Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о структуре и механизме действия лакказ 7
1.1. Классификация, общая характеристика и биохимические свойства лакказ 7
1.2. Строение активного центра лакказ 8
1.3. Каталитические свойства лакказ и механизм катализа 11
ГЛАВА 2. Современные представления о структуре и механизме действия пероксидаз растений 16
2.1. Классификация и общая характеристика растительных пероксидаз 16
2.2. Структура изофермента С пероксидазы хрена 16
2.3. Каталитический цикл пероксидазной реакции. Промежуточные соединения пероксидазы 17
2.4. Функциональная важность отдельных компонентов пероксидазы для катализа 19
2.5 Механизм химической инактивации пероксидазы пероксидом водорода 22
2.6 Субстратная специфичность пероксидаз 25
2.7 Применение пероксидаз растений 27
ГЛАВА 3. Полианилин 28
3.1 Общие представления о структуре полианилина 28
3.2 Синтез полианилинов 28
3.2.1 Химический способ получения полианилина. 30
3.2.2 Электрохимическая полимеризация анилина 31
3.3 Механизм полимеризации анилина 32
3.4 Допирование полианилина 34
3.5 Хиральность полианилина 40
3.6 Морфология полианилина 41
3.7 Ферментативная полимеризация как альтернативный способ получения полианилинов 43
Материалы и методы исследований 44
Обсуждение результатов 55
ГЛАВА 1. Ферментативный синтез полиэлектролитных комплексов на основе полианилина, катализируемый лакказой 55
1.1. Оптимизация условий ферментативной полимеризации анилина в присутствии лакказы 55
1.2. Характеристики полученных комплексов полианилина 64
ГЛАВА 2. Ферментативный синтез полиэлектролитных комплексов на основе полианилина, катализируемый пероксидазой 72
2.1 Оптимизация условий ферментативного синтеза полиэлектролитных комплексов на основе полианилина, катализаруемого пероксидазой пальмы 72
2.2 Характеристики полученных полиэлектролитных комплексов полианилина 85
ГЛАВА 3. Ферментативный синтез хирального полианилина на мицеллах, катализируемый пероксидазой 99
3.1. Оптимизация условий ферментативной полимеризации анилина на мицеллах додецилбензолсульфоновой кислоты в присутствии камфорсульфоновой кислоты с помощью пероксидазы пальмы.
Характеристики полианилина 99
Выводы
Список литературы
- Строение активного центра лакказ
- Каталитический цикл пероксидазной реакции. Промежуточные соединения пероксидазы
- Химический способ получения полианилина.
- Характеристики полученных комплексов полианилина
Введение к работе
В 2000-м году Нобелевская премия по химии была присуждена исследователям Хидеки Сиракава (Hideki Shirakawa, Япония), Алану МакДиармиду (Alan G. McDiarmid, США) и Алану Хигеру (Alan J. Heeger, США) за "открытие и развитие области электронопроводимых полимеров". Проводящие полимеры образовали новый класс "синтетических металлов", обладая исключительными свойствами в сравнении с низкомолекулярными полупроводниками. На настоящий момент они нашли широкое применение в различных областях науки и техники от микроэлектроники (батареи, оптические мониторы) до биоаналитики (сенсоры). Полианилин привлекает наибольшее внимание исследователей, благодаря своей высокой стабильности и хорошим проводящим характеристикам. Кроме того, обнаружено, что в присутствии хирального индуктора (например, энантиомеров камфорсульфоновой кислоты) он может образовывать оптически активные вторичные структуры [1]. Это свойство в дальнейшем может существенно расширить область применения полианилина. К сожалению, основные способы получения (химический и электрохимический) полианилина обладают определенными недостатками, что вызывает необходимость в разработке альтернативных методов.
В последние годы был опубликован ряд работ, посвященных использованию ферментов как катализаторов окислительной полимеризации, что привело к появлению термина "ферментная полимеризация" [2]. В частности была показана возможность получения проводящего полианилина при полимеризации анилина с помощью пероксидазы хрена [3, 4]. В то же время оказалось, что в условиях, необходимых для синтеза полианилина, а именно при кислых условиях, этот ферментный препарат быстро теряет свою активность. Таким образом, становится понятным интерес к поиску новых ферментов, пригодных для проведения синтеза полианилина.
Задачей настоящей диссертационной работы является:
S Исследование возможности использования лакказы Coriolus hirsitus и
пероксидазы из листьев Королевской пальмы в качестве биокатализаторов для
проведения ферментативного синтеза полианилина
S Оптимизация методик ферментативного синтеза проводящих
полиэлектролитных комплексов полианилина с сульфополистиролом и поли(2-
акриламидо-2-метил-1 -пропан)сульфокислой
/ Изучение ферментативного синтеза хирального полианилина,
катализируемого пероксидазой пальмы, на мицеллах додецилбензолсульфоновой
кислоты
S Определение физико-химических свойств и структуры полианилина,
полученного ферментативным путем.
Строение активного центра лакказ
В результате сравнения аминокислотных последовательностей более чем 100 лакказ, было выявлено 4 консервативных участка (LI - L4) [25]. Лигандное окружение ионов меди активного центра лакказ - 1 цистеиновый и 10 гистидиновых остатков - находятся в этих четырех консервативных аминокислотных последовательностях. Структура белковой глобулы в целом, также как и лигандное окружение активного центра лакказ, очень важно для понимания механизма катализа лакказами.
Несмотря на большое количество работ, посвященных голубым медьсодержащим оксидазам, в том числе и лакказам, до сих пор нет однозначного мнения, как о пути переноса электрона, так и о механизме восстановления дикислорода в молекуле.
Считается, что ТІ центр лакказ принимает электроны от субстратов-восстановителей, а затем они переносятся через строго консервативную трипептидную последовательность His-Cys-His на трехъядерный Т2/ТЗ кластер, где происходит активация молекулярного кислорода и его восстановление до воды (Рис. 1.3) [7, 15].
При взаимодействии полностью восстановленной лакказы с молекулярным кислородом происходит образование различных форм фермента. Две хорошо изученные формы были названы пероксидным интермедиатом и нативным интермедиатом [6, 16]. Нативный интермедиат играет важную роль в каталитическом цикле лакказы [26]. При проведении реакции с 1702, было показано, что это промежуточное соединение является кислородным радикалом. Методами ЭПР спектроскопии и магнитного кругового дихроизма было установлено, что все четыре иона меди в нативном интермедиате находятся в окисленной форме [23]. Его структура отличается от структуры «покоящегося» фермента, в котором ион меди Т2 центра не связан с ионами ТЗ центра.
На рисунке 1.4. показан механизм четырехэлектронного восстановления молекулы дикислорода до воды с участием лакказы. Полностью восстановленный трехъядерный медный кластер Т2/ТЗ лакказы взаимодействует с молекулярным дикислородом с образованием пероксидного интермедиата. Этот интермедиат был изучен с использованием лакказы, в которой ТІ ион меди был заменен на редокс неактивный ион ртути Hg2+ [23]. При взаимодействии дикислорода с молекулой TlHg-замещенной лакказы образуется пероксидный интермедиат, в котором между восстановленным Т2 и окисленным ТЗ центрами образуется пероксидный мостик. Этот интермедиат переходит в промежуточное соединение, подобное нативному интермедиату лакказы с 4 ионами меди в активном центре. Образование пероксидного интермедиата (в TlHg-лакказе) и нативного интермедиата (в нативном ферменте) зависит от концентрации дикислорода, и константы скорости второго порядка для этих реакций сопоставимы. Было высказано предположение, что пероксидный интермедиат содержит ион Ог2", один из атомов кислорода которого связан с ионами меди Т2 и ТЗ, а второй координирован с другим ионом меди ТЗ [27].
Расщепление пероксидной 0-0 -связи при переходе от пероксидного к нативному интермедиату включает невыясненный до конца механизм переноса протона и электрона. В работе [23] было установлено, что энергия активации этого процесса составляет 9 ккал/моль, что хорошо согласуется с механизмом, включающим одноэлектронный восстановительный распад пероксида.
В свою очередь нативный интермедиат может медленно трансформироваться в полностью окисленную форму, которую часто называют «отдыхающей» формой лакказы. ТІ центр такой формы фермента может быть восстановлен субстратом, но скорость переноса электрона на трехъядерный медный кластер слишком мала, чтобы быть каталитически значимой [6, 15]. Окисление субстратов-восстановителей. Типы субстратов, окисляемых лакказами.
Лакказы являются неспецифическими ферментами в отношении субстратов-восстановителей и катализируют окисление различных органических соединений, включая о-, я-дифенолы, аминофенолы, полифенолы, полиамины, метокси-замещенные фенолы, лигнины и арилдиамины, а также некоторых неорганических ионов, с одновременным восстановлением дикислорода непосредственно до воды [5, 15, 25]. Необходимо отметить, что лакказы не могут катализировать окисление тирозина, в отличие от тирозиназ. Из-за широкой субстратной специфичности бывает трудно определить лакказную активность при одновременном присутствии в растворе других оксидоредуктаз, в частности пероксидаз и тирозиназы. Достаточно надежным методом определения лакказной активности является окисление лакказой сирингалдазина [28], так как тирозиназа и пероксидазы не способны окислять этот субстрат.
Сравнение каталитических характеристик лакказ, выделенных из различных источников, важно для практического использования. Однако это трудно сделать, так как в разных работах условия проведения реакций и состояние исходных ферментов различны, что затрудняет сравнение.
Каталитический цикл пероксидазной реакции. Промежуточные соединения пероксидазы
Особый интерес представляет реакция окисления ферропероксидазы молекулярным кислородом, которая позволяет рассматривать Соединение III как окси-пероксидазу, своеобразный аналог оксигемоглобина. Формальная степень окисления железа в Ез равняется 6, соединение диамагнитно и не дает ЭПР сигнала. Наблюдаемая константа скорости реакции второго порядка образования Соединения III из Соединения II имеет значение k = 25 М с"1 [47]. Е3 не принимает непосредственного участия в каталитическом цикле фермента, однако, в ряде случаев оно играет, по-видимому, ключевую роль. С ним связана оксидазная функция фермента, проявляющаяся, например, при окислении индолилуксусной кислоты [48].
Считается, что Соединение III является промежуточной формой, в которой фермент защищен от окислительного воздействия избытка пероксида водорода. Прямые кинетические исследования инактивации фермента с использованием в качестве окислителя различных органических пероксидных соединений, а в качестве восстановителя - АБТС [49] показали, что инактивирующим агентом является субстрат-окислитель. В этом случае вместо пероксида водорода Е\ и Е2 окисляют субстрат-восстановитель, а Ез не образуется. Кроме того, субстрат-восстановитель предохранял фермент от инактивации пероксидом: при увеличении соотношения АБТС/Н202 число оборотов фермента увеличивалось. Сходные результаты были получены при исследовании окисления пероксидазой индолилуксусной кислоты [50].
На основе анализа кинетических данных было постулировано [51], что реакция инактивации происходит на уровне соединения I (схема 2.4): Из приведенной схемы, в частности, становится ясно, что присутствие восстанавливающего субстрата должно замедлять инактивацию фермента, поскольку восстановитель конкурирует с пероксидом за Соединение I.
В результате экспериментов по инактивации было принято [47, 51], что классические пероксидазы не переносят кислород во время окисления, потому что субстраты-восстановители взаимодействуют с 8-мезо сектором гема, а их доступ к феррильному кислороду невозможен, так как простетическая группа большей своей частью погружена в белок. Эта гипотеза получила дополнительное подтверждение тем, что пероксидаза с 8-мезоэтилгемом в качестве простетической группы нормально реагировала с пероксидом с образованием Еь которое, однако, не обладало способностью окислять субстраты. В то же время фермент с 8-мезометилгемом - активен. Сохранение каталитической активности фермента с метильной группой в 5-мезо положении простетической группы, в отличие от пероксидазы с 8-мезоэтилгемом, является доказательством того, что инактивация вызвана стерическими препятствиями, возникающими в результате присоединения радикала, а не драматическими изменениями в структуре активного центра или окислительно-восстановительных свойств гема. Исходя из полученных данных, активный центр пероксидазы приближенно можно представить в виде модели, где фермент экспонирует 8-мезо сектор и 8-метильную группу гема (рис. 2.2) [47, 51].
Все гем-содержащие пероксидазы отличает широкая субстратная специфичность, которая проявляется в способности окислять природные и искусственные доноры электронов.
В настоящее время сложилось мнение, что субстраты классических пероксидаз растений можно принципиально разбить на три группы. К первой относят двухэлектронные доноры, для которых принципиальным является связывание вблизи активного центра (у плоскости гема, иодид-ионы) или даже проникновение внутрь (прямой перенос кислорода с феррила гема - тиоанизол, стирол). Вторые - достаточно простые одноэлектронные ароматические субстраты, связывающиеся вблизи активного центра, как феруловая кислота. И третьи -окисляются через электронно-транспортные цепи, пронизывающие белковую часть пероксидазы. Использование пероксидаз как катализаторов окислительной полимеризации
В последние годы был опубликован ряд работ, посвященных использованию ферментов как катализаторов окислительной полимеризации. Ферментная полимеризация позволяет получать полиароматические соединения, которые сильно отличаются по структуре от тех же соединений, полученных традиционными методами [2].
Роль фермента в окислительной полимеризации заключается в инициации образования катион-радикала (схема 2.5). Первый этап ферментной полимеризации заключается в переносе одного электрона с ароматического субстрата на фермент с образованием катион-радикала, который в последствии и начинает формирование полимерной цепи.
Химический способ получения полианилина.
Для традиционного химического синтеза линейного полианилина необходимы как минимум три компонента: анилин, кислая среда (водная или органическая) и окислитель.
При проведении полимеризации для создания кислой среды используют соляную или серную кислоту, а в качестве окислителей авторы [64] рекомендуют персульфат аммония (NH4)2S20g, бихромат калия К2СГ2О7, сульфат церия Ce(S04)2, ванадат натрия NaV03, иодат калия КЮ3, пероксид водорода Н202.
Наиболее распространенный синтез полианилина ведется в 1 М водном растворе НС1 с (NH4)2S208 в качестве окислителя при соотношении (ЫН4)28208/анилин 1.15, что позволяет достигать высокого выхода продукта и удовлетворительных проводящих свойств. Для снижения побочных реакций температуру реакционной смеси поддерживают в интервале 0-2С. Обычно, реакция заканчивается в течение 1 - 2 часа.
Экспериментальная часть включает медленное добавление по каплям водного раствора (NH4)2S208 к раствору анилина/НС1, причем оба раствора предварительно охлаждаются до 0С. Затем получившаяся смесь перемешивается в течение часа. Выпавший осадок отфильтровывается, промывается соляной кислотой и сушится под вакуумом двое суток. Полученный образец представляет собой солянокислый эмеральдин с характерным зеленым окрашиванием. Основными недостатками этой методики являются:
Реакция проводится в жестких условиях (кислая среда, низкая температура) / Образуются побочные продукты (разветвленные и переокисленные формы полианилина, сульфат-анион), ухудшающие свойства полианилина S Невозможность кинетического контроля Получаемый полианилин нетехнологичен, т.е. требует дополнительной подготовки для дальнейшего использования (необходимость растворения, допирование и т.д.) Полимеризация в эмульсии [60]
Реакция идет в гетерогенной системе (водные и неводные среды). Мономер, как и полимер, обычно растворим в неводной фазе. В обращенных же системах водорастворимый мономер диспергирован в неводной среде. Типичная эмульсионная полимеризация включает 30% мономера, 65% воды, а также эмульсификатор (стабилизатор), инициатор и некоторые другие добавки. В результате образуются микрореакторы - мицеллы, в которых и происходит образование продукта с высокой степенью полимеризации.
Дисперсионная полимеризация [60]
Дисперсионную полимеризацию можно определить как полимеризацию мономера, растворенного в водной или органической среде, с образованием нерастворимого полимера в виде стабильного коллоидного раствора. Стабильность образующихся коллоидных частиц достигается за счет адсорбции на их поверхности диспергента (силикаты, поливинилхлорид, полистирол, полиметилметакрилат). Этот процесс можно рассматривать как обычную химическую полимеризацию анилина, когда выпадение осадка предотвращено и есть возможность контроля за размерами образующихся частиц, что и является главным преимуществом данного метода. Данный способ позволяет получать наночастицы полианилина.
Электрохимическая полимеризация анилина проводится на электроде, покрытом пленкой из непроводящего полимера (сульфатированный полистирол, полиметилметакрилат), при этом образующийся композит полианилина с этим полимером обладает хорошими проводящими и механическими свойствами [60-62, 65]. Мономер, растворитель и анион электролита диффундируют сквозь пленку полимера к поверхности электрода, где и происходит полимеризация. В основном используются две методики проведения электрохимического синтеза полианилина гальваностатический при постоянном электрическом токе, и потенциостатический, когда постоянным является напряжение. Как альтернативный, предлагается потенциодинамический метод с использованием циклической вольтамперометрии, при этом потенциал электрода изменяется от потенциала окисления мономера до потенциала восстановления синтезируемого электроактивного полимера.
Электрохимическая ячейка включает одну, две или три составляющие. Преимущественно используют ячейку, состоящую из трех электродов: рабочего электрода, электрода сравнения и вспомогательного электрода. Синтез чаще всего ведется, как и при химическом получении, в кислой водной среде, хотя иногда и используются неводные среды. Получение полимерных композитов проводится в инертной атмосфере азота или аргона. Наиболее распространенным рабочим электродом является платиновый. Тем не менее, полианилин также получали и на стеклянном, медном, графитовом электродах [65]. В качестве электрода сравнения используют насыщенный каломельный, а в качестве вспомогательного -платиновый.
В сравнении с химическим синтезом электрохимический имеет явные преимущества [66]. Получающийся полианилин не требует дополнительной очистки, является проводящей формой, а также проводящие свойства и толщину получаемых пленок можно контролировать, изменяя потенциал электрода. Несмотря на это, химический метод получил большее распространение, поскольку электрохимически не возможно получать полианилин в препаративных количествах.
Механизм радикальной полимеризации анилина с образованием линейных молекул полианилина сложен и плохо изучен. Упрощенную схему этого процесса можно представить следующим образом [67].
Образование полианилина из анилина является поликонденсацией и проходит по-стадийно. Первым шагом является образование катион-радикала с одновременным удалением электрона с 2s уровня атома азота анилина (схема 3.1).
Эта стадия не зависит от рН среды. С точки зрения кинетики эта стадия является лимитирующей, и для ускорения всего процесса используют катализаторы. Затем реакция развивается автокаталитически.
Характеристики полученных комплексов полианилина
Прежде всего, было изучено влияние кислотности реакционной среды (в интервале рН от 3.5 до 4.4) на протекание реакции полимеризации анилина, катализируемой лакказой. Реакция велась при комнатной температуре в присутствии СПС согласно методике. За ходом реакции наблюдали спектрофотометрически, регистрируя изменение электронных спектров в УФ- и видимой областях. Как видно на рис. 1.1, значительное поглощение наблюдается в области 700-760 нм для образцов, синтезированных при рН 3.5, 3,7 и 3,9, что свидетельствует об образовании полярона, а соответственно и электропроводящего полианилина. Это позволило сделать нам вывод о том, что лакказа способна катализировать полимеризацию анилина в присутствии СПС с образованием электропроводящего полианилина в мягких условиях в отличие от традиционного химического метода (в 1 М НС1 или H2S04 [90, 91]).
Сравнение спектров образцов полианилина, представленных на рис. 1.1, продемонстрировало, что положение длинноволнового пика зависит от условий синтеза. Было также отмечено, что для полианилина, полученного при проведении полимеризации при рН 3.7, когда наблюдаются наиболее благоприятные условия для электростатического взаимодействия полианилина с СПС, наблюдается наибольший батохромный эффект для длинноволнового пика, что указывает на увеличение степени допированности полученного полианилина. В связи с этим, дальнейшие эксперименты по синтезу полианилина в присутствии лакказы проводились при рН 3.5.
При ферментативной полимеризации анилина в присутствии лакказы молекула анилина выполняет роль восстановителя, тогда как окислителем является молекулярный кислород, растворенный в реакционной среде. Его концентрация приблизительно равна 0.2 мМ. В процессе полимеризации анилина кислород должен потребляться, а скорость реакции соответственно падать. В этом случае перемешивание реакционной среды может существенно отразиться на ходе реакции. Для сравнения была проведена ферментативная полимеризация анилина с и без перемешивания. Для оценки эффективности синтеза полианилина регистрировалось изменение оптической плотности при 400 нм. Причины, по которым данная длина волны была выбрана для слежения за изменением концентрации полианилина, будут обсуждены ниже (глава 1.2). Как видно из кинетических кривых, приведенных на рис. 1.2 (А), при перемешивании наблюдается повышение скорости реакции, причем это повышение связано не только с улучшением массопереноса реагирующих веществ в среде, а скорее всего с созданием постоянной концентрации 02 в ходе всей реакции.
Важным параметром для препаративного ферментативного синтеза полианилина является стабильность лакказы, которая и была изучена в условиях синтеза. Из рисунка 1.2 (Б) видно, что реакция полимеризации анилина продолжается в течение 4-5 дней, что говорит о том, что в течение этого периода времени лакказа в условиях изучаемой реакции остается активной. Таким образом, кислотостабильность грибной лакказы во много раз выше превышает стабильность ПХ, что говорит о предпочтительности ее использования в ферментативном синтезе полианилина.
Увеличение концентрации анилина в реакционной среде до 75 мМ приводит к увеличению скорости ферментативной полимеризации анилина (рис. 1.3). Однако дальнейшее повышение концентрации анилина приводит к субстратному ингибированию лакказы. Несмотря на то, что наивысшая скорость синтеза наблюдается при концентрации анилина, равной 75 мМ, все же дальнейшие эксперименты нами проводились с использованием 50 мМ анилина. Это было связано с тем, что при проведении реакции полимеризации с концентрацией анилина, равной 75 мМ, конечный продукт реакции был довольно вязким, что затрудняло проведение экспериментальной работы.
Влияние концентрации СПС в реакционной среде на ферментативную полимеризацию анилина представлено на рис. 1.4. С увеличением концентрации СПС происходит снижение скорости реакции полимеризации. Для объяснения этого эффекта было высказано три версии. Первое предположение заключалось в том, что снижение скорости было вызвано понижением концентрации растворенного кислорода в концентрированных растворах СПС. Однако, измерение концентрации 02 с помощью электрода Кларка показало, что концентрация 02 не различается для растворов с разным содержанием СПС. То есть присутствие СПС при используемых концентрациях этого полимера не влияет на растворимость кислорода в реакционной смеси.
Другой возможной причиной снижения скорости полимеризации анилина с увеличением концентрации СПС может быть падение ферментной активности лакказы при высоких концентрациях СПС. Для проверки второго предположения был проведен эксперимент по определению ферментативной активности лакказы, измеренной по пирокатехолу, в присутствии разных концентраций СПС. Как оказалось, скорость окисления пирокатехола не изменялась при варьировании концентрации СПС, что свидетельствовало об отсутствии влияния СПС на активность лакказы.
