Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1.Общее представление о системе цитокинов 16
1.2. Состояние системы интерферона в норме и при патологии печени 27
1.3.Биологические свойства фактора некроза опухолей, его роль при патологии печени 42
1.4.Основные биологические свойства ИЛ-1, его роль при ХГ и ЦП 55
1.5.ИЛ-б, основные биологические функции и роль при патологии печени 61
1.6.ИЛ-4 как противовоспалительный цитокин при хронических заболеваниях печени 66
ГЛАВА 2. Материалы и методы 71
2.1. Методы исследования 71
2.2.Исследование концентрации ИФН-а, ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-б, ИЛ-4 в сыворотке крови 73
2.3.Определение противовирусной активности ИФН-а в сыворотке крови 75
2.4. Определение специфической активности че ловеческого рекомбинантного ФНО-а 77
2 5 .Метод дискретного плазмафереза 82
2.б.Клиническая характеристика обследуемых больных 83
2.7. Методы статистической обработки материала.. 89
ГЛАВА 3. STRONG Концентрация и противовирусная активность ИФН-а сыворотки крови у больных
с патологией печени STRONG 90
3.1. Концентрация и противовирусная активность ИФН-а у больных хроническим гепатитом 95
3.2.Концентрация и противовирусная активность ИФН-а у больных циррозом печени 112
ГЛАВА 4. Концентрация ФНО-а, ШІ-4 и цитолитиче-ская активность ФНО-а в сыворотке крови больных ХДЗП 12 6
4.1. Концентрация ФНО-а, ИЛ-4 и цитолитическая активность ФНО-а у больных хроническими гепатитами 126
4.2.Концентрация ФНО-а, ИЛ-4 и цитолитическая активность ФНО-а у больных циррозом печени.. 152
ГЛАВА 5. Концентрация ИЛ-1 в сыворотке крови больных ХГ и ЦП 183
ГЛАВА 6. Концентрация ИЛ-6 в сыворотке крови больных ХДЗП 197
6 1.Концентрация ИЛ-б у больных хроническим ге
патитом 197
6.2.Концентрация ИЛ-б у больных циррозом печени 208
ГЛАВА 7. Влияние дискретного плазмафереза на состояние ИФН-а и ФНО-а сыворотки крови больных ХДЗП 219
ГЛАВА 8. Состояние системы регуляторних цитокинов при различных типах портальной ге
модинамики у больных ЦП и ХГ 230
Заключение 243
Выводы 303
Практические рекомендации 307
Список литературы
- Состояние системы интерферона в норме и при патологии печени
- Определение специфической активности че ловеческого рекомбинантного ФНО-а
- Концентрация и противовирусная активность ИФН-а у больных хроническим гепатитом
- Концентрация ФНО-а, ИЛ-4 и цитолитическая активность ФНО-а у больных хроническими гепатитами
Введение к работе
Актуальность проблемы. Хронические диффузные заболевания печени являются одним из наиболее актуальных разделов внутренней патологии. Это связано с их широкой распространенностью, тяжестью течения и высокой летальностью. Так ежегодно во всем мире от цирроза печени умирает более 300000 человек. ХДЗП занимают первое место среди различных причин утраты трудоспособности у больных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта [Ивашкин В.Т., 2002; Григорьев П.Я., Яковенко Э.П, 2001; Шерлок Ш., Дж. Дули, 1999].
В последнее время большое внимание исследователей привлекает проблема роли цитокиновой системы и, в частности, системы интерферона в патогенезе ряда заболеваний внутренних органов, механизмы ее взаимодействия с другими регуляторными системами организма [Кетлинский СА и соавт., 1992; Bendtzen К., 1994]. Цитокины - медиаторы межклеточных взаимодействий, являясь полифункциональными полипептидами, играют важную роль в противовирусном иммунитете, процессах гемопоэза, репарации тканей, дифференцировки и роста клеток, в регуляции сосудистого тонуса [Лукина ЕА, 1998; Freund М et а!., 1994]. Столь широкий спектр биологического действия цитокинов обусловливает их участие в патогенезе различных заболеваний, в том числе и ХДЗП [Ивашкин В.Т., 1998; Cerny A, Chisari F.V., 1999, Гейвандова Н.И., 2001]. При заболеваниях печени цитокины участвуют в формировании иммунного ответа на вирусную инфекцию, процессах повреждения, воспаления, регенерации и развитии фиброза [Ариненко Р.Ю.,1999, Koziel М.J., 1999]. Таким образом, очевидно, что нарушения продукции регуляторных цитокинов и их биологической активности могут играть важную роль в механизмах хронизации и прогрессирования заболеваний печени. Однако многие аспекты функционирования этой сложной системы остаются неясными, литературные данные носят противоречивый характер. Отсутствуют работы, посвященные взаимосвязи между концентрацией регуляторных цитокинов в сыворотке крови и их функциональным состоянием при ХДЗП. Остается открытым вопрос о роли цитокинов в механизмах хронизации гепатотропных вирусных инфекций, в регуляции воспалительного процесса, о их возможном участии в развитии и прогрессировании портальной гипертензии и ряда других осложнений ХДЗП.
Несмотря на большие успехи, достигнутые в последнее время в терапии ХДЗП, следует признать, что медикаментозное лечение ХГ и ЦП по-прежнему является трудной и зачастую невыполнимой задачей. Углубленное исследование патогенетической роли про- и противовес-
PUC. НАЦИОНАЛЬНАЯ ] БИБЛИОТЕКА J
палительных цитокинов при этой патологии позволит предложить новые пути повышения эффективности лечения ХДЗП, основанные либо на блокировании биологических эффектов медиаторов воспаления (ан-тпцитокиновая терапия), либо, напротив, на их стимуляции. Ряд авторов считает, что расширение комплексной терапии больных с хроническими заболеваниями печени за счет включения плазмафереза повышает эффективность проводимого лечения, улучшает клинико-биохими-ческие показатели, способствует нормализации иммунного статуса [Жеребцов Л.Л., и соавт.,1991; Гуревич К.Я., Костюченко Л.Л., 1995]. Но не все механизмы лечебного действия плазмафереза до конца еще ясны. В связи с этим представляется интересным изучение влияния плазмафереза на состояние системы ИФН-а и других регуляторных цитокинов у больных ХГ и ЦП.
При изучении ХДЗП большое значение придается оценке наличия и степени выраженности портальной гипертензии. Цитокины влияют на эндотелий сосудов, включая регуляцию образования и стабилизацию кровяных тромбов, также они могут действовать на вазомоторный тонус сосудов [Bevilacgua М.Р. et al.,1996]. В связи с вышеизложенным представлялось интересным сопоставить состояние цитокннового статуса у больных ХГ и ЦП с параметрами печеночно-воротного кровотока, по данным дуплексного допплеровского сканирования, что позволило бы уточнить патогенетические механизмы развития портальной гипертензии у больных ЦП и в перспективе разработать новые подходы к ее дифференцированной терапии.
Вышеизложенное обусловливает актуальность дальнейшего изучения цитокинового статуса у больных ХДЗП, разработку на основе полученных данных новых диагностических и прогностических критериев.
Цель исследования: Установить патогенетическое значение системы регуляторных цитокинов и ИФН-а при ХДЗП. На основе полученных данных разработать и усовершенствовать методы диагностики и прогнозирования течения ХГ, ЦП и их осложнений.
Задачи исследования:
1. Изучить состояние системы ИФН-а в сыворотке крови больных ХГ и ЦП, оценить ее особенности в связи с этиологией и основными клинико-лабораторными синдромами.
2. Установить клинико-патогенетическое и диагностическое зна
чение ИФН-а сыворотки крови при ХДЗП.
3. Определить концентрацию и цитолитическую активность
ФНО-а в сыворотке крови при ХГ, ЦП и их осложнениях. Изучить взаи
мосвязь между этими показателями и функциональным состоянием
печени: активностью и степенью компенсации патологического процесса, выраженностью отдельных клинико-лабораторных синдромов, степенью печеночной недостаточности.
4. Исследовать состояние ведущих про- и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-6, Ил-1Р) в сыворотке крови больных ХГ и ЦП, уточнить их клинико-патогенетическое и диагностическое значение.
5. Изучить взаимосвязь между регуляторными цитокинами сыворотки крови и состоянием печеночно-воротного кровотока у больных хроническим гепатитом и циррозом печени по данным дуплексного допплеровского сканирования.
6. На основе полученных данных о состоянии системы ИФН-а и
регуляторных цитокинов разработать прогностические критерии про-
грессирования ХГ и ЦП и развития их осложнений.
7. Оценить влияние дискретного плазмафереза на состояние
ИФН-а и ФНО-а в сыворотке крови. Разработать методику оценки
эффективности стимуляторов интерфероногенеза у больных ХДЗП.
Научная новизна: В настоящей работе впервые предпринято комплексное изучение концентрации ИФН-а и его противовирусной активности в сыворотке крови больных с различной патологией печени, что позволило уточнить патогенетическое и прогностическое значение этих показателей при ХГ и ЦП. Установлен факт повышения уровня и ПВА ИФН-а сыворотки крови у больных ОВГ, ХГ, ЦП и нарушение баланса между его количеством и функциональной активностью при ЦП. Определены особенности интерферонового статуса при различных этиологических формах ХДЗП. Показано, что ПВА сывороточного ИФН-а у больных ХГ зависит от активности заболевания, а на стадии цирроза имеется обратная связь со степенью компенсации. Установлено прогностическое значение определения показателей ИФН-а сыворотки крови больных ХГ.
Впервые проведено комплексное исследование содержания ФНО-а и его цитолитической активности, концентрации ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-4 в периферической крови больных хроническими гепатитами и циррозом печени. Проведен анализ изменений уровня этих цитокинов у больных ХДЗП в зависимости от этиологии заболевания, активности патологического процесса, стадии ЦП по градации Child-Pugh, наличия осложнений и степени выраженности основных клинико-биохимических синдромов. Установлено достоверное повышение уровня ФНО-а, его цитолитической активности, а также концентрации ИЛ-4, ИЛ-6 в сыворотке крови больных ХГ и ЦП по сравнению с контрольной группой. Показано, что состояние ФНО-а у больных ХДЗП зависит от ряда причин. У
больных ХГ- прежде всего от этиологии, выраженности виремии и активности заболевания, при ЦП - в большей степени от стадии и особенностей течения. Впервые выявлена положительная сильная корреляционная связь между ЦЛ ФНО-а в сыворотке крови и активностью ЛЛТ. Определены ведущие механизмы, влияющие на уровень основных ре-гуляторных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-4) в периферической крови больных ХДЗП, установлена достоверная связь их сывороточных концентраций с рядом клинико-лабораторных синдромов.
Впервые изучено влияние про- и противовоспалительных цитокинов на состояние печеночно-воротного кровотока у больных ХГ и ЦП, что позволило уточнить некоторые аспекты патогенеза портальной гипертензии.
Впервые получены данные о стимулирующем влиянии дискретного плазмафереза на состояние противовирусной активности сывороточных интерферонов у больных ХДЗП. На основании полученных данных разработаны новые критерии, позволяющие прогнозировать результаты интерфероностимулирующей терапии и особенности течения заболевания.
Практическое значение работы. Установленные нами закономерности в колебаниях концентрации и функциональной активности ИФН-а, ФНО-а и других исследуемых цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-4) в сыворотке крови больных ОВГ, ХГ и ЦП позволили предложить новые прогностические критерии, отражающие некоторые аспекты патогенеза ХДЗП, разработаны рекомендации по отбору лиц с повышенным риском развития ХГ и ЦП. Использование предлагаемых показателей в комплексе с другими методами обследования существенно расширяет возможности клинициста, позволяет лучше оценить резервные возможности организма и определять стратегию иммуномодулирующих воздействий. Определение противовирусной активности ИФН-а сыворотки крови рекомендуется использовать в динамике для контроля эффективности лечения больных ХДЗП. Выявленные особенности состояния ФНО-а и ИЛ-6 у больных ХГ вирусной и токсической этиологии позволяют использовать эти показатели при проведении дифференциальной диагностики различных форм ХГ. Обнаруженная прямая сильная корреляционная связь между специфической (цитолитической) активностью ФНО-а сыворотки крови и ЛЛТ позволяет предложить этот показатель в качестве нового информативного критерия оценки активности патологического процесса у больных ХДЗП.
Показано, что содержание сывороточного ИЛ-6 имеет достоверную прямую корреляционную связь с маркерами мезенхимального воспаления, в связи с чем этот показатель может служить дополнительным
критерием оценки выраженности иммунопатологических реакций. Выявленные разнонаправленные нарушения цитокинового статуса (прежде всего ФНО-а и его цитолитической активности) и уточнение их роли в патогенезе ХДЗП, позволят разработать принципы цитокинотерапии, патогенетически обоснованные показания для назначения препаратов, стимулирующих или, напротив, подавляющих активность исследуемых цитокинов. Полученные данные о стимулирующем действии плазма-фереза на функциональную активность ИФН-а подтверждают эффективность использования этого метода в комплексной терапии больных ХГ и ЦП и расширяют диапазон его применения. Сопоставление исходных показателей исследуемых цитокинов в сыворотке крови (прежде всего ИФН-а) с результатами длительного наблюдения за течением заболевания позволило разработать и предложить для практического применения новые прогностические критерии течения и развития осложнений при ХГ и ЦП.
Внедрение результатов работы. Результаты диссертационной работы внедрены в практику работы гастроэнтерологического отделения АМОКБ №1 г. Астрахани, гастроэнтерологического отделения ГКБ №3. Полученные в результате исследования данные включены в лекционный материал по теме «Хронические диффузные заболевания печени», используются на практических занятиях со студентами, интернами, клиническими ординаторами и курсантами факультета последипломного образования Астраханской государственной академии, включены в методические рекомендации и руководства для врачей.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Для больных ХГ и ЦП характерно повышение концентрации и противовирусной активности ИФН-а в сыворотке крови. Противовирусная активность ИФН-а у больных ХГ повышена в большей степени, чем у больных ЦП, при близких значениях концентрации, из чего следует, что на стадии сформировавшегося ЦП наблюдается дисбаланс между продукцией ИФН-а и проявлением его биологических эффектов.
У больных ХГ противовирусная активность ИФН-а выше при вирусной этиологии заболевания (ХГВ и ХГС) и находится в прямой зависимости от степени активности патологического процесса. При ХГД наблюдается более низкая противовирусная активность ИФН в сопоставлении с ХГВ и ХГС. У больных ЦП по мере прогрессирования заболевания, увеличения градации по классификации Чайльд-Пью происходит снижение как концентрации ИФН-а в сыворотке крови, так и его противовирусной активности.
Содержание ФНО-а в сыворотке крови и его специфическая (цитолитическая) активность у больных ХГ и ЦП превышают показате-
ли, характерные для здорового контингента, причем концентрация ФНО-а выше при ЦП, чем при ХГ. Нарастание содержания ФНО-а в сыворотке крови больных ЦП по мере прогрессировать заболевания не сопровождается увеличением его специфической активности, что свидетельствует о накоплении в кровотоке дестабилизированных форм исследуемого цитокина. У больных хроническими гепатитами концентрация ФНО-а зависит от этиологии заболевания, достигая максимальных значений при хронических вирусных гепатитах, при этом его цитолити-ческая активность не связана с этиологией. На стадии сформировавшегося цирроза печени отсутствует зависимость показателей концентрации и цитолитической активности ФНО-а от этиологии.
Уровень специфической (цитолитической) активности ФНО-а как у больных ХГ, так и ЦП, находится в прямой связи с активностью патологического процесса, являясь отражением цитотоксического эффекта, присущего этому цитокину. При хронических гепатитах имеется сильная прямая корреляционная связь между показателями цитолитической активности ФНО и уровнем АЛТ.
При хронических гепатитах В и С уровень ИЛ-4 в сыворотке крови достоверно выше, чем в контроле и при ХГД. У больных с репликацией HBV отмечается увеличение синтеза ИЛ-4, по сравнению с интегративной фазой. Формирование и прогрессирование ЦП сопровождается дальнейшим нарастанием уровня сывороточного ИЛ-4.
Уровень ИЛ-1 в сыворотке крови больных ХГ и ЦП в среднем достоверно не отличается от такового у здоровых доноров. У больных терминальным ЦП, класс «С» по Чайльд-Пыо, содержание ИЛ-1 в сыворотке крови было наибольшим.
Установлено, что при ХГ и ЦП концентрация ИЛ-6 выше при вирусной этиологии заболевания и находится в прямой корреляционной связи со степенью выраженности синдрома мезенхимального воспаления.
Дискретный плазмаферез стимулирует противовирусную активность сывороточного ИФН-а у больных ХДЗП, что является одним из механизмов, объясняющих его положительный лечебный эффект. По окончании курса лечения плазмаферезом определялось достоверное снижение концентрации ФНО-а в сыворотке крови больных ХГ и ЦП, что коррелировало с положительной динамикой клинико-лабораторных показателей. Следовательно, присущий плазмаферезу детоксикацион-ный эффект в том числе обусловлен и выведением из кровотока избыточных количеств ФНО-а.
По мере нарастания портальной гипертензии при ЦП, по данным дуплексного допплеровского сканирования, наблюдается снижение
противовирусной активности ИФН-ос при сохранении его концентрации. Избыточная концентрация ФНО-а в сыворотке крови более характерна для больных ЦП со значительным расширением диаметра воротной вены и повышенным конгестивным индексом.
Публикации и апробация работы. Материалы диссертации изложены в 51 печатных работах, доложены на 5-й, 6-й и 7-й Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2000, 2001, 2002 г.), 2-й Объединенной Всероссийской и Всеармейской научной конференции «Санкт-Петербург - Гастро-2000» (С.-Петербург, 2000 г.). Третьем Российском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2001» (С.Петербург, 2001 г.), на 5 Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2003» (С.-Петербург, 2003 г.). На 7-й и 8-й Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2001, 2002 г.). На 7-й и 8-й международных конференциях «Современное состояние методов не-инвазивной диагностики в медицине» (Сочи, 2000, 2001 г.). На Всеро-сийской научно-практической конференции с международным участием «Физиологические науки - клинической гастроэнтерологии» (Ессентуки, 2001 г.). На Всероссийской научной конференции «Клинические перспективы в инфектологии» (С.-Петербург, 2001 г.). На второй международной конференции «High medical technologies in XXI century»,(Spain, Benidorm, 2003). На Фальк Симпозиуме «Immunological diseases of liver and gut», (Prague,Czech Republic, 2003).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 371 странице машинописного текста, состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Иллюстративный материал представлен 54 таблицами и 26 рисунками. Библиографический указатель включает 487 источников, в том числе 328 зарубежных. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Астраханской государственной медицинской академии. Номер государственной регистрации 01.200.208133.
Состояние системы интерферона в норме и при патологии печени
По рекомендации ВОЗ в отношении ИФН принято следующее определение: "Определяемый в качестве интерферона фактор должен быть белковой природы, обладать антивирусной активностью по отношению к разным вирусам, по крайней мере, в гомологичных клетках, опосредованной клеточными метаболическими процессами, включающими синтез РНК и белка" [442] .
Интерфероны - это группа генетически детерминированных, биологически активных белков, синтезируемых ядросодержащими клетками в процессе защитной реакции на чужеродные агенты -вирусную инфекцию, антигенное или митогенное воздействие, и способные неспецифически подавлять внутриклеточные этапы репродукции широкого круга микроорганизмов [42] . Таким образом основная цель системы интерферонов - распознавание и элиминация чужеродной генетической информации [39].
Как уже говорилось выше, продукция и секреция цитокинов (ИФН-a/fS, IL-1, TNF, IL-6,8) относится к самым ранним событиям, сопутствующим взаимодействию микроорганизмов с макрофагами. Этот ранний неспецифический ответ на инфекцию важен по нескольким причинам: он развивается очень быстро, поскольку не связан с необходимостью накопления клона клеток, отвечающих на конкретный антиген; вместе с тем ранний цитокиновый ответ влияет на последующий специфический иммунный ответ [133,184]. Являясь фактором естественной резистентности, ИФН, в тоже время, действует как многофункциональный цитокин, инициирующий каскад иммунологических реакций, в конечном счете обеспечивающий противовирусную защиту клеток [41,127].
Система ИФН состоит из генов ИФН, рецепторов и эффектор-ных молекул трех видов, относящихся к двум типам I тип-ИФН-а, ИФН Р и II тип-ИФН-у. Гены I и II типов ИФН расположены на разных хромосомах и имеют разные рецепторы, различаются они также механизмами индукции и продукции [66]. Выделено еще два близких к ИФН-а типа интерферонов: ИФН-х и ИФН-СО. ИФН-х обнаружен только у птиц, ИФН-СО, первоначально обнаруженный у жвачных животных, имеется и у человека [153,349] .
Гены ИФН-І типа локализованы в 9 хромосоме и обладают высокой степенью молекулярной гомологии: последовательность аминокислот ИФН-а на 30% совпадает с аминокислотной последовательностью у ИФН-(3. В связи с тем, что ИФНы-1 типа обладают сходными биохимическими и биологическими свойствами, их можно рассматривать как единую группу ИФН-а/Р, не выделяя отдельные типы. Кроме того установлено, что ИФН-а и ИФН-Р в основном, образуются одновременно, поскольку имеют сходные механизмы индукции и вырабатываются одними и теми же клетками [220,264,327,416]. Ген ИФН-ІІ типа локализован в 12 хромосоме и не имеет структурной гомологии с ИФН-І. ИФН-І и II типов имеют различный механизм индукции и продукции, но общей и характерной чертой является их противови 29 русная активность [39]. Молекулярная масса различных подтипов ИФН-СС (выделяют три субкласса и целый ряд подтипов) колеблется от 18,5 до 24 кД, ИФН-Р - 22-23 кД, ИФН-у - 45 кД. ИФН-СС и ИФН-СО являются малогликолизированными протеинами, ИФН-р и ИФН-у - гликопротеинами [266]. По современным данным, ИФН-І типа могут продуцироваться практически всеми типами клеток, однако в основном ИФН-СХ вырабатывают В лимфоциты и макрофаги/моноциты. ИФН Р продуцируют в основном фибробласты и клетки эндотелия [39, 107, 132, 225,250,383,448]. К индукторам, стимулирующим выработку ИФН-а, относят вирусы, опухолевые клетки, вирустрансформированные, вирусинду-цированные клетки и даже незараженные ксеногенные клетки. Наряду с этим, бактерии, некоторые митогены (В-клеточные—ЛПС, Т-клеточные — ФГА), ИФН-у и некоторые цитокины (IL-1, IL-2, TNF-ce) также могут стимулировать продукцию ИФН-се/Р [3, 39, 128,133,176,260,285,417,442]. Кроме того, определенное влияние на синтез ИФН-а/Р оказывают пептидные гормоны, простагландины, глюкокортикоиды [163, 305] . Основными продуцентами ИФН-ІІ типа являются Т-лимфоциты CD4+ и естественные киллеры [210,221,346,442,449,475]. К числу индукторов ИФН-у относятся митогены, антитела, специфические антигены и аллоантигены, микроорганизмы, вирусы, оксиданты, многие иммуномодуляторы, соли тяжелых металлов [39,128]. Образование ИФН-у осуществляется при взаимодействии ЕК и Т-лимфоцитов с моноцитами и макрофагами [39,413]. Синтез ИФН-у контролируется некоторыми интерлейкинами (IL-1, IL-2, CSF) , простагландинами, а также ИФН-а и ИФН-у [39,110,282]. Ингибиторное влияние на синтез ИФН I и II типов ( ИФН-а и ИФН-у) оказывают ИЛ-5 и ИЛ-10 [354,438].
Взаимодействие ИФН с клетками «мишенями», как и других цитокинов, осуществляется посредством специфических рецепторов, пронизывающих цитоплазматическую мембрану. Внеклеточная часть рецептора содержит распознающий домен, а внутриклеточная, содержащая около 500 аминокислотных остатков, осуществляет передачу сигнала контрольным элементам, предваряющим ген. Передача сигнала осуществляется подобно пептидным гормонам, посредством эндоцитоза: комплекс ИФН с рецептором погружается внутрь клетки, после чего связь разрывается и рецептор возвращается на клеточную поверхность [22,39,377]. Таким образом осуществляется передача сигнала внутрь клетки к ядру, в результате чего происходит экспрессия генов, кодирующих белки, осуществляющих биологическую активность ИФН [92,156].
Определение специфической активности че ловеческого рекомбинантного ФНО-а
Для определения активности интерферона готовили разведения водной фазы (ниже и выше предполагаемого титра в 50-100 раз) и стандартного образца (ОСО 42-28-119-93П) в среде Игла с 2% сыворотки плодов коров по ФС42-7ВС-85 (поддерживающая среда) и 100 ед/мл пенициллина и 50 ед/мл стрептомицина. Из полученных разведений стандарта и образца препарата переносили по 0,15 мл в планшет без клеток, содержащий по 0,15 мл поддерживающей среды в каждой лунке, и проводили двухкратные разведения по горизонтальным рядам планшета. Из планшета с монослоем клеток удаляли среду и из планшета с разведенным стандартом и образцом последовательно переносили по 0,1 мл двукратных разведений, используя по 4 лунки на каждое разведение, 4 лунки с культурой оставляют в качестве контрольных. Кроме того, 16 лунок оставляли для контроля дозы индикаторного вируса. Планшеты инкубировали в течение суток при 37±1С в атмосфере 5,0±0,5% С02. После этого в каждую лунку со стандартом и препаратом вносили определенную заранее дозу ВВС, соответствующую 100 ТЦД5о в 0,1 мл. Одновременно осуществляли контроль взятой дозы вируса на предназначенных для операции 16 лунках с культурой; использовали по 4 лунки на каждое разведение вируса, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД5ол до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД5о, с коэффиен-том разведения, равным 10.
После внесения индикаторного вируса и титрования его дозы, культуру клеток инкубировали на протяжении двух суток при температуре 37±1С в атмосфере углекислого газа (5,0±0,5% С02) до появления первых цитопатических изменений в клетках с индикаторным вирусом в дозе 1 ТЦД5о. Монослой в лунках с 0,1 ТЦД5о индикаторного вируса должен был соответствовать качеству клеток в контрольных лунках. Учет определения активности интерферона осуществляли когда доза внесенного вируса соответствовала 100 ТЦД5о- Если доза вируса, соответствующая 100 ТЦД5о/ была рассчитана на основании учета результатов через 24 часа после заражения, то учет титрования ИФН-а также осуществлялся через 24 часа. Учет результатов опыта был возможен, если не было признаков дегенерации в контрольной культуре. За титр ИФН-а принимали величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок оказалась полностью защищенной от цито-патического действия вируса. Затем, истинную противовирусную активность сыворотки вычисляли по формуле: Определение специфической (цитолитической) активности проводят на перевиваемой культуре мышиных фибробластов в присутствии актиномицина Д («Серва», ФРГ) в 96-ти луночных планшетах для культур клеток («Динатек», США). Культуру мышиных фибробластов L-92 9, консервированную замораживанием в ампулах, получают из музея клеточных культур Института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН РФ. После размораживания при температуре 18-20С содержимое ампулы вносят в матрас емкостью 500 мл с ростовой средой, содержащей (150+Ю)мл раствора 2. Матрасы инкубируют в термостате при температуре (37 + 1) С от 48 до 72 часов до образования монослоя. По мере образования монослоя производят пересев клеток (каждые 2-3 суток). Образующийся монослой клеток снимают со стекла. Для этого монослой заливают небольшим количеством (5,0мл) 0,25% трипсина по ФС 42-3321-96, подогретого до температуры (37+1)С, выдерживают под трипсином до появления первых признаков сползания клеток со стекла (обычно 1-2 мин) . Раствор трипсина сливают, а клетки суспендируют в 150,0 мл, которые затем также инкубируют при температуре (37+1)С в течение 3 суток. Образовавшийся монослой клеток снимают со стекла и суспендируют в таком количестве раствора 2, чтобы было (3-4)х104 клеток в 1 мл. Для выявления оптимальной рабочей концентрации актиноми-цина проводят его титрование. Концентрация актиномицина Д в растворе 3 (0,5мкг/мл) не должна вызывать дегенерации монослоя клеток: показатель экстинкции не должен отличаться от контроля более чем на 10% (т.е. допускается незначительное изменение формы единичных клеток). Общий объем реакционной смеси в лунке составляет 100,0 мкл. Количество клеток в лунке планшета составляет (3-4)х103, которые вносят в объеме (100,0+0,1)мкл раствора 2 во все лунки, кроме первого ряда -его оставляют незаполненным. Клетки инкубируют от 24 до 4 8 часов в термостате при температуре (37+1)С до образования монослоя. Затем раствор 2 сливают, 1 ряд оставляют незаполнен 79 ным. 2 ряд используют для контроля клеток и в лунки этого ряда добавляют: по (100,0 + 0,1)мкл раствора 4 в лунки ABCD и по (100,0+0,1)мкл раствора 5 в лунки EFGH. Ряды с 3 по 12 используют для определения специфической активности тестируемого препарата, причем лунки ABCD - для определения титра активности препарата, лунки EFGH - для определения титра стандартного образца.
Концентрация и противовирусная активность ИФН-а у больных хроническим гепатитом
Согласно литературным данным (Л.Е.Павлова и соавт. 2000 г.) при ОВГ репликативная активность вирусов выражена сильнее, чем при ХГ и тем более - ЦП. Это свидетельствует о том, что при острой вирусной патологии система ИФН реагирует гораздо более активно, чем при хронических формах инфекции, что проявляется в повьшении уровня противовирусной активности ИФН-а. Положительные изменения клинико-лабораторных показателей в процессе выздоровления больных ОВГ сопровождаются тенденцией к нормализации системы ИФН то есть, постепенному снижению уровня противовирусной активности ИФН-а. Через 1 месяц после начала терапии, уровень противовирусной активности ИФН а у больных ОВГ с положительной динамикой течения болезни снижался в 2 раза и в среднем составлял 15,4+3,3 МЕ\мл. Полученные нами результаты у больных ОВГ близки к данным литературы (Диканская Н.В., 1998 г. и др.).
При контрольном исследовании больных ОВГ с полной нормализацией клинико-лабораторных показателей и отсутствием признаков репликации вируса через б месяцев после начала заболевания установлено, что противовирусная активность ИФН-a достигает следового уровня, характерного для здоровых лиц. Следовательно, нормализация уровня противовирусной активности ИФН-a в процессе лечения больных ОВГ, наряду с другими клини-ко-лабораторными тестами, отражает положительную динамику и данный показатель может использоваться в клинической практике в качестве одного из критериев выздоровления.
При этом у пациентов с отсутствием положительной клинической динамики, с наличием признаков хронизации процесса (выявлением маркеров репликативной фазы инфекции и клинико-лабораторных показателей активности заболевания длительный период) также имеется тенденция к снижению противовирусной активности ИФН-a, однако полной ее нормализации не наблюдается. Таким образом, сохранение повышенного уровня противовирусной активности ИФН-a у больных ОВГ длительное время (до 6 месяцев и больше), является прогностически неблагоприятным признаком и может свидетельствовать о хронизации процесса.
Как видно из представленной таблицы, у больных ХГ и ЦП также наблюдалось повышение противовирусной активности ИФН-a по сравнению с контрольной группой (р 0,001), однако ее величины были достоверно ниже, чем при ОВГ. Противовирусная активность ИФН-a у больных ХГ была повышена в большей степени чем у больных ЦП — 25,8611,8 МЕ/мл и 1б,18±1,1 МЕ/мл соответственно (р 0,001).
Изучение концентрации ИФН-а методом твердофазного иммуно-ферментного анализа у больных ХГ и ЦП (табл.б) также выявило достоверное ее повышение по сравнению с донорами (в среднем соответственно 17,9±2,37 пкг/мл и 15,8±1,61 пкг/мл против 5,3±2,21пкг/мл у доноров). В то же время существенных различий в содержании ИФН-а в сыворотке крови у больных ХГ и ЦП выявлено не было (р 0,05).
Результаты, полученные при изучении удельной активности ИФН-а у больных ХДЗП, несколько отличались. Удельная активность ИФН-а при ХГ в среднем составила 1,87±0,33 МЕ/пкг, что достоверно выше, чем в контрольной группе и у больных ЦП: 1,1б±0,12 МЕ/пкг и 0,96±0,11 МЕ/пкг. Обращает на себя внимание тот факт , что удельная активность ИФН-а при ЦП оказалась даже ниже, хотя и недостоверно, чем в контрольной группе.
Таким образом, как следует из таблицы б, хотя концентрация сывороточного ИФН-а у больных ЦП практически не отличалась от значений, полученных в группе больных ХГ, его функциональная и удельная активность были достоверно ниже. Причем удельная активность, отражающая отношение функциональной активности к общей концентрации ИФН-а, циркулирующего в крови, оказалась близка к значениям, наблюдаемым у здоровых доноров. В связи с этим можно предположить, что у больных ЦП значительная часть циркулирующего в крови ИФН-а находится в функционально неактивном, заблокированном состоянии.
Как видно из представленного рисунка (рис.3), в группе лиц с низкими показателями противовирусной активности ИФН-а (5-10 МЕ/мл) преобладают больные со сформировавшимся ЦП, а также большая часть пациентов, имеющих клинико-лабораторные признаки трансформации в ЦП. В то же время в группе с исходно высокими значениями противовирусной активности ИФН-а подавляющее большинство составляют больные ХГ.
Как уже говорилось выше (глава 2) , у большинства обследованных больных ХГ, 86 из 121 (71%), длительность заболевания не превышала 5 лет. Противовирусная активность ИФН-а у больных ХГ с относительно короткой продолжительностью заболевания (до 5 лет) была повышена в большей степени, хотя и недостоверно, чем у больных ХГ с более длительным анамнезом (более 5 лет) — 27,32±2,7 МЕ/мл и 21,5б±2,45 МЕ/мл соответственно. Хотя при оценке этих результатов, безусловно, следует учитывать тот факт, что истинные сроки начала заболевания при ХГ установить трудно. Вероятно, одной из причин подавления противовирусной активности ИФН-а у больных ХГ может являться истощение системы ИФН, приводящее к снижению иммунологической реактивности.
Концентрация ФНО-а, ИЛ-4 и цитолитическая активность ФНО-а у больных хроническими гепатитами
Как уже говорилось выше, в соответствии с основными функциями, во многом условно, выделяют две основные группы цито-кинов: провоспалительные и противовоспалительные. Первую группу составляют фактор некроза опухоли (ФНО-а), интерлей-кин-1, интерлейкин-2, интерферон-у/ интерлейкин-б и некоторые другие. Ко вторым относятся, прежде всего, интерлейкин-4 (ИЛ-4), интерлейкин-10, интерлейкин-11. В основе большинства хронических воспалительных заболеваний лежит нарушение баланса между синтезом про- и противовоспалительных цитокинов [218, 234,470].
Определение концентрации ФНО-а и ИЛ-4 в сыворотке крови методом ИФА, специфической (цитолитической)активности ФНО-а на перевиваемой культуре мышиных фибробластов и расчет удельной активности ФНО-а проведено у 73 больных ХГ в возрасте от 16 до 73 лет.
Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц (доноры) в возрасте от 18 до 50 лет (18 мужчин и 12 женщин). За нормальный уровень ФНО-а в сыворотке крови и его цитолитической активности приняты показатели, полученные в контрольной группе, в среднем 23,54±б,02 пкг/мл и 2,1+1,21 МЕ/мл, концентрация ИЛ-4 у здоровых доноров в среднем составила 29,13±5,78 пкг/мл, что сопоставимо с результатами, опубликованными в литературе. Удельная активность ФНО-а в контроле в среднем составила 0,0 92±0,2 МЕ/пкг.
В целом в группе обследованных больных ХГ выявлено достоверное повышение средних показателей концентрации ФНО-а в сыворотке крови, его цитолитической и удельной активности: 86,41+11,50 пкг/мл, 9,211,38 МЕ/мл и 0,23+0,03 МЕ/пкг соответственно (р 0,05). В тоже время проведенный корреляционый анализ в отношении концентрации ФНО-а в сыворотке крови больных ХГ и его специфической (цитолитической) активности не позволил выявить достоверной корреляционной связи между этими показателями (г=0,076). Концентрация ИЛ-4 у больных ХГ в среднем составила 68,10±12,99 пкг/мл, что также достоверно выше, чем в контрольной группе (р 0,05). Концентрация ФНО-а и ИЛ-4 в сыворотке крови не зависели от пола и возраста пациентов.
В таблице 15 представлены результаты исследования концентрации ФНО-а, ИЛ-4, цитолитической и удельной активности ФНО-а в зависимости от этиологических факторов ХГ.
Полученные результаты свидетельствуют о достоверном повышении средних показателей концентрации ФНО-а, его цитолити-ческой и удельной активности при всех этиологических формах хронических гепатитов. Более выраженное увеличение концентрации ФНО-а наблюдалось у больных ХГ вирусной этиологии. В то же время полученные нами показатели специфической (цитолити-ческой) и удельной активности ФНО-а сыворотки крови при различных этиологических формах ХГ были близки и достоверно не отличались друг от друга. Следовательно, при ХГ уровень цито-литической и удельной активности ФНО-а сыворотки крови не зависит от этиологии заболевания.
Необходимо отметить, что концентрация ФНО-а и его цитоли-тическая активность в группе больных криптогенным ХГ не отличается от значений, полученных у пациентов с наличием маркеров вирусной инфекции (В, С, Д), и не исключено, что причиной возникновения криптогенных гепатитов являются гепатотропные вирусы, которые нами не определялись (F, G, ЦМВ и т.д.).
У больных ХГ алкогольной этиологии повышение концентрации ФНО-а достигало достоверно меньших значений, в среднем составив—40, 68±8, 53 пкг\мл, но также превышало показатели, характерные для здоровых лиц (р 0,01). В данном случае избыточная продукция цитокина, по-видимому, непосредственно связана с активностью гепатита и, вероятно, вносит определенный вклад в повреждение печени.
Детальный анализ изменений концентрации ФНО-а у больных ХГ показал, что у 28% (21 чел.) ее величина не превышала показатели, характерные для здоровых лиц. В тоже время достоверное повышение концентрации цитокина наблюдалось соответственно у 72% (52 чел) . Как видно из представленного рисунка (рис.10) в группе больных с высокими показателями концентрации ФНО-а (более 30 пкг/мл) преобладают больные ХГ вирусной этиологии (41 случай, 7 9%). В группе больных с исходно низкими значениями ФНО-а (до 30 пкг/мл) количество вирусных гепатитов значительно меньше - 12 случаев (57%) , в то же время увеличивается доля больных алкогольным гепатитом - 33% против 17% в группе с избыточной продукцией ФНО-а.
![Значение экстракорпоральных методов в комплексном лечении больных с печеночно-клеточной недостаточностью при различных заболеваниях печени [Электронный ресурс]](/i/i/4420/180242.png "Значение экстракорпоральных методов в комплексном лечении больных с печеночно-клеточной недостаточностью при различных заболеваниях печени [Электронный ресурс] Ткачев Сергей Иванович")
![Использование дискриминантной счетной шкалы для оценки фиброза у больных с хроническими диффузными заболеваниями печени [Электронный ресурс]](/i/i/4417/195453.png "Использование дискриминантной счетной шкалы для оценки фиброза у больных с хроническими диффузными заболеваниями печени [Электронный ресурс] Леонтьев Сергей Игоревич")