стадиях, в Her-2/neu(+), РЭ(-) и РП(-) опухолях, а также в постменопаузе и при наличии опухолевых эмболов в просвете кровеносных сосудов первичной опухоли. Многофакторный анализ показал, что уровни ММП-2 в сыворотке крови больных достоверно связаны с критерием N.
Многофакторный анализ выявил, что показатели ММП-9 в неизмененной ткани молочной железы больных РМЖ не связаны с основными клинико-морфологическими факторами заболевания. При этом, уровни маркера в опухоли были выше при lib и Шс стадиях и при наличии множественных регионарных метастазов. Исходные значения ММП-9 в сыворотке крови больных РМЖ были достоверно выше при высокой и умеренной степени дифференцировки опухоли, небольших ее размерах, а многофакторный анализ выявил достоверную связь уровней ММП-9 в сыворотке крови со степенью дифференцировки РМЖ.
Обнаружено, что показатели VEGFR-2 достоверно выше в сыворотке крови больных РМЖ с РЭ" и РП" опухолями, не связаны с экспрессией рецепторов Нег-2/neu, достоверно повышались в репродуктивном возрасте, при увеличении критериев N, Т и при наличии опухолевых эмболов в просвете кровеносных сосудов, при низкой степени дифференцировки опухоли и в группе пациенток с благоприятном прогнозом заболевания. Показано, что при неблагоприятных клинико-морфологических факторах (ШЬ-Шс стадии, низкая степень дифференцировки опухоли) высоким значениям ММП-2 и ММП-9 в сыворотке крови больных РМЖ соответствовали низкие показатели сывороточного VEGFR-2.
Практическая значимость
Высокие показатели ММП-2 в неизмененной ткани молочной железы следует считать неблагоприятным фактором у больных РМЖ и связаны они с критерием Т4, низкой степенью дифференцировки опухоли, Her-2/neu+ и РЭ' опухолями и репродуктивным периодом.
Высокие значения ММП-9 в опухоли больных РМЖ следует считать неблагоприятным прогностическим фактором. При этом, медиана содержания ММП-9 в опухоли больных с неблагоприятными прогностическими факторами составила 17,8 нг/мг белка, а при благоприятном и промежуточном прогнозе соответственно 3,0 и 2,2 нг/мг белка.
Повышенные показатели ММП-9 в сыворотке крови больных РМЖ следует считать благоприятным фактором РМЖ, при этом медиана сывороточного ММП-9 достоверно выше у пациенток с благоприятным и промежуточным прогнозом, чем с неблагоприятным.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Достоверно высокое содержание ММП-2 и ММП-9 выявлено в опухолях больных РМЖ по сравнению с гистологически неизмененной тканью, при этом, концентрации ММП-2 в сыворотке крови до и после лечения не различались, а ММП-9 достоверно увеличивались у 86,2% пациенток после терапии.
-
Высокие показатели ММП-2 в неизмененной ткани молочной железы следует считать неблагоприятным фактором у больных РМЖ и связаны они с критерием Т4, низкой степенью дифференцировки опухоли, Her-2/neu+ и РЭ" опухолями и репродуктивным периодом.
-
Не отмечено тесной связи показателе ММП-2 и ММП-9 в опухоли больных РМЖ с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания, однако уровни ММП-2 в сыворотке крови этих пациенток достоверно зависели от критерия N, а ММП-9 - от степени дифференцировки опухоли.
-
Высокие значения ММП-9 в опухоли больных РМЖ следует считать неблагоприятным прогностическим фактором, при этом, медиана ММП-9 в опухоли пациенток с неблагоприятным прогнозом составила 17,8 нг/мг белка, а при благоприятном и промежуточном прогнозе 3,0 и 2,2 нг/мг белка соответственно.
-
Высокие уровни ММП-9 в сыворотке крови больных РМЖ следует считать благоприятным фактором, а медиана сывороточного ММП-9 достоверно ниже в
группе больных с неблагоприятным, чем с благоприятным и промежуточным прогнозом.
-
Показатели VEGFR-2 достоверно выше в сыворотке крови больных РМЖ с РЭ' и РП" опухолями, не связаны с экспрессией рецепторов Her-2/neu, достоверно повышались в репродуктивном периоде, при увеличении критериев N и Т, при наличии опухолевых эмболов в просвете кровеносных сосудов, при низкой степени дифференцировки опухоли, достоверно снижались с увеличением возраста и при благоприятном прогнозе заболевания.
-
При неблагоприятных клинико-морфологических факторах (IIIb-Шс стадии, низкая степень дифференцировки опухоли) высоким значениям ММП-2 и ММП-9 в сыворотке крови больных РМЖ соответствовали низкие показатели сывороточного VEGFR-2.
Апробация работы Основные результаты диссертации доложены на: Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 1-3 октября 2008г.); научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 28-30 сентября 2009г.); Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва 10-11 ноября 2009г.); XVII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 12-16 апреля 2010г.); конференции «Национальные дни лабораторной медицины России - 2010» (Москва, 5-7 октября 2010г.); XVIII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 11-15 апреля 2011г.);
Материалы диссертации доложены на совместной научной конференции сотрудников кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики МГМСУ, лаборатории клинической биохимии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 25 февраля 2011г.
Публикации результатов исследования По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, 5 из них в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, включает введение, обзор данных литературы, главу «Материалы и методы исследования», главу «Результаты собственных наблюдений», обсуждение полученных данных,
