Содержание к диссертации
Введение
1. Свойства НАД-зависимых гидрогеназ 7
1.1.Общая характеристика ферментов класса гидрогеназ(КФ I.I2) 7
1.2. Представления о механизме каталитического действия гидрогеназ 13
1.3.Исследования по стабильности и кинетике действия гидрогеназ 15
1.4.Общая характеристика НАД-зависимых гидрогеназ (КФ 1.12.1.2) 18
1.5.Схемы выделения высокоочищенных НАД-зависимых гидрогеназ,стабильность ферментов представления D механизме активации 21
1.6.Кинетические свойства НАД-зависимых гидрогеназ 26
1.7. Пути возможного практического использования НАД-зависимых гидрогеназ 29
2. Особенности поведения диссоциирующих ферментных систем 33
2.1.Зависимость удельной ферментативной активности от концентрации фермента для равновесия типа 2М^Д 35
2.2.Кинетика диссоциации/ассоциации ферментов вы зываемая изменением условий 41
2.3. Дивсоциирующие ферментные системы типа мономера димер =^тетрамер(для случая актрівного тетрамера) 47
3.Материалы и методы 50
3.1.Материалы 50
3.2.Методы 51
4. Очистка гидрогеназы водородокисляющих бактерий А .иЖьсиіиіь -І до гомогенного состояния мето дом гидрофобной хроматографии 60
4.1.Методика очистки 60
4.2.Спектральные характеристики гомогенной гидрогеназы 68
4.3.Определение молекулярного веса НАД-зависимой гидрогеназы из А.^<ЛуЛ«і -1 71
4.4. Субъединичиый состав НАД-зависимой гидро геназы 77
5. Определение равновесной и кинетических констант процесса диссоциации гидрогеназы 78
6.Инактивация гидрогеназы под действием моче вины 89
7. Кинетические свойства НАД-зависимой гидрогеназы, проявляемые при катализе НАДН-дегидрогеназной реакции 99
7.1.Кинетические параметры НАДН-дегидрогеназной реакции 99
7.2.Кинетический метод альтернативных субст ратов 104
7.3.Ингибирование НАДН-дегидрогеназной активности субстратами,продуктами и аналогом продукта 110
8. Формальная кинетика реакции восстановления НАД водородом 116
Выводы 126
- Представления о механизме каталитического действия гидрогеназ
- Пути возможного практического использования НАД-зависимых гидрогеназ
- Дивсоциирующие ферментные системы типа мономера димер =^тетрамер(для случая актрівного тетрамера)
- Субъединичиый состав НАД-зависимой гидро геназы
Введение к работе
В последнее время в энзимологии все большее внимание уделяется изучению структуры и механизма действия гидрогеназ ферментов, катализирующих реакцию поглощения или выделения молекулярного водорода. Повышенный интерес к данной группе ферментов во многом обусловлен перспективой их применения в различных областях биотехнологии, в частности, в системах биоконверсии энергии и в тонком органическом синтезе в электрохимических преобразователях энергии(топливных элементах), системах биофотолиза воды, для синтеза органических соединений из СОр и водорода.
Гидрогеназы широко распространены в природе. Особое место среди ферментов данной группы занимают растворимые гидрогеназы водородокисляющих бактерий. В отличие от остальных ферментов данной группы они характеризуются высокой стабильностью к действию кислорода воздуха, а также широкой субстратной специфичностью по отношению к акцептору электронов. Физиологическим субстратом этих гидрогеназ является (НАД),что открывает дополнительные возможности применения гидрогеназ водородокисляющих бактерий в биотехнологии для создания крупномасштабных систем регенерации кофактора.
Наряду с возможностью практического применения НАД-зависимые гидрогеназы представляют интерес с точки зрения теоретической энзимологии, поскольку их отличает сложная четвертичная структура ,наличие нескольких видов простатических групп и способность проявлять несколько типов каталитической активности с широким спектром субстратов. Гидрогеназы водородокисляющих бактерий могут являться удобными модельными объектами для исследования подходов к выяснению механизмов действия и стабилизации подобного рода сложных ферментных структур. Наличие внутримолекулярной электрон-транспортной цепи позволяет считать их моделью полиферментных систем, объединенных в одном олигомерном ферменте.
Решение важных практических задач, связанных с возможным использованием НАД-зависимых гидрогеназ, в частности, создание технологического катализатора на основе гидрогеназы, невозможно без всестороннего исследования ее физико-химических свойств и механизма действия.
Разработанные к настоящему времени методы выделения препаратов гомогенных гидрогеназ представляют собой трудоемкие процессы, приводящие к низким выходам активного фермента.
В литературе полностью отсутствуют сведения о влиянии четвертичной структуры НАД-зависимой гидрогеназы на ее стабильность, не проводилось систематического изучения ее кинетических свойств.
Представления о механизме каталитического действия гидрогеназ
Соединения,образующие комплексы с кластерным нелезом -МО, сЛ, 4, -дипиридил;о-фенантролин - а также реагенты,модифицирующие $Н-группы(иодацетат,л-хлормеркурийбензоат) подавляют гидрогеназную активность [28J.C0 является обратимым ингибитором по отношению к водороду Г29-ЗЗІ .Для ряда очищенных гидрогена з показано,что молекула гидрогеназы присоединяет I молекулу СО.Для гидрогеназы из СНа Жомо/ии і ьМм-Мі \ъ ь\ было показано,что СО защищает молекулу фермента от инактивации кислородом.Однако,СО не является ингибитором гидрогеназы из JtceMcjbue uUtopfas ні 6 \ Ъ5] и ее связывание не влияет на ЭПР-спектр ,Совокупность вышеприведенных данных свидетельствует о существенной роли железо-серного кластера в механизме каталитического действия гидрогеназ. По последним сообщениям [зб - 44Іу целого ряда гидрогеназ обнаружен атом никеля.Показано,что никель играет важную роль в осуществлении гидрогена зной активности у Я». (UnUf wuL ns) Имеются частные сообщения о присутствии атома никеля в гид-рогеназах из Т. и коі еллґіЫмл, и i.iuXkcphuz .Однако,в литературе отсутствуют строгие доказательства участия атома никеля в электрон-транспортной цепи гидрогеназы. 1.2.Представления о механизме каталитического действия гидрогеназ. . Гидрогеназы катализируют как обратимую реакцию восстановле ния/окисления молекулярного водорода,так и обменные реакции типа: Н2 + Н2Н0 = Н2Н + Н20 н2 + 2н2о = Н2Н I Н2Н0 Изучение кинетики реакций обмена,а также орто-пара конверсии водорода [45 - 50 J. в присутствии фермента свидетельст- вует о гетеролитической активации водорода в активном центре гидрогеназы.Чен и МортенсонГ 51 1 предложили гипотетический механизм действия гидрогеназы,в котором железо-серный кластер Редл рассматривался в качестве активного центра фермента: На данной схеме Е - гидрогеназа,(Ре$) - один из активных центров,А - акцептор электронов.
Схема Мортенсона основана на следующих предположениях: 1)активация молекулярного водорода гидрогеназой представляет собой стадию гетеролитического расщепления молекулы водорода с переносом двух электронов на активный центр фермента; 2)акцептирование электронов из активного центра производится двухэлектронным переносчиком электронов;3)все стадии,входящие в механизм реакции являются бимолекулярными и обратимыми. В работе Аверилла и Орме-Джонсона [ 52 Тбыла предложена модель активного центра гидрогеназы,включающая Ре л-кластер, 4 цистеиновых остатка,связанных с железом кластера и основание В:,способное присоединять протон.Гетеролитическое расщепление молекулы водорода происходит при ее взаимодействии с основанием В: и одним из атомов железа е кластера,как это иллюстрирует следующая схема: Однако,обнаружение атома никеля у ряда гидрогеназ [57- ij требует более строгого доказательства участия железо-серных кластеров в активации молекулы водорода и выяснения роли са мого никеля в проявлении каталитической активности гидрогена-зами. 1.3.Исследования по стабильности и кинетике действия гидрогеназ. Общим свойством всех гидрогеназ является высокая чувствительность к к ислороду.Кислород оказывает инактивирующее воздействие на гидрогеназы,выделяемые как из анаэробных,так и аэробных бактерий.Однако,по устойчивости к кислороду гидрогеназы различаются довольно значительно.Так,период полуинактивации гидрогеназы из Т.гояоримь нь при хранении на воздухе составляет б суток при 4 Г53,54],для $.vw(f4AiS [ іб] - 2 недели,для гидрогеназы из С. bcbdcutieimh s5 ] - 10 минут .Инактивация гидрогеназ из /.lOftoftMіи ил. и $.UI#U BAUS кислородом воздуха обратима;активиость фермента восстапавливается в присутствии восстановителей.Предполагают,что кислород окисляет функционально важные Н-группы фермента.В ряде случаев уменьшение концентрации кислорода в растворе созданием высокой ионной силы приводит к стабилизации гидрогеназ _56 - 59]. Следует отметить,что лабильность гидрогеназ является следствием протекания двух процессовгинактивации кислородом воздуха и тепловой денатурации.Инактивация кислородом,вероятно, связана с модификацией активного центра,например,окислением кислото-лабильной серы и цистеин-содержащих центров [VJ;B то время как тепловая денатурация приводит к разрушению сложной четвертичной и третичной структуры белка,и потере активности. По температурному оптимуму действия гидрогеназы различаются довольно значительно:от 30 у Uorbuctiu ІиАуьшіл , [боЗ до 75 у T. h cVkA- lJ. Устойчивость гидрогеназ к кислороду и нагреванию существенно зависит от степени очистки фермента.Б ряде случаев (меыбраносвязанные гидрогеназы) менее очищенные препараты . фермента оказываются более стабильными.Например,для эктрак-тов клеток С. ь&їїіиїїанмил. период полуинактивации при хранении на воздухе сшставляет 15-20 часов JJ9],тогда как высоко-очищенный фермент инактивируется полностью и необратимо за 50-60 минут LlOJ.Высокоочищеиные препараты гидрогеназы из ty %dZ4uAp Ai(AMS полностью инактивируются через 5 минут при прогревании при 70 б2,63 ] ,тогда как частично очищенный фермент теряет в тех же условиях только 37% активности(_64].
Вероятно,условия работы плохо очищенного фермента в большей степени приближены к реальным условиям функционирования гидрогеназы в мембране клетки,где гидрогеназы,по-видимому,образуют комплексы другими белками и ферментами. Кинетические параметры и рН-зависимости ферментативных реакций,катализируемых гидрогеназами,сильно зависят о$ характера реакции(выделение или поглощение водорода) и природы субстрата.Значение констант Нихаэлиса для акцепторов элек-трона изменяются от 7,5-Ю J до 6,3»10 М,энергии активации - от 7,5 до 16 ккал/моль (Ч J. Формальный кинетический механизм действия гидрогеназ из L ЬМЬАЛЛЛ Оллллту и Т. ustobt/iMcAiA,»- являлся предметом изучения в работах б5 J и J66,67J соответственно.Протекание реакции окисления и восстановления метилвиологена в присутствии гидрогеназы из t.РОЖЛЛЛ ОЛШЩ, удовлетворительно описывается михаэлисовскими зависимостями начальной скорости реакции от концентрации обоих субстратов. Была показана линейность в двойных обратных координатах как по метилвиологе-ну,так и по водороду;график в обоих случаях представлял собой семейство перекающихся слева от оси ординат прямых.Авторы предложили кинетический механизм действия фермента,согласно которому водород и метилвиологен связываются с молекулой гидрогеназы с последующим высвобождением протона и молекулы восстановленного метилвиологена.Затем идет связывание и восстановление второй молекулы метилвиологена. b работе [_бб Jбыла изучена кинетика восстановления метилвиологена водородом,катализируемого гидрогеназой из T.xosbojxh-vitinAs и показано,что первоначально идет связывание молекулы водорода и выброс протона.Обе стадии протекают в равновесном режиме.Затем происходит последовательное восстановление двух молекул метилвиологена. рН-зависимости активности гидрогеназ имеют одну общую черту,вытекающую из механизма действия гидрогеназ.Согласно схеме Мортенсона,максимальная активность фермента измеряемая по поглощению водорода,должна иметь место в щелочных средах, тогда как по выделению водорода - в кислых,что и наблюдается в действительности.В реакциях обмена рН-оптимум выражен менее четко,и определяется,как полагают,устойчивостью фермента. -В целом следует отметить,что общие закономерности действия гидрогеназ еще предстоит выявить;в решении этой сложной и интересной задачи определяющую роль должны сыграть методы химической кинетики и ЭПР-спектроскопии. 1.4.Обща я характеристика НАД-зависимых гидрогеназ (КФ I.12.1.2) В водородокисляющих бактериях присутствуют два типа гид-роге наз:растворимый НАД-зависимый фермент и мембраносвязанный ][68,69j.Следующая схема иллюстрирует пути использования водорода аэробными водородокисляющими бактериями и физиологическую роль каждой из гидрогеназ [ 3 ]
Пути возможного практического использования НАД-зависимых гидрогеназ
В литературе давно рассматривается возможность использования НАД-зависимых гидрогеназ в системах биококвкрсии Отсоединений в водород - наиболее экологически чистое и эффективное топливо JJTJ.Одним из наиболее перспективных источников водорода является метанол,что вытекает из его низкой стоимости, больших объемов производства и высокого относительного содержания водорода ( 13%).В ряде дрожжей и бактерий метанол окисляется до СС 2 с помощью полиферментных систем,состоящих из НАД-зависимых дегидрогеназ [78І.В результате окисления метанола до СОо энергия запасается в виде НАДН - универсального кофактора большого числа окислительно-восстановительных реакций.Водород может быть получен из НАДН непосредственно с помощью НАД-зависимой гидрогеназы ИЛЕ С помощью бифермеитной системы,моделирующей действие НАД-зависимой гидрогеназы:НАДН-дегидрогеназы,соответствующего медиатора и обычной гидрогена-зы.Полная система конверсии метанола до водорода должна включать не менее 3-4- ферментов .В настоящее время в лабораторных условиях удалось осуществить лишь завершающую стадию процесса биоконверсии метанола - получить водород из формиата (_79].В работах,проводимых на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ,были изучены термодинамические аспекты получения водорода из формиата (_8сЛ.Было показано,что оптимальными условиями для дегидрирования формиата являются растворы с рН б,0-6,5,удовлетворяющие как термодинамическим требованиям,так и требованиям,связанным с активностью и стабильностью ферментов.В системе,составленной из формиагдегидрогеназы из i to MxAa/Лл. DOAMIUM . \Ь\\ , и НАД-зависимой гидрогена зы из fi.tuXwp&ui -1,в течение 5-6 часов наблюдается выделение водорода с постоянной скоростью вплоть до достижения системой равновесного давления водорода,равного Ю" атм(Рис.1).После удаления продуктов реакции путем продувания реакционной смеси аргоном наблюдалось дальнейшее выделение водорода до установления равновесия.Во всех опытах наблюдался период индукции продолжительностью от I до 2 часов,обусловленный медленным процессом активации гидрогеназы.В той же работе была исследована трехфермеитапая система,в которой действие НАД-зависимой гидрогена зы моделировали с помощью НАДН-дегидрогеназы из дрожжей &-ibkoJbovwjtM ttAu/ivi&A- и гидрогена зы из %;p«u Jt нояом\ы-UVUL .Для: этой системы было показано,что операционная стабильность всей системы в целом определяется стабильностью кофакторов.
В работе Клибанова и соавт. (_82 было показано,что целые клетки JStaAfjAHbi ZA VOJ -US (равно как и формиатдегидрогена--за из f u cU yva y as ooca Mtus и гидрогена за из A.tufivoerAus связанные через общий субстрат - НАД или метилвиологен)способны выделять водород из муравьиной кислоты.Скорость выделения водорода из формитата иммобилизованными клетками / . tuvo &us сравнима с каталитической эффективностью палладия,адсорбированного на активированном угле .Те же авторы jj32 продемонстрировали на клетках зт. bu&ojr&us возможность синтеза формиата из водорода и бикарбоната с выходом до 30%. Таким образом,НАД-зависимые гидрогеназы могут быть использованы не только для получения водорода из органических соединений,но и для синтеза последних из водорода и СС или соответствующих органических производных). Самостоятельный интерес представляет собой НАДН-дегидроге-назная активность НАД-зависимых гидрогеназ.В работе \ЪЪ] было проведено сравнительное изучение свойств НАДН-дегидрогеназы (Г. wvwivibA- и НАДН-дегидрогеназной активности НАД-зависимой гидрогеназы из ft .иС&ъор&и -1.В результате было пока-зано что НАДН-дегидрогеназная активность гидрогеназы из S,uo- ТЬоепи -1 по своей каталитической эффективности и широкому спектру субстратов превосходит известные НАДН-дегидрогеназы из легкодоступных источников;НАДН-дегидрогеназная активность гидрогеназы при этом хараткреизуется удовлетворительной стабильностью. НАДН-дегидрогеназная активность НАД-зависимых гидрогеназ монет быть использована в полиферментных системах в качестве диашоразы для целей медицинской диагностики,в системах регенерации НАД(Н)JT84-]. В заключение можно выделить несколько областей возможного практического применения НАД-зависимых гидрогеназ при условии успешного решения проблемы их стабилизации:1)биоэнергетика; 2)тонкий органический синтез(возможно также получение дейте-рированных органических соединений);3)системы регенерации кофакторов ;4)использование НАД-зависимой гидрогеназы в качестве диафоразы[85,8б1. ГЛАВА 2.Особенности поведения диссоциирующих ферментных систем. Для олигомерных ферментов - белков со сложной четвертичной структурой,включающей две и более субъединиц,и способных к диссоциации/ассоциации наблюдается ряд интересных особенностей при изучении физико-химических свойств.Наиболее типичным проявлением способности олигомерного фермента к диссоциации/ассоциации является нелинейная зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.
При определении молекулярного веса методом гель-фильтрации удается получить лишь кажущееся значение молекулярного веса,которое зависит от концентрации наносимого на колонку образца.На Рис.2 приведены хроматограммы амилазы из fraddus s-u&fr& s Б зависимости от концентрации наносимого образца фермента.Амилаза из . Utcti s способна к ассоциации,поэтому по мере повышения концентрации хрома-тографируемого образца кажущийся молекулярный вес увеличивается для высококонцентрированных образцов появляется дополнительно к пику мономерной формы пик,отвечающий ди-мерной форме амилазы 87 .Аналогичная картина может наблюдаться в экспериментах по ультрацентрифугированию и электрофорезу в неградиентном полиакриламидном геле. Возможность диссоциации фермента на отдельные субъединицы,которые в общем случае отличаются по своим каталитическим свойствам от исходного олигомера, - представляет собой один из способов регуляции активности фермента в клетке .Изменение степени диссоциации молекулы фермента может произойти как и при простом изменении концентрации фермента,так и под действием субстратов,коферментов,эффекторов, или при изменении условий среды:рН,ионной силы,температуры и др.Предполагается,что процессы диссоциации/ассоциации имеют большое значение для регуляции активности фос-форилазы А(КФ 2.4.I.I) в скелетных мышцах кролика и лягушки [_ 88,89,90 ,НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ I.I.I.4I) у (ЬклЬнАшНии ет ) б[9і],щелочной фосфатазы(КФ 3.1.3.1) у . tol Г 92 7,фосфофруктокиназы (КФ 2.7.1.II) из эритроцитов человека 93 ] и др. В настоящей главе обсуждается влияние процессов диссоциации/ассоциации на зависимость удельной активности от концентрации фермента и способы определения равновесной и кинетических констант этих процессов для наиболее простых случаев(когда одна из форм неактивна). 2.1.Зависимость удельной ферментативной активности от концентрации фермента для равновесия типа 2Ч ДХК Для ферментов,не обнаруживающих способность к диссоциации/ассоциации,начальная скорость ферментативной реак- ции прямо пропорциональна концентрации фермента.Говоря иначе,порядок скорости ферментативной реакции по концентрации фермента равен единице,а удельная активность является постоянной величиной.
Дивсоциирующие ферментные системы типа мономера димер =^тетрамер(для случая актрівного тетрамера)
Многоступенчатые процессы ассоциации/диссоциации белков встречаются довольно часто.Например,глицеральдегидфосфатде-гидрогеназа(КФ 1.2.1.12) из скелетных мышц кролика[.102 , глюкозо-б-фосфат-дегидрогеназа(КФ I.I.I.49) из эритроцитов человекаГ I03J и др. представляют собой диссоциирующие ферментные системы типа мономер димер -тетрамер;а #-глю-козидаза(КФ 3.2.1.21) из botufokpCodia fttcfto/tuuJjObJv. ацетил-холикэстераза (КФ 3.1.1.7) из мозга мыши [I05J - диссоциирующие системы типа мономер димерФ тетрамера октамер.При анализе подобных систем,как.правило,пренебрегают возможностью существования промежуточных олигомеров(напрмер,тримеров). Введем обозначения для диссоциирующей системы типа Константа ассоциации для первой ступени обозначена через Км, длявторой ступени равновесия - К .Через Кт обозначим произведение КДК2 я ft]/Об Общая молярная концентрация фермента в расчете на мономер равна: глицеральдегидфосфатдегидрогеназу из мышц кролика [107] . В обсундаемой системе,если известно значение удельной ферментативной активности тетрамера -( ,- можно оценить константы ассоциации Км и Кт: где через % обозначена относительная ферментативная активность (t= Л/Лт).Таким образом,для системы неактивный мономер неактивный димер г;активный тетрамер зависимость (J-ъ)\/( J}/АУ ОТ )рВ"]0ч, должна быть линейной. Зависимости & от [Е]0 для ферментной системы такого типа имеют -образный характер.Это видно из Рис.7,на котором представлены рассчитанные в соответствии с уравнением (12) зависимости относительной ферментативной активности от безразмерной концентрации фермента о-\/Кг[н]о при различных отношения Км/Кд= т(.-образный характер кривых зависимости Ъ от %о усиливается при уменьшении оС ,но постепенно исчезает при cjC- oOjT.e. в условиях,когда исследуемая система заменяется системой неактивный димер активный тетрамер.При К Км(т.е. приоС- -0) рассматриваемая система упрощается фактически до системы неактивный мономер активный тетрамер.
В работе были использованы следующие реактивы:метилвиологен-хлорид,бензилвиологен хлорид,аденозин-5 -дифосфорибоза етиленовая синь,Кумасси -250 фирмы $vwa (ШвеЙцария);2,6--дихлорфенолиндофенол фирмы Sigma, (США);дитионит натрия, -додецилсульфат натрия,феназинметосульфат фирмы Мш& (ФРГ); НАД,НАДН,акриламид, ,А/ -диметиленбисакриламид,персульфат натрия,амидочерный ЮБ,Кумасси К-250,нитротетразолиевый голубой и трифенилтетразолий бромид фирмы ЬЯМАХ, (Венгрия), наборы маркеров для электрофореза и гель-фильтрации,пластины градиентного(4-30%) полиакриламидного геля фирмы їкшьШіь, (Швеция);феррицианид калия,гидроокись калия,хлористый калий, дигидрофосфат калия,сульфат аммония,мочевина,карбонат натрия,сульфат меди,трипсин отечественного производства марки ч.д.а. и о.с.ч. Для хроматографии использовали носители:сефадексы 6-200, -Ю,АМФ-сефароза и "голубая" сефароза С1-6В,октил- и фенил-сефароза С1-4В,ДЭАЭ-сефацель фирмы Ркяммлч а, (Швеция);АсА--Н,сефакрил -200 фирмы ІКВ(Швеция); loyotusvil HW 55Р фирмы Toyo Soda, (Япония). Биомасса водород окисляющих бактерий ЛиШсц и імЛковки$ штамм -1 была любезно предоставлена Я.В.Федоровой(йнститут физики СО АН СССР,г.Красноярск). В работе использовали газы:водород,кислород,азот,аргон без предварительной очистки. 3.2.Методы Методика очистки гидрогеназы.30 г биомассы суспендировали в 0,05М К-фосфатном буфере,рН 7,9(50-60 мл) и разрушали ультразвуком 2х2мин при мощности 100Вт на приборе cdwyUe, I5I0(U білил, Лш,ьипд&ъ" ,ФЇЇ) ИДИ на УЗДН-І при 22кГц и 0,3 W в течение 5 мин.Разрушение проводили при охлаждении 0).Гомогенат центрифугировали при 16000 об/мин.Над-осадочную жидкость разбавляли 1:1 0,05М К-фосфатным буфером, содержащим 0,6М сульфат аммония,рН 7,3,предварительно насыщенным кислородом.Далее полученный экстракт наносили на колонку(1,6x8 см) с фенил-сефарозой,уравновешенной 0,05М К-фосфатным буфером,содержащим 0,ЗМ сульфата аммония,рН 7,3. Балластные белки элюировались при нанесении и при промывке колонки 50 мл исходного буфера.Затем колонку промывали 0,0111 К-фосфатным буфером,рН 7,8.Фракции,обладающие гидрогеназной активностью объединяли(чЕ5 мл) и наносили на колонку(2,8х х70 см) с сефакрилом -200,уравновешенным 0,05М К-фосфатным буфером,рН 7,8.Во фракции,обладающие гидрогеназной активностью ( 80 мл) добавляли равный объем 0,05М К-фосфатного буферами 7,0,содержащего 0,6М хлорида калия.Доводили рН объединенных фракций до 7,3.Полученный препарат фермента наносили на колонку(0,9х8 см) с фенил-сефарозой,уравновешенной 0,05М К-фосфатным буфером,содержащим 0,ЗМ хлорид калия,рН 7,З.Гид-рогеназу элюировали градиентом(50+50 мл),составленным из исходного буфера и 0,01М К-фосфатного буфера,рН 7,8.Гидрогена-за элюировала одним пиком при рН 7,6. Скрининг носителей для очистки(хроматография на АМФ-„"голубой",октил- сефарозе).Изучение возможностей очистки фермента на различных носителях проводили для препаратов частично очищенного фермента.
Гомогенат подвергали фракционированию сульфатом аммония в интервале 30-60% насыщения,далее проводили гель-фильтрацию на колонке(2,8x70 см)суравновешен ным 0 005М К-фосфатным буфером,рН 7,6 АсА-44.Колонка(0,9х х8 см) с АМФ-сефарозой(или "голубой" сефарозой) была предварительно уравновешена 0,005М К-фосфатным буфером,рН 7,6. Препарат частично очищенного фермента наносили на колонкуі колонку промывали исходным буфером,собирали фракции,содержащие белок,и измеряли в них гидрогеназную и НАДН-дегидро-геназную активности.Далее колонку последовательно промывали 0,05М К-фосфатным буфером;тем же буфером,но содержащим хлорид калия в возрастающей концентрации ,2М;1М).Изучение сорбции гидрогеназы на октил-сефарозе проводили в условиях, аналогичных методу очистки на фенил-сефарозе(см.выше). Определение белка.Содержание белка в препаратах фермента на различных стадиях очистки проводили по методу с использованием красителя Кумасси -250 как это описано [пшй«Для препаратов высокоочищенного фермента наряду с вышеуказанным использовали метод Лоури {_ II0J;обе методики для гомогенного препарата давали одинаковые результаты. Предынкубация препаратов гидрогеназы.Перед проведением всех экспериментов препарат фермента после размораживания подвергали предварительной инкубации в течение 2-3 часов при 25, контролируя изменение гидрогеназной активности.В том случае, когда последующий эксперимент проводили при 4(инактивация в мочевине),фермент после размораживания инкубировали при 4 в течение I суток. Измерение гидрогеназной активности.Гидрогеназную активность по поглощению водорода измеряли спектрофотометрически(/їлгАл 557,Япония).В анаэробную кювету помещали фосфатный буфер, субстрат(І,5мМ НАД + 0,02мМ НАДН для активации фермента;или бмМ метилвиологена,или 7мМ бензилвиологена) и насыщали водородом в течение 2 минут.Реакцию инициировали добавлением -фермента,продували раствор еще 0,5 мин и измеряли активность по накоплению восстановленной формы субстрата(НАДН d 34СГ = 6,22 _ІІІ ;метилвиологен I gQQ= І2;бензилвиологен Ь = = 8,1 Г79 1).Гидрогеназную активность по выделению водорода измеряли хроматографически(газовый хроматограф ЛХМ-8МД,молекулярное сито 5А,газ-носитель азот).Фосфатный буфер,метилвио-логен(7мМ) и гидрогеназа помещались в 16 мл сосуд(обьем раствора 6 мл);сосуд вакуумировали,продували аргоном и инициировали реакцию добавлением сухого дитионита натрия в концен- трации 15мМ.Реакцию проводили при комнатной температуре(20). Измерение НАДН-дегидрогеназной активности.Измерение НАДН-де-гидрогеназной активности проводили в анаэробных кюветах по накоплению восстановленной формы переносчика электронов или а аэробных кюветах по уменьшению концентрации НАДН(340 нм).
Субъединичиый состав НАД-зависимой гидро геназы
Согласно полученным данным в состав нативного тетрамера с молекулярным весом около 180000 входят 4 различные субъединицы,молекулярные веса которых составляют 65,5 1,1;54,5- 0,2;29,4-0,6 и 26 тысяч дальтон(ошибки в определении молекулярного веса рассчитаны на основании четырех независимых экспериментов). НАД-зависимые гидрогеназы из Ф ,tuAzofhuS HI6 и М.орсил I о согласно частному сообщению проф.Шлегеля потроены аналогичным образом.Их молекулярный вес близок к 200000,в состав ферментов входят 4 субъединицы с различными молекулярными весами.Полученные нами результаты также свидетельствуют об отсутствии в составе молекулы гидрогеназы Ф- .eutwpfiui -1 субъединиц одинакового молекулярного веса. Сложная четвертичная структура гидрогеназы,включающая 4 различные субъединицы,позволяет предполагать неравноценность контактов между ними и,следовательно,вероятность распада оли-гомерного фермента на фрагменты при изменении условий.Как уже отмечалось в Главе 4,молекулярный вес гидрогеназы,определяемый методами гель-фильтрации и ультрацентрифугирования, существенно зависел от концентрации исследуемых препаратов фермента.При уменьшении концентрации хроматоградируемых образцов фермента молекулярный вес гидрогеназы уменьшался со 180000 до 90000(Рис.14,15).Причем компонент с молекулярным весом около 90000 проявлял каталитическую активность в НАДН-дегидроге-назной реакции с метилвиологеном в качесвте субстрата,но не обладал гидрогеназной активностыо(Рис.14). На основании данных по гель-фильтрации и ультрацентрифугированию можно предполагать,что при понижении концентрации гидрогеназа диссоциирует на приблизительно равные по молекулярному весу половинки - "гетеродимеры",-состоящие из субъединиц большего и меньшего молекулярного веса.Разделение таких "гетеродимеоов" в силу близости молекулярных весов(молекуляр-ные веса всех возможных "гетеродиеров" составляют 89 5 тысяч дальтон) представляет собой трудную в экспериментальном отношении задачу.
Одним из подходов,позволяющих определять напрвления диссоциации фермента и количесвтенно описывать этот процесс,является изучение зависимости удельной активности от концентрации фермента,как это рассмотрено: в Главе 2. На Рис.17 представлены кривые зависимости удельной активности,проявляемой гидрогеназой в НАД-зависимой гидрогеназной и НАДН-дегидрогеназной реакции с дихлорфенолиндофеиолом.При бесконечном разбавлении удельная активность фермента стремится к нулю.Экспериментальные точки удовлетворительно опи- сывает теоретическая стандартная кривая,рассчитанная для диссоциирующей ферментной системы типа активный димер "неактивный мономер.В данном случае в качестве активной фермы рассматривается тетрамер,а в качестве неактивной -"гетеродимер". При совмещении экспериментальной и теоретической кривых в координатах ла А/А0 - $д К0[Е70,удается определить равно- весную константу ассоциации К ,равную 101 . Представленные на Рис.17 данные получены при использовании препаратов фермента,не подвергавшихся процессу замораживания. Исследуемые концентрации гидрогеназы были получены разбавлением высококонцентрированных образцов фермента.Для препаратов реконцентрированного фермента или препаратов гидрогеназы,подвергавшихся процессу замораживания/размораживания,зависимость удельной активности от концентрации фермента имела Р-образный характер.Такой тип зависимости характерен для многоступенчатых процессов диссоциации типа активный тетрамер неактив-ный димер неактивный мономер.Можно предполагать,что неоднократное проведение процесса замораживания/размораживания способствует дестабилизации глобулы фермента.Расчет константы равновесия в этом случае затруднен ввиду ее зависимости от предыстории образца фермента. Гидрогена за из Я .ьЛіов$м% Jf--i относится к медленно диссоциирующим ферментным системам.Равновесие диссоциации устанавливается в течение 20 минут после разбавления фермен- та.На Рис.18,19,20 представлены результаты изучения кинетики установления равновесия после разбавления высококонцентрированного образца фермента и определения равновесной и кине-ческих констант процесса диссоциации по методу,предложенному в работах Б.И.Курганова(см.Главу 2).
Согласно полученным данным процесс диссоциации нативного тетрамера гидрогеназы при разбавлении можно описать схемой где Т - нативная форма фермента,Ду и Др - "гетеродимеры", кинетическая константа ассоциации 0=(8-1 1(Лг с" ,кинетическая константа диссоциации\ =(8-1 10 с.Очевидно,что в дайной схеме мы пренебрегаем возможностью образования тетра-меров типа Д- и Д2Д2 . На Bic.21 представлены зависимости удельной активности гидрогеназы,проявляемой при катализе различных реакций,от концентрации фермента и условий предынкубации.Согласно данным, изображенным на Рис.21,только НАДН-дегидрогеназная активность с метилвиологеном в качестве субстрата не зависит от концент-рации(кривая 5)."Это подтверждает полученные ранее данные о наличии НАДН-дегидрогеназной активности по метилвиологену у "ге-теродимеров" с молекулярным весом около 90000(Рис,14)."Гетеро-димеры" не проявляют гидрогеназной активности как с НАД,так и с метилвиологеном,и НАДН-дегидрогеназной активности по дихлор-фенолиндофенолу.Инкубации фермента с 0,1мМ НАД препятствует диссоциации гидрогеназы(ср.кривые I и 2).НАДН,напротив,приводит к абсолютному уменьшению удельной активности и увеличению константы диссоциации(ср.кривые I и 3);инкубация фермента с НАДН изменяет характер зависимости НАДН-дегидрогеназной активности по метилвиологену(ср.кривые 5 и 6).Этот факт может быть приписан ._инактивирующему воздействию НАДН,вследствие восстановления активного центра гидрогеназы и переводом фермента из стабильной "окисленной" формы в лабильную "восстановленную". С другой стороны НАДН может усиливать процесс диссоциации гидрогеназы,как это следует из Рис.22,на котором представлены результаты электрофореза гидрогеназы в присутствии 0,015мМ НАДН в - электродном буфере,пластинах геля и образцах фермента.Согласно данным электрофореза(Рис.22) по белку в присутствии НАДН окрашиваются 4 полосы,соответствующие молекулярным весам порядка 280,180,95 и 55 тысяч дальтон.Гидрогеназной активностью обладает только нативный фермент с молекулярным весом 180 тысяч.Сопоставляя данные изучения удельной активности от концентрации фермента в присутствии НАДН(Рис.21,кривая б) и результаты электрофореза(Рис.22),можно предполагать,что в присутствии НАДН процесс диссоциации протекает глубже,приводя к образованию субъединиц.Характерной особенностью инактивирующего воздействия НАДН является его необратимый характер. / -образный характер кривой б(Рис.21) может быть объяснен двояким образом: либо в присутствии НАДН уменьшается удельная активность "ге-теродимеров",либо НАДН-дегидрогеназной активностью по метилвио- логену обладают фрагменты гидрогеназы с молекулярным весом менее ЯОООО. В целом,для описания процесса диссоциации гидрогеназы при разбавлении можно предложить следующую схему,связывающую уровень четвертичной структуры фермента со способностью катализировать различные типы реакций.Предлагаемая схема находится в соответствии с полученными экспериментальными данными на основе применения методов ультрацентрифугирования,высокоэффективной жидкостной хроматографии и кинетических методов исследования диссоциирующих ферментных систем.
