Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Матрично-активированная лазерная десорбционно/ /ионизационная (МАЛДИ) масс-спектрометрия биомакромолекул 11
1.1.1. Общие принципы масс-спектрометрии. Способы десорбции/иониз ации 11
1.1.2. Принцип метода МАЛДИ 13
1.1.3. Масс-анализаторы в МАЛДИ масс-спектрометрии. Времяпролетный (ВП)-анализатор 14
1.1.4. Матрицы для МАЛДИ масс-спектрометрии 19
1.1.5. Качество МАЛДИ масс-спектра и его характеристики 19
1.2. Пробоподготовка белково-пептидных смесей для МАЛДИ МС анализа 27
1.2.1. Общие моменты в пробоподготовке аналитов для МАЛДИ МС анализа 27
1.2.2. Матрицы для МАЛДИ МС анализа белково-пептидных смесей 28
1.2.3. Подготовка белково-пептидных образцов для получения качественных МАЛДИ масс-спектров 32
1.3. Использование МАЛДИ масс-спектрометрии для анализа белков и пептидов 41
1.3.1. Идентификация белков с помощью картирования пептидных масс 42
1.3.2. Обоснование посттрансляционных модификаций белка с известной аминокислотной последовательностью 46
1.3.3. Применение МАЛДИ МС в диагностике 48
1.3.4. Вычислительные инструменты для МАЛДИ МС анализа белков 49
1.3.5. Проблемы МАЛДИ МС анализа продуктов реакций протеолиза 51
1.4. Структура бычьего фибриногена и коллагена типа I. Биохимические подходы к исследованию их протеолиза 56
1.4.1. Бычий фибриноген 56
1.4.2. Коллаген типа I 60
2. Экспериментальная часть 70
2.1 .Материалы 70
2.2. Ферментативный гидролиз коллагена типа I и бычьего фибриногена
2.2.1. Гидролиз коллагена типа I 71
2.2.2. Гидролиз бычьего фибриногена 72
2.3. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 72
2.4. Трипсинолиз белков из геля 73
2.5. Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа 74
2.6. Получение МАЛДИ масс-спектров 75
2.7. Очистка полученных масс-спектров 76
2.8. Обработка очищенных масс-спектров 79
3. Результаты и их обсуждение 85
3.1. Изучение механизма протеолиза бычьего фибриногена МАЛДИ масс-спектрометрическим картированием триптических пептидов высокомолекулярных продуктов реакции 85
3.1.1. Выбор модельного белка 85
3.1.2. Условия получения гидролизатов бычьего фибриногена 94
3.1.3. Подбор условий для получения качественных масс-спектров триптических пептидов фрагментов бычьего фибриногена 95
3.1.4. Исследование механизма протеолиза бычьего фибриногена изоформой СКП-2 с помощью МАЛДИ масс-спектрометрии 100
3.2. Скрининг коллагеназ при помощи МАЛДИ масс- спектрометрических «фингерпринтов» продуктов протеолиза коллагена типа I 110
3.2.1. Условия получения гидролизатов коллагена типа I 110
3.2.2. Подбор условий для получения качественных масс-спектров гидролизатов коллагена типа I 116
3.2.3. Сравнительный анализ масс-спектров гидролизатов, полученных в результате обработки коллагена типа I ферментами разных классов 129
Выводы 139
- Пробоподготовка белково-пептидных смесей для МАЛДИ МС анализа
- Проблемы МАЛДИ МС анализа продуктов реакций протеолиза
- Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа
- Скрининг коллагеназ при помощи МАЛДИ масс- спектрометрических «фингерпринтов» продуктов протеолиза коллагена типа I
Введение к работе
Исследование реакций протеолиза, как правило, сопряжено с решением двух основных вопросов — установлением механизма расщепления белкового субстрата и выяснением специфичности действия протеиназы. Традиционным биохимическим подходом для решения этих вопросов является разделение продуктов реакции (с помощью, например, электрофореза или жидкостной хроматографии) с их последующим анализом (определение молекулярной массы, распределение той или иной метки, иммуноблоттинг, секвенирование и т.д.).
Появление методов мягкой ионизации (электроспрей (ЭС) и матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ)) дало толчок бурному развитию масс-спектрометрии биомакромолекул. Эти методы ионизации сделали возможным переводить большие и чрезвычайно лабильные биомолекулы в газовую фазу и ионизировать их без деструкции. Преимуществом МАЛДИ относительно ЭС является формирование, в основном, однозарядных ионов - таким образом, спектр МАЛДИ белково-пептидных смесей дает возможность определить их качественный состав и массы входящих в них компонентов. Немаловажным фактором также является относительная толерантность метода МАЛДИ к присутствию в анализируемых образцах низкомолекулярных добавок (соли, детергенты, компоненты буферных растворов и т.п.), а так же высокая чувствительность и экспрессность метода.
Изучение возможностей МАЛДИ МС для анализа продуктов протеолиза сложных белковых субстратов, расширяющее использование самого метода, является актуальной задачей. Так, трипсинолиз белка с последующим получением спектра МАЛДИ триптических пептидов («фингерпринта» или «отпечатков пальцев»), которое также называется МАЛДИ-картированием, с его идентификацией по существующим базам данных является в настоящее время рутинной процедурой. С нашей точки зрения аналогичный подход весьма перспективен для изучения механизма протеолиза белков.
Предполагаемый алгоритм эксперимента в этом случае должен включать в себя проведение протеолиза белкового субстрата конкретной протеиназой, отбор проб через определенные промежутки времени, гель-электрофорез проб в денатурирующих условиях (ДДС-гель-электрофорез), трипсинолиз полученных полос, соотнесение полученных в масс-спектре пиков с теоретическими триптическими пептидами исходного белка и определение их положения в полипептидной цепи. Наложение идентифицированных пептидов, а так же массы вычисленной из гёль-электрофореграммы полосы на аминокислотную последовательность белка дает представление о том, какому участку исходной молекулы субстрата принадлежит данный высокомолекулярный продукт протеолиза. Подобный анализ всех полос электрофореграммы в динамике процесса покажет, какие участки белковой молекулы и каким образом подвергаются протеолизу с течением времени. Данный подход реализуем, если степень перекрывания масс триптических пептидов исходного субстрата в пределах определенной погрешности не очень велика. В настоящей работе в качестве модельного белкового субстрата был выбран бычий фибриноген.
Для расщепления белков, помимо трипсина, используют и другие агенты. При этом в зависимости от специфичности действия той или иной протеиназы образующиеся из одного и того же белкового субстрата МАЛДИ «фингерпринты» сильно различаются между собой. В связи с этим возникает вопрос: возможно ли решение обратной задачи? Можно ли делать какие-либо выводы относительно специфичности действия протеиназ на основе «фингерпринта» продуктов протеолиза, если в качестве субстрата взять один и тот же белок?
Особенно остро этот вопрос стоит при скрининге коллагеназ. Коллагеназы имеют широкое применение в различных отраслях биотехнологии, медицины, промышленности. В зависимости от типа каждого конкретного применения используются различные коллагеназы.
Благодаря особенностям строения и наличию большого количества внутримолекулярных водородных связей и дополнительных межмолекулярных ковалентных поперечных сшивок, коллаген проявляет высокую устойчивость к действию протеолитических ферментов. Тем не менее коллагеназы способны разрушать нативный коллаген при физиологических условиях. Коллагеназы различаются строением активного центра и типом действием на коллаген. Можно ожидать, что набор продуктов гидролиза коллагена будет зависеть от специфичности действия конкретной коллагеназы.
Безусловно, для полной характеристики действия фермента на коллаген необходим анализ первичной структуры продуктов протеолиза, что требует проведения тандемного масс-спектрометрического эксперимента. Однако в случае коллагена масс-спектрометрическое секвенирование пептидов затруднено. Поэтому анализ действия коллагеиаз различных классов на коллаген типа І в данной работе был проведен на основе сравнения МАЛДИ «фингерпринтов» продуктов реакций коллагенолиза без использования тандемной масс-спектрометрии.
Следует отметить, что условия проведения биохимических реакций в целом и протеолиза в частности накладывают серьезные ограничения на получение качественных и достоверных МАЛДИ масс-спектров белково-пептидных смесей. Наличие в образце низкомолекулярных добавок (соли, компоненты буферных растворов, детергенты и т.д.) обычно приводит к уменьшению интенсивности пиков молекулярных ионов исследуемых веществ. Тем не менее, при правильном и тщательном подборе условий пробоподготовки удается получить масс-спектры даже таких сложных систем, как биологические жидкости.
Таким образом, отработка условий пробоподготовки образцов для получения воспроизводимых и качественных МАЛДИ масс-спектров и увеличения выходов сигналов (выбор оптимальной матрицы, способа нанесения образца на мишень,
процедур отмывки и рекристаллизации, варьирования мощности лазерного выстрела, а также самой подложки-мишени) является отдельной задачей в любом исследовании белково-пептидных смесей методом МАЛДИ масс-спектрометрии.
Целью настоящей работы явилось изучение новых возможностей метода МАЛДИ для определения механизма реакций протеолиза высокомолекулярных белковых субстратов на примере бычьего фибриногена, а также первичного скрининга коллагеназ (выяснение специфичности действия коллагенолитических ферментов разных классов на коллаген).
В работе решались следующие задачи:
Выбор модельного белка для изучения механизма его протеолиза методом МАЛДИ-картирования высокомолекулярных продуктов реакции. Изучение возможности применения МАЛДИ-картирования высокомолекулярных продуктов протеолиза для установления механизма расщепления бычьего фибриногена изоформой сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба.
Отработка процедуры пробоподготовки реакционных смесей в ходе протеолиза белковых субстратов с целью получения воспроизводимых и качественных спектров МАЛДИ и увеличения выхода сигналов.
Проведение сравнительного анализа спектров МАЛДИ гидролизатов коллагена, полученных под действием коллагеназ разных классов. Изучение возможности первичного скрининга коллагеназ по МАЛДИ «фингерпринтам» продуктов гидролиза коллагена.
Пробоподготовка белково-пептидных смесей для МАЛДИ МС анализа
Выбор матрицы и оптимизация протокола пробоподготовки до сих пор является эмпирической процедурой [77]. В идеальной пробоподготовке должен получиться гомогенный слой маленьких кристаллов матрицы, содержащих твердый раствор аналита. Если образец матрицы содержит больше негомогенностей, как показано на рис. 1.3, сдвиг масс увеличивается, разрешение уменьшается, и отнесение верной массы становится сложнее. В этом случае требуется суммировать намного больше спектров, чтобы компенсировать статистическую ошибку. В традиционной процедуре пробоподготовки раствор анализируемого вещества в растворителе, который хорошо смешивается с растворителем матрицы, добавляется к рабочему раствору матрицы [45]. Молярное соотношение матрица/анализируемое вещество должно составлять от 100:1 до 50 000:1 и оптимизироваться для каждого нового образца. После получения гомогенного раствора 0,5-2 мкл смеси наносится на специальную плашку из нержавеющей стали (мишень) и высушивается при атмосферном давлении на воздухе [78]. Во время высушивания происходит кристаллизация матрицы с включением молекул анализируемого вещества в кристаллическую решётку. Образование и размер кристаллов в значительной мере зависят от природы матрицы и в меньшей степени от природы анализируемого вещества, поскольку количество последнего значительно меньше. Одну из ключевых ролей при нанесении образца играет состав растворителя, так как последний предопределяет скорость кристаллизации по мере высыхания капли, гомогенность образующегося слоя кристаллов и его толщину. Медленная кристаллизация матрицы позволяет уменьшить эффект присутствия нелетучих примесей [79]. Несмотря на то, что Хорнефером и соавторами было обнаружено равномерное распределение флуоресцентно меченного аналита в кристаллах матриц методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии [80], тем не менее, зачастую масс-спектры из разных мест мишени получаются различные, т.е. наблюдаются так называемые «сладкие пятна» («sweet spots») — места на мишени, из которых получаются устойчивые масс-спектры, в то время как в других местах они не наблюдаются.
Поиск «сладких пятен» требует ручного вмешательства и активного контроля экспериментатора, вот почему большинство МАЛДИ приборов оборудованы системой микроскопного наблюдения. 1.2.2. Матрицы для МАЛДИ МС анализа белково-пептидных смесей. Количество используемых матриц в МАЛДИ масс-спектрометрии велико (таблица 1.3). Однако для анализа белково-пептидных смесей используются лишь некоторые из них. Наибольшее применение нашли а-циано-4-гидроксикоричная кислота (НССА), синапиновая кислота (SA) и дигидроксибензойная кислота (DHB). Все матрицы имеют различные плюсы и минусы (таблица 1.4). Матрица НССА рассматривается как «тяжёлая» матрица, поскольку молекулы анализируемого соединения получают много внутренней энергии в процессе десорбции и ионизации. Однако снижение мощности лазерного импульса и уменьшение молекулярной массы анализируемого вещества позволяет практически полностью исключить фрагментацию, поэтому НССА обычно используется для пептидов в диапазоне низких молекулярных масс [81]. Главное преимущество НССА - способность формироватьмаленькие гомогенные кристаллы, что обычно даёт хорошее разрешение в получаемых масс-спектрах. Эта матрица хорошо растворяется в органических растворителях в водно-органических смесях и плохо растворима в воде, поэтому образцы могут быть отмыты водой непосредственно на мишени. Синапиновая кислота чаще всего используется при анализе белков больших молекулярных масс. Она также нерастворима в воде, но хорошо растворима в органических растворителях. В сравнении с НССА эта матрица «мягче». Ионы анализируемого вещества получают меньше внутренней энергии и количество фрагментации уменьшается, делая эту матрицу более подходящей для измерения белков. Синапиновая кислота также может формировать маленькие кристаллы. Однако синапиновая кислота имеет склонность образовывать аддукты с ионами анализируемого соединения. Матрица DHB применяется для исследования пептидов, гликопротеинов и гликанов. В отличие от НССА и синапиновой кислоты она растворима в воде так же хорошо, как и в органических растворителях. Основной недостаток DHB заключается в том, что она формирует большие иглообразные кристаллы. Это означает, что геометрия образца меняется от пятна к пятну на мишени. Если спектры суммируются от различных пятен, разрешение при использовании этой матрицы значительно ниже, чем у спектров, полученных при ЫССА-подготовке. На стальной мишени образцы DHB формируют кольца из кристаллов. Хорошие пептидные спектры обычно получаются только от краев капель, нанесённых на мишень.
Главным достоинством DHB для МАЛДИ ВП МС анализа пептидов является тот факт, что эта матрица более толерантна по отношению к примесям (соли или детергенты), чем другие матрицы. Для того чтобы нивелировать недостатки отдельных матриц, предпринимались попытки их комбинирования. Хороший результат, напрмер, получается при комбинации НССА и DHB в методе «высушенной капли» [82]. Такая пробоподготовка увеличивает гомогенность кристаллов (рис. 1.7) и повышает среднее отношение сигнал/шум в получаемых масс-спектрах (таблица 1.5). Также пробоподготовка со смесью матриц дает спектры высокого качества для белков в диапазоне масс 10-80 кДа (рис. 1.8). Улучшение гомогенности кристаллов матрицы может быть достигнуто и при введении некоторых добавок в смесь для кристаллизации [83-85]. Так, смесь DHB и 2-гидрокси-5-метоксибензойной кислоты («cynep-DHB), обеспечивает лучшее соотношение сигнал/шум и большую точностью определении масс пептидов [86]. Описано также увеличение выхода ионов в МАЛДИ при добавлении к DHB 5-метоксисалициловой кислоты или фукозы [87]. Вносимые в матрицы добавки обеспечивают большую однородность образующейся поверхности и, как следствие, повышают воспроизводимость спектра по всей площади образца. В пробоподготовке белково-пептидных образцов для получения качественных масс-спектров решается ряд проблем. Основной из них является получение гомогенного слоя кристаллов матрицы. Другая проблема - уменьшение влияние солей и низкомолекулярных веществ на качество масс-спектров. Остальные проблемы включают в себя концентрацию анализируемых веществ и размер пятна образца на мишени. Как было сказано в разд. 1.1.2., МАЛДИ МС анализ осуществляется путем десорбции вещества с мишени под действием лазерного импульса и дальнейшей ионизации вещества. Стандартная простейшая мишень представляет собой металлическую пластину, разделенную на рабочие площадки диаметром «3-4 мм. На эти площадки наносится смесь раствора анализируемого соединения и матрицы. После высыхания капля образует пятно размером 5-15 мм2. Существуют несколько стандартных способов нанесения раствора матрица-аналит на такую мишень.Наиболее распространенным методом нанесения является метод «высушенной капли» первоначально описанный Карасом в 1988 году [41]. В этом методе раствор анализируемого соединения смешивается в одинаковых количествах с раствором матрицы, эта смесь наносится на мишень и высушивается при комнатной температуре. В качестве растворителя для матрицы обычно используется смесь: ацетонитрил - 0,1% водный раствор ТФУ (3:7 v/v). Такой метод дает относительно неравномерное распределение вещества на мишени: большие кристаллы и пустые участки на поверхности мишени (см. рис. 1.9а). Однако, если «сладкое пятно» найдено в образце, большое количество лазерных выстрелов могут быть сделаны в это пятно.
Проблемы МАЛДИ МС анализа продуктов реакций протеолиза
Основной проблемой МАЛДИ МС является появление в масс-спектрах пиков, не относящихся к пикам ионов исследуемой белково-пептидной смеси. Причины появления посторонних пиков могут быть различны и связаны с теми или иными моментами получения масс-спектра. Так, метод МАЛДИ МС подразумевает использование органической матрицы для десорбции и ионизации биомакромолекул (см. разд. 1.1.2). Вместе с ионами анализируемого соединения в детектор попадают и ионы матрицы. Обычно матрица не дает пики кластеров в диапазонах выше 500. Однако при наличии солей, пики ионов матричных кластеров могут быть достаточно интенсивны вплоть до значений m/z 1500 [118]. Наличие большого количества солей также может вызвать появление посторонних пиков в спектре, обусловленных аддуктами анализируемых соединений с ионами металлов. На рис. 1.16 показан пример спектра стандартной смеси пептидов в присутствии 200 мМ солей [119]. На рисунке видно, что пики, обусловленные аддуктами [М+ Na]+ и [М+К] , достигают почти 100% интенсивности пиков пептидов. Поэтому желательно избавляться от солей, например, отмывкой образов на мишени (см. разд. 1.2.3). Достоверность получаемого масс-спектра зависит также от мощности лазерного импульса и места на мишени, куда направляется луч лазера (рис. 1.17). Так, в масс-спектре, при более мощном лазерном импульсе в место, за границами пятна, присутствуют только матричные кластеры (рис. 1.17а). При менее мощном выстреле в край пятна начинают появятся пики исследуемых триптических пептидов, однако сильно обогащенные пиками матрицы (рис. 1.17Ь). При выстреле лазером с мощностью в 3 раза меньшей, чем в первом случае, во внутрь пятна, в масс-спектре присутствуют уже только лишь пики исследуемых пептидов с примесью пиков автолиза трипсина (рис. 1.17с). Автолиз протеазы, применяемой для получения набора пептидов конкретного белка, служит еще одним источником появления посторонних пиков в МАЛДИ масс-спектрах. Именно поэтому применение МАЛДИ МС в протеомике предполагает использование особо чистых реактивов. Так в традиционном методе трипсинолиза все растворители, матрицы и буферы должны быть специальной чистоты "mass spectrometric grade" или "proteomics grade", в том числе и деионизованная вода.
И даже используемый трипсин специально обрабатывают (восстановительно метилируют остатки лизина) для того, чтобы предотвратить его автолиз [120], и, тем самым избавиться от дополнительных пиков в масс-спектрах. Однако даже в таких сверхчистых системах при проведении процедуры протеолиза белков зачастую не удается избежать попадания в пробу частичек кожи и волос, состоящих в основном из различных кератинов. Присутствие этих белков приводит к появлению посторонних пиков в масс-спектрах исследуемых гидролизатов. Конечно, продукты трипсинолиза кератинов идентифицированы по молекулярным массам [121]. Тем не менее пики, соответствующие данным массам, должны быть исключены из масс-спектров при обработке результатов трипсинолиза того или иного белка. Более того, авторами работы [122] было проведено сравнение более 100 масс-спектров трипсинолизатов различных белков. Ими было выявлено некоторое количество пиков, присутствующих в различных масс-спектров, которые не могли быть отнесены к какому-либо источнику белкового загрязнения пробы (11% от общего количества пиков загрязнений). Тем не менее, эти массы также должны быть исключены из рассмотрения для большей достоверности получаемых результатов. Несмотря на проблему, связанную с загрязнением МАЛДИ масс-спектров посторонними пиками, в сверхчистых системах обычно удается добиваться хорошей воспроизводимости результата. При переходе к реальным биохимическим системам протеолиза получение качественных и достоверных масс-спектров продуктов реакции заметно усложняется. Реакционная смесь в данном случае обязательно содержит компоненты буферных растворов, часто присутствуют соли и детергенты. Все эти соединения, сокристаллизуясь в образце, могут влиять на качество получаемого масс-спектра. Так, присутствие катионов может приводить к образованию аддуктов с молекулярными ионами пептидов (рис. 1.16). Компоненты буферных растворов уменьшают интенсивность пика основного сигнала, т.е. ухудшают соотношение сигнал/шум для данного пика. В качестве примера в таблице 1.7 представлены результаты влияния концентрации различных буферов на интенсивность основного сигнала бычьего инсулина (по данным [123]). Из таблицы видно, что при определенной концентрации, для каждого буфера разной, происходит полное гашение сигнала аналита. Наименьшее влияние оказывает ТРИС (при 20 мМ интенсивность сигнала инсулина примерно равна интенсивности сигнала без буфера), тогда как в растворе с фосфатным буфером уже при 2мМ происходит полное гашение сигнала. Наличие детергентов в растворе анализируемого соединения также обычно ухудшает качество спектра [124].
Существует еще одна проблема в регистрации масс-спектров пептидных смесей. Теоретически можно предположить, что интенсивности пиков молекулярных ионов должны быть пропорциональны концентрации соответствующих пептидов в образце. Однако в МАЛДИ масс-спектрах это далеко не всегда так. Во-первых, эффективностьиопизации различных пептидов может варьироваться в пределах нескольких порядков. Так, например, аргинин-содержащие пептиды ионизируются гораздо лучше по сравнению с аргинин-лишенными [125]. Во-вторых, зачастую не детектируются минорные компоненты смеси [103]. В-третьих, некоторые пептиды, дающие четкие пики молекулярного иона в индивидуальном состоянии, не детектируются в составе пептидной смеси. Причины такого смещения эффективности ионизации (эффектов подавления) еще подлежат установлению. Данные этого раздела ясно показывают, что условия проведения биохимических реакций накладывают серьезные ограничения на получение качественных и достоверных МАЛДИ масс-спектров белково-пептидных смесей. Более того, становится понятным, что выбор оптимальной матрицы, способа нанесения образца на мишень, процедур отмывки или рекристаллизации, варьирования мощности лазерного выстрела, а также самой подложки-мишени для МАЛДИ масс-спектрометрического анализа, является очень сложной и трудоемкой задачей, не гарантирующей при этом достижения успешного результата. Тем не менее, при правильном и тщательном подборе условий пробоподготовки удается получить масс-спектры даже таких сложных систем, как биологические жидкости (см. разд. 1.3.3). Фибриноген - это находящийся в крови гликопротеин с молекулярной массой около 340 кДа [126]. Основная функция фибриногена — участие в свертывании крови: после отщепления тромбином от фибриногена фибринопептидов А и В образуется растворимый фибрин-мономер, который далее полимеризуется в фибриновый сгусток, составляющий основу тромба [127]. Молекула фибриногена представляет собой симметричный димер сложного пространственного строения (Рис. 1.18а). Каждый из мономеров состоит из 3 полипептидньтх цепей - Аа, Вр и у. Димерная структура фибриногена (центр молекулы, Е-домен) формируется междоменными дисульфидными связями между остатками Cys50 Аа-цепей и остатками Cys 32 и Cys 33 у-цепей (Рис. 1.186, нумерация у-цепи по последовательности незрелого белка, с сигнальным пептидом).
Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа
При использовании методики «тонкого слоя» насыщенный раствор матрицы НССА готовили в ацетоне. В данном методе сначала на мишень наносили 1-2 мкл раствора матрицы в ацетоне, и после испарения ацетона наносили 1-2 мкл раствора анализируемой смеси. В методе «высушенной капли» 1-2 мкл смеси насыщенного раствора матрицы с раствором анализируемой смеси (v/v: 2/1;1/1;1/2;1/10) наносили на стальную плашку- мишень и высушивали на воздухе. Насыщенные растворы матриц готовили в смеси ацетонитрила с 0,1%-м водным раствором трифторуксусной кислоты (v/v: 1/2) на ультразвуковой бане. Так же в этом методе использовалась смесь растворов матриц НССА и DHB в соотношении 1:1 по объему. Исходные растворы матриц в концентрации 20 мг/мл готовили в смеси ацетонитрила с 0,1%-ным водным раствором ТФУ (7:3 по объему). Метод «двойного слоя» является комбинацией первых двух методов. Сначала на мишень наносится 1-2 мкл насыщенного раствора матрицы в ацетоне. После испарения ацетона наносили 1-2 мкл смеси (v/v: 2/1;1/1;1/2;1/10) раствора анализируемой смеси с насыщенным раствором матрицы, приготовленном в смеси ацетонитрила с 0,1%-м водным раствором трифторуксусной кислоты (v/v: 1/2) на ультразвуковой бане. Для очистки образцов от солей и компонентов буферного раствора использовалась процедура отмывки на мишени. На закристаллизованный образец помещали каплю (15 мкл) 0,1% водного раствора трифторуксусной кислоты и через несколько секунд аккуратно удаляли раствор автоматической пипеткой. В эксперименте по нанесению образцов на анокор-чип использовали метод «высушенной капли». На анкор-чип наносили 1 мкл смеси насыщенного раствора матрицы НССА с раствором анализируемой смеси (v/v 1/1). II.6. Получение МАЛДИ масс-спектров. Спектры МАЛДИ регистрировались в режиме замедленной экстракции ионов на времяпролетном приборе Autoflex II компании Bruker Daltonics, оборудованном азотным лазером с рабочей длиной волны 337 нм и рефлектроном в качестве анализатора масс.
Все измерения проводились в режиме положительно заряженных ионов, которые вытягивались из области ионизации ускоряющим напряжением 19 кВ. Для калибровки прибора в диапазоне низких (до 2,5 кДа), средних (до 12 кДа) и высоких (до 60 кДа) молекулярных масс использовались стандартные смеси фирмы "Bruker Daltonics", Германия. Для получения конечного спектра каждой исследуемой пробы накапливалось 200-300 индивидуальных спектров. П.7. Очистка полученных масс-спектров. Обработка полученных масс-спектров с помощью программы Bruker DataAnalysis, Version 1.6g ((C) Bruker Daltonik GmbH, 1999) позволяет получать следующие характеристики пиков: m/z, абсолютная интенсивность в приборных единицах, отношение сигнал/шум, разрешение. Очистка масс-спектров проводилась вручную. На первом этапе из масс-спектров исключали пики, не имеющие характерного для молекулярных ионов пептидов набора изотопных пиков (такие пики обычно являются случайным выбросом прибора). Характерный вид пика и случайного выброса прибора приведен на рис. II. 1. На втором этапе исключали пики с соотношением сигнал/шум менее 5. В качестве примера на рис. II.2 приведен масс-спектр гидролизата коллагена под действием препарата из Dermestes Maculatus в интервале m/z от 900 до 2800 (рис. П.2а) и от 2210 до 2260 (рис. 11.26). Из трех выделенных программой пиков только один (m/z = 2216,375) удовлетворяет поставленным требованиям (отношение сигнал/шум 14,9). Пики с m/z 2245,341 (отношение сигнал/шум 1,8) и m/z 2255,366 (отношение сигнал/шум 1,8) поставленному критерию не удовлетворяют и в дальнейшем рассмотрении не учитывались. После этого масс-спектры очищались от матричных пиков и пиков перекрестных загрязнений (см. разд. 1.3.5). В очищенных масс-спектрах для каждого сигнала из набора изотопных пиков молекулярного иона выбирали пики, соответствующие моноизотопной массе [191]. Набор полученных масс использовали в дальнейшем для работы с базами данных. Полученные очищенные масс-спектры, при необходимости подвергались дополнительной обработке для получения нормировочных спектров. Нормировка проводилась по наиболее интенсивным пикам в каждом спектре (интенсивность этих пиков принималась за 100%, все остальные пики - доля от интенсивности максимального пика в процентах). II.8. Обработка очищенных масс-спектров. Идентификацию белков по наборам масс триптических пептидов производили с помощью программы MASCOT (http://www.matrixscience.com/cgi/search form.pl FORMVER=2&SEARCH=PMF). Интерфейс программы MASCOT показан на рис. II.3. В поле "Query" вводятся массы триптических пептидов. В качестве гидролизующего агента задан трипсин. Варьируемыми параметрами являются: база данных, относительно которой ведется поиск, и максимально допустимое число пропущенных расщеплений. Остальные параметры - по умолчанию.
Типичные результаты работы программы представлены на рис. Н.4 на примере трипсинолиазтов ВВ-цепи фибриногена. Найденные в базе последовательности белков представляются в виде списка, сортированного по величине «очков» (score). Программа выдает код в соответствующей базе данных найденного белка, массу белка, величину score, количество совпавших значений масс и название белка. Так для первой аминокислотной последовательности код - gil 19908847, рассчитанная молекулярная масса - 56405, score — 87, количество совпавших значений масс — 12, название белка — «similar to Fibrinogen beta chain precursor [Bos taurus]». Для обработки результатов трипсинолиза фрагментов фибриногена применяли программу PeptideMass (интерфейс программы представлен на рис. II.5). В верхнее поле вводится аминокислотная последовательность полипептидной цепи (в однобуквенном коде. Параметры в следующем поле определяют массы пептидов. Эти параметры задают возможные модификации пептидов, в том числе аддукты с акриламидом, протоном, а также массу: среднюю или моноизотопную. Дальше выбирается гидролизующий агент (в нашем случае трипсин), максимально допустимое число пропущенных расщеплений, нижняя граница масс пептидов и их сортировка: по массам или по порядку расположения в гидролизуемой полипептидной цепи. По заданным параметрам программа PeptideMass проводит теоретическое расщепление введенной амнокислотной последовательности трипсином (по связям, образованным аргинином (R) или лизином (К) с С-конца). Результатом работы программы является набор триптических пептидов со следующими характеристиками: масса, аминокислотная последовательность, позиция в цепи белка, количество пропущенных расщеплений. Сравнение экспериментальных и теоретических данных проводили следующим образом. Каждую массу из очищенного масс-спектра триптических пептидов той или иной полосы геля сравнивали с массами теоретических пептидов каждой из цепей фибриногена. При совпадении значений масс в пределах ±0,3 Да пику в масс-спектре трипсинолизата присваивали соответствующую аминокислотную последовательность и позицию в той или иной цепи фибриногена (таблица II. 1).
Скрининг коллагеназ при помощи МАЛДИ масс- спектрометрических «фингерпринтов» продуктов протеолиза коллагена типа I
Как говорилось в разделе 1.4.1, среди коллагеназ наиболее изучены представители трех классов протеолитических ферментов: цистеиновые, сериновые и металлоколлагеназы. Исходя из этого, в настоящей работе для получения гидролизатов коллагена с целью их дальнейшего анализа с помощью масс-спектрометрии, были использованы ферментные препараты, содержащие коллагеназы разных классов. Продажный препарат Клостридиопептидаза А из Clostridium histolyticum является металлоколлагеназой. Согласно литературным данным ферментные препараты из Serratia proteomaculans [187], Dermestes frischi [184] и Dermestes maculatus [188] в качестве основного активного коллагеназного компонента имеют в своём составе различные цистеиновые коллагеназы. Основным коллагеназным компонентом фракции ферментов, полученной путем ионообменной хроматографии препарата «Морикраза» из Paralithodes camtschatica, является сериновая коллагеназа PC [189]. В таблице Ш.4 указаны рН-оптимум активности и отношение к присутствию ионов Са используемых в работе коллагеназ. Для проведения коллагенолиза был выбран коллаген типа I из хвостов крыс (далее по тексту коллаген) поскольку, именно этот тип коллагена гидролизуется большинством коллагеназ и является наиболее распространённым. На первом этапе работы были произведены эксперименты по выбору условий проведения коллагеназных реакций. В результате проведенных экспериментов были выбраны следующие условия. Значение рН реакционной среды было решено зафиксировать на величине 7,5. Выбранное значение рЫ лежит в области рН-оптимума всех использованных препаратов коллагеназ. Подбор температуры осуществляли при помощи отрицательного контроля (расщепление коллагена трипсином). Как говорилось в разд. 1.4.2, следует различать коллагеназную и коллагенолитическую активность.
Трипсин не обладает коллагеназной активностью (не способен расщеплять коллаген в его нативной трехспиральной структуре), но способен к некоторому расщеплению индивидуальных цепей коллагена после его плавления, т.е. обладает коллагенолитической активностью. Поскольку задачей настоящей работы было изучение именно коллагеназной активности, в качестве оптимальной выбирали максимальную температуру, при которой коллагенолитическая активность трипсина не проявляется. Если при 22С коллагенолитическая активность полностью отсутствовала (см. рис. III.9), то при повышении температуры на электрофореграммах реакционных смесей начинали появляться полосы низкомолекулярных продуктов. Таким образом температуру проведения коллагенолиза зафиксировали на величине 22С. Согласно литературным данным (таблица Ш.4) ряд использованных нами ферментных препаратов требует наличия в реакционной среде ионов Са2+. Ввиду того, что наличие солей в образце может сильно влиять на качество масс-спектров гидролизатов (см разд. 1.3.5), было решено проверить коллагеназную активность препаратов в отсутствии ионов кальция. В качестве примера на рис. ШЛО приведены результаты исследования коллагеназной активности препарата коллагеназы Dermestes frischi в присутствии и в отсутствие 2,5 мМ ионов Са2+. Из рисунка видно, что после инкубации коллагена с препаратом коллагеназы Dermestes frischi происходит уменьшение количеств а-, Р-, у-цепей коллагена по сравнению с контролем (дорожка 3 на рис. ШЛО), и некоторое накопление продуктов гидролиза а-цепей коллагена (cti 3/4). При этом в отсутствие ионов кальция способность коллагеназы Dermestes frischi гидролизовать /3- и -цепи коллагена падает, хотя некоторое накопление продуктов гидролиза а-цепей коллагена наблюдается (дорожка 1 на рис. ШЛО). В то же время клостридиопептидаза А полностью теряла коллагеназную активность в отсутствии ионов Са2+. Таким образом, наличие ионов Са2+ в реакционной среде является необходимым условием для проявления некоторыми ферментными препаратами коллагеназной активности (концентрация 2,5 мМ была выбрана согласно литературным данным [196]). Необходимость наличия ионов Са+ в реакционной среде не позволяет использовать для поддержания рН аммиачно-гидрокарбонатный буфер, рекомендуемый при подготовке образцов белково-пептидных смесей для поулчения МАЛДИ масс-спектров. Как говорилось выше (см разд. 1.3.5), компоненты буферных растворов сильно снижают интенсивность пиков молекулярных ионов. В этой связи в качестве буфера был выбран Трис-НС1 (50 мМ), который оказывает наименьшее влияние на интенсивность пиков белков и пептидов в масс-спектрах (см. таблицу 1.7). Время реакции - 24 часа, было выбрано ввиду того, что при таком времени происходит значительное или полное расщепление у- и Р-цепей, в меньшей степени а-цепей, что позволяет предположить наличие в реакционной смеси после проведения реакции полного набора продуктов гидролиза. Как было сказано в разд. П.7 при обработке масс-спектра мы пользовались критерием его качества, которым является наличие в нем хорошо разрешенных пиков высокой интенсивности с соотношением сигнал/шум более 5. При этом, чем больше в масс-спектре таких пиков, тем он качественней. Следует отметить, что в силу разрешающей способности метода МАЛДИ ВП масс-спектрометрии измерения широкого диапазона масс проводят в различных режимах работы прибора.
Так, для самых высокомолекулярных соединений используется режим, специально откалиброванный для диапазона масс примерно от 50 до 300 кДа. Для соединений более низких масс используется режим для диапазона 10 до 50 кДа. Для низкомолекулярных пептидов используется режим в диапазоне масс 500-5000. Границы режимов весьма условны, однако наилучшие результаты определения веществ в различных диапазонах молекулярных масс достигаются в указанных режимах. Мы попытались получить масс-спектры продуктов гидролиза коллагена во всех диапазонах масс. В этих экспериментах варьировались матрицы (DHB, НССА и SA), соотношение раствора матрицы и аналита (об/об: 2/1;1/1;1/2;1/10), методы нанесения образцов на мишень (метод «высушенной капли», «тонного» и «двойного»). Для рабочих диапазонов более 8 кДа использовали синапиновуїо кислоту в качестве матрицы, поскольку именно данная матрица, как было показано в разд. 1.2.2, является предпочтительной для анализа высокомолекулярных белков. Для низкомолекулярного диапазона использовались матрицы DHB и НССА. В качестве примера На рис. III. 11 -III. 13 представлены масс-спектры гидролизатов коллагена, полученные под действием препарата из Serratia Proteomaculans. Метод нанесения - метод «высушенной капли», матрицы: SA (рис. ПІЛ 1, III.12) и НССА (рис. III.13), соотношение растворов матрицы ианалита 1:1. Анализируя данные рис. III. 11 - III. 13 можно сделать вывод о том, что качественных масс-спектров гидролизатов с массами более 3200 Да в этой серии экспериментов получить не удалось. Несмотря на то, что в спектре на рис. III. 11 присутствуют пики вплоть до 300000 Да, при их детальном рассмотрении оказывается, что эти пики нельзя отнести к пикам коллагена. Как было показано в разд. 1.1.5, ключевым параметром пика высокомолекулярного соединения является наличие пиков его изотопного распределения. При рассмотрении каждого пика на рис. III. 11 подробнее видно, что ни один пик не обладает таким распределением. И каждый их этих пиков относится к шумовым выбросам. В масс-спектрах среднего диапазона масс вообще не было зафиксировано никаких пиков (рис III. 12) ни при каких вариациях пробоподготовки.
