Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Генетические аспекты эссенциальной гипертензии и методы анализа сердечно-сосудистых заболеваний
1.2. Роль системы цитокинов в развитии сердечно-сосудистых заболеваний
1.2.1. Система цитокинов, хроническое воспаление и атеросклероз 16
1.2.2. Интерлейкин-1, полиморфизм гена интерлейкина-1 бета и риск сердечно-сосудистых заболеваний
1.2.3. Полиморфизм гена антагониста рецептора интерлейкина-1 и 22 риск сердечно-сосудистых заболеваний
1.2.4. Полиморфизм гена интерлейкина-6 и риск сердечно-сосудистых заболеваний
1.2.5. Полиморфизм гена интерлейкина-12 и риск сердечно-сосудистых заболеваний
1.2.6. Полиморфизм гена интерлейкина-10 и риск сердечно- сосудистых заболеваний
1.2.7. Полиморфизм гена фактора некроза опухолей альфа и риск сердечно-сосудистых заболеваний
1.2.8. Полиморфизм гена лимфотоксина альфа и риск сердечно-сосудистых заболеваний
1.2.9. Взаимосвязь ренин-ангиотензиновой системы и цитокинового каскада
1.2.10. Полиморфизм гена ангиотензиногена и риск сердечно сосудистых заболеваний
1.2.11. Оксид азота, полиморфизм гена эндотелиальной синтазы осида азота и риск сердечно-сосудистых заболеваний
1.2.12. Хемокины и риск сердечно-сосудистых заболеваний 40
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Общеклинические методы исследования 45
2.2. Лабораторные методы исследования 47
2.3. Инструментальные методы исследования 47
2.4. Молекулярно-генетические методы 49
2.4.1. Выделение ДНК из периферической крови человека 49
2.4.2. Выделение РНК из периферической крови 50
2.4.3. Метод полимеразной цепной реакции 51
2.4.4. Метод обратной транскрипции 54
2.4.5. Метод обратной транскрипции - полимеразной цепной 55 реакции в режиме реального времени
2.4.6. Метод электрофореза в агарозном и полиакриламидном геле 59
2.5. Методы статистического анализа результатов исследования 59
Глава 3. Результаты исследования 6 {
3.1. Клиническая характеристика исследуемых групп 61
3.2. Ремоделирование левого желудочка и основные параметры гемодинамики у больных эссенциальной гипертензией 64
3.3. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров генов системы 72 цитокинов с ЭГ
3.3.1. Анализ ассоциаций полиморфизма-571 Т/С гена IL1B с ЭГ 72
3.3.2. Анализ ассоциаций VNTR полиморфизма гена IL1RN с ЭГ 77
3.3.3. Анализ ассоциаций полиморфизма-572 G/C гена IL6 с ЭГ 80
3.3.4. Анализ ассоциаций полиморфизма-<527 С/А гена IL10 с ЭГ 83
3.3.5. Анализ ассоциаций полиморфизма 1159 А/С генаIL12 с ЭГ 86
3.3.6. Анализ ассоциаций полиморфизма -308 G/A гена TNFA с ЭГ 89
3.3.7. Анализ ассоциаций полиморфизма 252 A/G гена LTA с ЭГ 91
3.3.8. Анализ ассоциаций полиморфизма Т174Мгена AGT'с ЭГ 93
3.3.9. Анализ ассоциаций PWr^-полиморфизма гена NOS3c ЭГ 95
3.4. Анализ ассоциаций сочетаний генотипов полиморфизма генов цитокинов с развитием сердечно-сосудистых заболеваний 97
3.5. Сравнительный анализ профиля экспрессии генов цитокинов и их 103
рецепторов в клетках периферической крови больных ЭГ и контрольной группы
Глава 4. Обсуждение результатов 106
Выводы 124
Практические рекомендации 126
Библиографический список 12?
Приложения 151
- Генетические аспекты эссенциальной гипертензии и методы анализа сердечно-сосудистых заболеваний
- Полиморфизм гена антагониста рецептора интерлейкина-1 и 22 риск сердечно-сосудистых заболеваний
- Выделение ДНК из периферической крови человека
- Ремоделирование левого желудочка и основные параметры гемодинамики у больных эссенциальной гипертензией
Введение к работе
Актуальность проблемы. Артериальная гипертензия (АГ) по-прежнему является одним из основных факторов риска развития тяжелых сердечно-сосудистых осложнений, таких, как инсульт и инфаркт миокарда, — главных причин смертности в современном мире.
Эссенциальная, или первичная, гипертензия (ЭГ), или гипертоническая болезнь, является многофакторным заболеванием, в возникновении которого важную роль играет генетическая предрасположенность. Принято считать, что артериальное давление (АД) - количественный признак, контролируемый множеством генов, экспрессия которых варьирует в зависимости от средовых факторов [196]. Хотя общая концепция роли генетических факторов в этиопатогенезе ЭГ достаточно хорошо обоснована, остается много неясных вопросов относительно вклада конкретных генов. Большая часть исследований посвящена ограниченному набору генов, которые кодируют белки, регулирующие тонус сосудов, функцию эндотелия, минеральный обмен, метаболизм и транспорт липидов в сосудистом русле. Относительно недавно стал изучаться вопрос об участии генов цитокинового каскада в развитии ЭГ.
Цитокины являются ключевыми медиаторами межклеточных взаимодействий, в том числе в процессе воспаления. Клетки эндотелия и лейкициты способны продуцировать и реагировать на широкий спектр про- и противовоспалительных цитокинов. Воспаление — основной патофизиологический субстрат сердечно-сосудистых заболеваний [184]. Повышенная экспрессия эндотелием медиаторов воспаления лежит в основе атеросклеротического повреждения сосудистой стенки [125]. Дисфункция эндотелия, наряду с нарушением свертываемости крови и гиперхолестеринемией, приводит к нарушению тонуса сосудов. В то же время, известно, что цитокиновая сеть функционирует в тесной связи с ренин-ангиотензиновой системой и эндотелиальными факторами релаксации, в частности, оксидом азота. Все это позволяет отвести цитокинам значительную роль в патогенезе ЭГ. Особый интерес представляет исследование профиля экспрессии генов цитокиновой сети в лейкоцитах периферической крови больных ЭГ, результаты которого открывают новые возможности для анализа роли транскриптома клеток крови в этиопатогенезе ЭГ.
Однако при ЭГ, как и в случае с другими многофакторными заболеваниями, недостаточно лишь знания продукта гена и влияния полиморфизма этого гена на функциональные свойства белка. Конечный эффект гена во многом зависит от его ближайшего окружения и свойств системы, в которой он функционирует. Это, в свою очередь, в значительной мере зависит от индивидуальных особенностей и условий окружающей среды. Поэтому один и тот же набор генов может обладать различным функциональным значением в разных популяциях. В связи с этим является актуальным выяснение роли полиморфизма ряда генов-кандидатов, факторов риска и некоторых клинических особенностей в развитии ЭГ в популяции татар, проживающих на территории Республики Башкортостан.
В соответствии с вышесказанным, цель настоящего исследования
состояла в изучении роли полиморфизма и уровня экспрессии генов цитокинов в детерминации риска эссенциальной гипертензии и их взаимосвязи с показателями внутрисердечной гемодинамики и ремоделирования миокарда левого желудочка у больных эссенциальной гипертензией.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Оценить состояние внутрисердечной гемодинамики и характер ремоделирования миокарда левого желудочка у больных эссенциальной гипертензией в зависимости от наличия осложнений. 2. Провести анализ ассоциаций с эссенциальной гипертензией аллельных вариантов генов интерлейкина 1 бета (IL1B, -511Т/С), фактора некроза опухолей альфа (TNFA, -308A/G), лимфотоксина (LTA ,-252A/G), интерлейкина 6 {IL6, -572G/C), интерлейкина 10 (IL10, -62 7 С/А), интерлейкина 12 (IL12B, 1159А/С), антагониста рецептора интерлейкина 1 (1L1RN, VNTR полиморфизм), ангиотензиногена (AGT, -174Т/М), эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3, VNTR полиморфизм в интроне 4).
3. Установить связь полиморфизма перечисленных генов с факторами риска и сердечно-сосудистыми осложнениями эссенциальной гипертензии.
4. Провести анализ ассоциаций аллельных вариантов генов-кандидатов с гипертрофией левого желудочка у больных эссенциальной гипертензией.
5. Оценить степень риска развития эссенциальной гипертензии и сердечно-сосудистых осложнений в связи с сочетаниями генотипов генов-кандидатов.
6. Провести сравнительный анализ профилей экспрессии генов цитокинов и цитокиновых рецепторов в клетках периферической крови больных эссенциальной гипертензией и лиц контрольной группы.
Научная новизна работы. Установлены особенности ремоделирования миокарда левого желудочка у больных ЭГ в зависимости от наличия осложнений. Впервые проведён анализ ассоциаций полиморфизма генов IL10, IL6, IL12B, ILIB, ILIRN, TNFA, LTA с риском ЭГ и выявлены маркеры риска ЭГ. Впервые показана ассоциация сочетаний генотипов полиморфных вариантов генов ILIB, IL6 и IL12B с сердечно-сосудистыми осложнениями ЭГ (инфарктом миокарда и инсультом). Установлена ассоциация гипертрофии левого желудочка с ТК-полиморфизмом гена NOS3 у больных ЭГ. На основании исследования профиля экспрессии 84 генов цитокинов в клетках периферической крови больных ЭГ и лиц контрольной группы, выявлены различия в уровне экспрессии 21 гена. Впервые у больных ЭГ обнаружено повышение транскрипционной активности генов CCLI6, CCLI7, CCLI8, CCL19, CCL23, CCL8, CCR6, CCR8, CX3CR1, СХСЫ, СХСЫЗ, ICEBERG, ILI3, IL17C, IL1F10, IL1F6, ILF9, SPP1, CD40LG, XCR1 и понижение транскрипционной активности гена CCL2 в клетках периферической крови.
Практическая значимость. Обоснована целесообразность проведения генотипирования по полиморфным вариантам -627С/А гена IL10 и -511Т/С гена IL1B для оценки риска развития эссенциальной гипертензии, а также генотипирования по полиморфным вариантам генов IL1B, IL-6, IL-10, IL-12B и TNFA для оценки риска развития сердечно-сосудистых осложнений эссенциальной гипертензии. Результаты работы используются при разработке рекомендаций для медико-генетического консультирования по ЭГ с целью первичной и вторичной профилактики сердечно-сосудистой патологии. Материалы исследования могут быть использованы в учебно-методическом процессе на медицинских и биологических факультетах, а также на курсах последипломного образования кардиологов, терапевтов и врачей общей практики.
Положения, выдвигаемые на защиту.
1. Развитие эссенциальной гипертензии характеризуется формированием концентрических вариантов ремоделирования миокарда левого желудочка. У больных эссенциальной гипертензией, перенесших ИМ, чаще наблюдаются эксцентрическая гипертрофия, в том числе, с дилатацией левого желудочка.
2. Генетическими маркерами риска эссенциальной гипертензии являются аллельные варианты генов IL1B, IL10, IL1RN, IL12B и AGT.
3. Риск развития сердечно-сосудистых осложнений эссенциальной гипертензии (инсульта) ассоциирован с полиморфными вариантами генов IL1B, IL-6, IL-10, IL-12B и TNFA. 4. Ї УТК-полиморфизм в 4-ом интроне гена эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3) ассоциирован с гипертрофией левого желудочка у больных эссенциальной гипертензиеи.
5. В клетках периферической крови больных эссенциальной гипертензиеи изменена транскрипционная активность ряда генов цитокинов, в особенности хемокинов, по сравнению с контрольной группой.
Генетические аспекты эссенциальной гипертензии и методы анализа сердечно-сосудистых заболеваний
Эссенциальная гипертензия, или гипертоническая болезнь — хронически протекающее заболевание, основным проявлением которого является АГ, не связанная с наличием патологических процессов, при которых повышение АД обусловлено известными, в современных условиях часто устраняемыми причинами ("симптоматические артериальные гипертензии"). ЭГ представляет собой гетерогенное заболевание, имеющее отчетливые клинико-патогенетические варианты с существенно различающимися на начальных этапах механизмами развития [8]. Как в развитых, так и в развивающихся странах, ЭГ поражает 25-35% взрослого населения, причем 60-70% больных ЭГ - это люди в возрасте от 70 лет и старше. АГ является основным фактором риска развития таких грозных середечно-сосудистых осложнений, как инфаркт миокарда и инсульт, выступающих в качестве основной причины смертности людей в зрелом возрасте [13].
Согласно общепринятой концепции, артериальное давление является количественным признаком, находящимся под контролем множества генов, экспрессия которых варьирует в зависимости от широкого ряда физиологических, бихевиоральных и средовых факторов [196]. Кроме того, близнецовые исследования и сегрегационный анализ показали, что от трети до половины индивидуальных различий уровня АД являются наследуемыми [195]. В последнее десятилетие достигнуты большие успехи в определении генетических основ менделевских, моногенных форм АГ, однако такие формы составляют лишь небольшую часть всех случаев заболевания АГ.
Основным подходом в изучении ЭГ, как и большинства многофакторных заболеваний, является поиск полиморфных вариантов генов-кандидатов, влияющих на предрасположенность к заболеванию в определенных условиях. Такой способ исследования зачастую осложняет наличие многочисленных факторов риска, с трудом поддающихся учету, и невозможность хотя бы приблизительно определить, сколько генов контролируют тот или иной признак. Существует два основных метода картирования генов-кандидатов - это анализ сцепления и анализ ассоциаций. Анализ сцепления используется для определения хромосомной локализации генетических вариантов, связанных с данным заболеванием. Этот метод с большим успехом применяется для идентификации мутаций, ответственных за развитие тех или иных моногенных заболеваний. Для определения генетических основ сложнонаследуемых признаков анализ сцепления используется в модифицированном виде. В частности, сам характер многофакторных заболеваний подразумевает использование расширенных родословных, поскольку предполагается, что один и тот же аллель будет действовать по-разному у различных представителей одной семьи в зависимости от средовых факторов. Таким образом, при анализе сложных признаков множество редких, или, напротив, распространенных аллелей многочисленных генов при большом числе наблюдений снижает статистическую силу исследования. Это одна из причин того, что лишь небольшое число геномных сканов к настоящему времени позволили выявить гены, ответственные за развитие многофакторных заболеваний, отвечающие всем критериям, предъявляемым такому рода исследованиям. Несмотря на это, с помощью данного метода был выявлен участок на хромосоме 5 (5ql2), связанный с предрасположенностью к развитию инсульта [82], а участок, ответственный за повышенный риск инфаркта миокарда, был картирован на хромосоме 14 [38]. Тем не менее, в стороне от указанных регионов осталось множество генов, которые могут, поодиночке или совместно, влиять на проявление данных признаков.
В настоящее время ведутся работы по совершенствованию данного метода. Одним из выходов может стать использование промежуточных признаков, что увеличит генетическую однородность, а также исследование неравновесного сцепления в отдаленных участках генома [173].
Анализ ассоциаций используется для определения частот специфических ДНК-вариантов в неродственных группах больных и здоровых индивидуумов (случай-контроль). Неоспоримым достоинством данного метода является то, что он не требует составления родословных и обладает большей, по сравнению с анализом сцепления, статистической мощностью. Отбор генов-кандидатов для ассоциативных исследований проводится на основании известных данных о патофизиологии данного заболевания, исходя из функции кодируемых ими белковых продуктов [198]. Именно благодаря этому обстоятельству гены компонентов ренин-ангиотензиновой системы стали одними из первых изучаться в качестве генетических факторов риска ЭГ.
Основным несовершенством данного метода является неспособность определять и картировать гены, ответственные за развитие сложных признаков - если только исследуемый маркер не является искомым функциональным вариантом или не находится в неравновесном сцеплении с ним. Другой его недостаток - низкая вопроизводимость результатов исследований, в том числе в различных популяциях [97].
В последнее время все большее распространение получают исследования изменения профиля экспрессии тех или иных генов при определенных патологических состояниях. Это обусловлено существенным прогрессом в понимании молекулярных основ патофизиологии сердечнососудистых заболеваний. Детально описаны механизмы регуляции жизнедеятельности клеток, органов и систем, уточнены функции существующих и открыт ряд новых веществ, опосредующих межклеточные взаимодействия. Все это привело к необходимости изучения транскриптома — совокупности матричной РНК, ассоциированной с клеточным ответом на стресс и болезнь. Все повреждающие стимулы запускают на клеточном уровне каскад адаптивных механизмов, сложных, саморегулируемых, зачастую дублирующихся [193]. В свете вышеизложенного, очевидна несостоятельность гипотезы «одного гена» для описания, например, изменений, происходящих в миокарде при аортокоронарном шунтировании. Напротив, логичнее предположить, что повреждение микарда в данных условиях определяется изменением уровня экспрессии ряда генов и/или белков, варьирующим затем в ходе прогрессирования заболевания [45, 46]. Возможно, данные геномных исследований профиля экспрессии различных генов в различные моменты разнообразных патологических состояний в сочетании с данными, полученными в результате других генетических исследований, будут способствовать дальнейшему развитию наших представлений о функционировании генетических сетей при различных патологических и физиологических состояниях.
Полиморфизм гена антагониста рецептора интерлейкина-1 и 22 риск сердечно-сосудистых заболеваний
В отличие от остальных членов семейства ИЛ-1 антагонист рецептора ИЛ-1 проявляет в основном антиатерогенные свойства. РАИЛ обладает сродством к рецептору ИЛ-1, не вызывая клеточного ответа; вследствие этого полагают, что он является эндогенным ингибитором сигнала ИЛ-1 [56]. РАИЛ продуцируется моноцитами, макрофагами и гладкомышечными клетками [12]. Было показано, что рекомбинантный РАИЛ нейтрализует индуцированную ИЛ-1 продукцию ИЛ-6, ИЛ-8 и моноцитарного хемотаксического белка-1 эндотелиальными клетками человека, и ингибирует пролиферацию гладкомышечных клеток [174]. Кроме того, воспаление сосудистой стенки является основным фенотипическим признаком у мышей с «нокаутом» гена IL1RN, в то время как у трансгенных мышей (1L1RN +/+), находившихся на богатой жирами диете развитие атеросклероза было замедлено [159]. У мышей же с «нокаутом» гена АРОЕ (ароЕ -/-) при применении РАИЛ формирование жировых полосок замедляется [60]. РАИЛ обнаруживается в атеросклеротических бляшках сонных артерий [81], а его значение для развития атеросклероза у человека подтверждается тем фактом, что определенные аллели IL1RN ассоциированы с ишемической болезнью сердца [69] и частотой рестеноза после баллонной ангиопластики [68, 115].
РАИЛ осуществляет регуляцию трансдукции сигнала ИЛ-1, что дало основание изучать его в качестве потенциального противовоспалительного препарата. Было обнаружено, что системное применение РАИЛ благоприятно при ревматоидном артрите у животных в эксперименте и у людей, что подтверждалось гистологическим и клиническим улучшением. Как упоминалось выше, РАИЛ считается также важным защитным фактором при атерогенезе и рестенозе, и в настоящее время он проходит проверку в качестве потенциального антиатерогенного препарата. Elhage et al. показали, что подкожное введение РАИЛ с помощью осмотической помпы (25 мг/кг/день в течение месяца) приводит к значительному замедлению формирования жировых полос в аортальном синусе у мышей с «нокаутом» гена ароЕ-/-, находящихся на атерогенной диете [60]. Обнаружилось, что краткосрочное применение РАИЛ хорошо переносится. Тем не менее, с учетом центральной роли ИЛ-1 в иммунном ответе, длительное системное назначение ингибиторов этого фактора было бы нежелательным.
Ген IL1RN расположен в регионе 2ql4.2. Описано несколько полиморфизмов данного гена, одним из наиболее изученных является пятиаллельный полиморфизм вариабельного числа тандемных повторов 86 bp (VNTR) во втором интроне [77], с числом повторов от 2 до 6. Наиболее часто представлены аллель с 4 повторами (IL1RN !) и 2 повторами (IL1RN 2) , частота остальных в общей сложности не более 5%. По данным ряда авторов, аллель IL1RN 2 ассоциирован с повышенной продукцией РАИЛ in vitro [61] и пониженным уровнем СРБ [131].
ИЛ-6 вырабатывается клетками эндотелия, гладкой мускулатуры и макрофагами. Его экспрессия повышена в участках атеросклеротического повреждения у людей, кроликов с гиперхолестеринемией и мышей с «нокаутом» гена АРОЕ [190]. Хотя клетки эндотелия в основном нечуствительны к данному интерлейкину, при добавлении растворимой субчастицы ИЛ-6 (sIL-6R) усиливается воспалительный ответ благодаря взаимодействию с мембрано-ассоциированной субъединицей рецептора gpl30 [92, 94]. Этот процесс был назван «передачей сигнала» (trans-signaling), он может приводить к повышению адгезивности эндотелия из-за продукции Е-селектина, ICAM-1, VCAM-1 и выброса медиаторов воспаления, в том числе МСР-1, ИЛ-8 и самого ИЛ-6 [146, 190]. Таким образом, sIL-6R, имеющийся в сыворотке и/или продуцируемый локально клетками интимы, может служить для усиления адгезивности эндотелия и выхода лейкоцитов из сосудистого русла в атеросклеротическую бляшку [113]. С другой стороны, моноциты и макрофаги продуцируют IL-6R самостоятельно и не зависят от уровня sIL-6R в своем окружении для ИЛ-6-опосредованной модуляции экспрессии генов [122]. Действие ИЛ-6 на клетки моноцитарно-макрофагальной системы включает дифференцировку моноцитов в макрофаги, повышение экспрессии генов белков острой фазы в гепатоцитах и макрофагах, и переключение макрофагов на повышенный синтез ФНО-а в ответ на введение липополисахарида (ЛПС). ИЛ-6 стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток непосредственно и через gpl30, активируя аутокринную петлю. К тому лее, ИЛ-6 усиливает экспрессию ICAM-1 в гладкомышечных клетках и их превращение в пенистые клетки [157].
Выделение ДНК из периферической крови человека
Для оценки параметров центральной гемодинамики всем больным проводилось эхокардиографическое исследование на аппарате HDI 5000 SONOST (ATL, USA) по стандартной методике Американской ассоциации эхокардиографии (ASE).
Определяли следующие показатели: толщина межжелудочковой перегородки (МЖП), толщина задней стенки левого желудочка (ТЗС), конечный диастолический (КДР) и конечный систолический размер (КСР), переднезадний размер левого предсердия (ЛП), фракцию выброса (ФВ), фракцию укорочения (ФУ). Вычисление массы миокарда ЛЖ проводилось по корригированной формуле ASE: ММЛЖ=0.8х1.04х[(КДР+МЖП+ТЗС)3-КДР3)]+0.6, индекса относительной толщины стенок в диастолу (ИОТ=(МЖП+ТЗС)/КДР) [2] и индекса массы миокарда (ИММ ЛЖ=ММЛЖ/ППТ, где ППТ (м2) - площадь поверхности тела, определяемая по формуле: ППТ=0.007184хМасса тела (кг)0425хРост (см)0725) [58]. Также вычисляли конечный диастолический (КДО ЛЖ, мл) и конечный систолический (КСО ЛЖ, мл) объем по формуле: V=7xD3/2.4+D, где D-КДР ЛЖ или КСР ЛЖ, соответственно [1]. Объем миокарда левого желудочка (Vm) ЛЖ (см3) рассчитывали по формуле: УтЛЖ= 1.047х(КДР ЛЖ+ТЗС ЛЖ во время диастолы)3- 1,047хКДР ЛЖ3 [1]; общий объем (00) ЛЖ (см3): 00 ЛЖ = КДО ЛЖ+Vm ЛЖ [1], конечно-диастолический индекс (КДИ): КДИ = КД0/Ш1Т; индекс конечного диастолического размера (ИКДР): ИКДР= КДР/ППТ [9].
За критерий гипертрофии левого желудочка принимался показатель ИММ ЛЖ, превышающий 117 г/м" у мужчин, 104 г/м у женщин [52]. На основании значении ИММ и ИОТ выделяли следующие типы ремоделирования миокарда [54, 74, 213]: I тип - нормальная геометрия (ОТСМЖП 0.45 и ОТСЗСЛЖ 0.45), II тип - концентрическое ремоделирование (ОТСМЖП 0.45 и ОТСЗСЛЖ 0.45), III тип - изолированная гипертрофия МЖП (ОТСМЖП 0.45 и ОТСЗСЛЖ 0.45), IV тип - изолированная гипертрофия ЗС ЛЖ (ОТСМЖП 0.45 и ОТСЗСЛЖ 0.45), V тип - концентрическая гипертрофия (ИММ 117 г/см и ИОТ 0,45), VI тип — эксцентрическая гипертрофия без дилатации полости ЛЖ (ИММ 117 г/см2, И0ТО.45, ИКДРО.1), VII тип - эксцентрическая гипертрофия с дилатацией полости ЛЖ (ИММ 117 г/см2, И0ТО.45, ИКДР 3.1).
Диастолическая функция ЛЖ оценивалась методом допплер-эхокардиографии в импульсном режиме по показателям трансмитрального кровотока. Наличие диастолической дисфункции левого желудочка регистрировалось при снижении показателя соотношения скоростей раннего наполнения ЛЖ и предсердного наполнения ЛЖ ниже 1.
ДНК выделяли из цельной венозной крови. В качестве консерванта использовался 0.5 мл 0.5 М раствора ЭДТА.
Выделение ДНК производили методом фенольно-хлороформной экстракции [112, 142]. Для этого 10 мл крови с добавлением 25 мл лизирующего буфера (в 1 литре раствора 109,4 г сахарозы, 25 мл 0,2М MgC12, 10 мл 1% тритон Х-100, 10 мл 1М трис-HCl, рН-7,6) центрифугировали в течение 20 минут со скоростью 4000 об/мин при температуре +4С. Затем осадок, оставшийся после слива супернатанта, смешивали с 10 мл лизирующего буфера и вновь центрифугировали при тех же условиях в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 800 мкл буфера для протеиназы К (Saline ЭДТА). К полученной смеси добавляли 25 мкл 10% SDS и 25 мкл протеиназы К (100мг/мл) и инкубировали при температуре 37С в течение 12 часов. Из полученного лизата выделяли ДНК. Для этого, на первом этапе к смеси добавляли 800 мкл забуференного фенола и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 минут. На втором этапе супернатант смешивали со смесью фенола и хлороформа в соотношении 1:1 и центрифугировали при тех же условиях. На третьем, добавляли 800 мкл хлороформа и центрифугировали смесь в течение 10 минут. ДНК осаждали двумя объемами охлажденного 96 % этанола. Преципитированную ДНК промывали 70% раствором этилового спирта, высушивали и растворяли в 1мл ТЕ буфера с рН=8.0. Раствор хранили при температуре -20С.
Выделение суммарной РНК из периферической крови проводили с использованием набора AquaPure RNA Isolation Kit компании Bio-Rad в соответствии с протоколом фирмы-производителя. К 300 мкл добавляли 900. мкл Red Blood Cells Lysis solution, перемешивалии 10 мин инкубировали при комнатной температуре. Затем центрифугировали 20с при 11 тыс об/мин и отбирали супернатант. Ресуспендировав лейкоциты в остатке супернатанта , добавляли 300 мкл RNA Lysis solution.
Осаждение ДНК и белков проводили с использованием 100 мкл Protein-DNA Precipitation Solution, помещали пробирку в лед на 5 мин, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11 тыс об/мин. После этого отбирали РНК-содержащий супернатант в пробирку, содержащую 300 мкл 100% изопропанола, перемешивали и центрифугировали в течение 3 мин при 11 тыс об/мин. Удаляли супернатант, добавляли 300 мкл 70% этанола и промывали осадок РНК. Центрифугировали в течение 1 мин при И тыс об/мин, сливали спирт, высушивали РНК и растворяли в 50 мкл RNA Hydration solution.
Контроль качества выделенных препаратов РНК проводили с помощью спектрофотометра UVmini-1241 (Shimadzu, Япония), а также электрофорезом в 0.8%-ном агарозном геле, содержащем 0.5 мкг/мл бромида этидия. В использованных образцах РНК соотношение оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм (А2бо/А28о) находилось в пределах 1.9-2.1.
Ремоделирование левого желудочка и основные параметры гемодинамики у больных эссенциальной гипертензией
Гипертрофия левого желудочка является независимым фактором риска сердечно-сосудистых осложнений как в общей популяции, так и среди больных эссенциальной гипертензией. Развитие ЭГ неминуемо сопровождается процессами ремоделирования миокарда левого желудочка, большой интерес представляет анализ структурно-геометрических показателей и параметров внутрисердечной гемодинамики у больных неосложненной ЭГ, так и перенесших инфаркт миокарда и инсульт.
В результате сравнения структурно-геометрических показателей у больных двух групп (ЭГ и ЭГ+ИМ), оказалось, что у больных, перенесших ИМ, преобладают процессы дилатации левого желудочка. В частности, у них отмечается увеличение объемных показателей ЛЖ (КДР ЛЖ, КСР ЛЖ, К ДО ЛЖ и КСО ЛЖ). В то же время, у этих пациентов по сравнению с больными ЭГ без ИБС в анамнезе, не обнаружено значимого увеличения массы миокарда ЛЖ, индекса массы миокарда и объема миокарда ЛЖ, но наблюдается уменьшение толщины задней стенки левого желудочка (1.06±0.14 и 1.12±0.18, Р=0.002], а также снижение индекса относительной толщины миокарда (0.40±0.08 и 0.45±0.08, РО.001).
Наряду с нарушениями структурно-геометрических параметров, у больных ЭГ, перенесших ИМ, выявлены также показателей внутрисердечной гемодинамики. У данных больных отмечено некоторое снижение фракции выброса (58.52±6.70 и 48.83±13.61 соответственно, РО.001) и фракции укорочения (33.15±6.24 и 26.74±8,50 соответственно, Р 0.001). Тем не менее, уменьшения ударного объема в указанной группе по сравнению с больными неосложненной ЭГ, не наблюдалось (73.17±17.29 и 73.89±18.58 соответственно, Р=0.22), возможно, за счет увеличения КДО ЛЖ (154.19±54.98 и 123.93±31.28, Р О.001).
Следует отметить, что у больных ЭГ, перенесших инсульт, не обнаружено значимых различий с больными неосложненной ЭГ по структурно-геометрическим параметрам сердца и показателям внутрисердечной гемодинамики (табл. 1, приложение).
При анализе распределения больных по типам рёмоделирования, получены следующие результаты. Ремоделирование первого типа (нормальная геометрия) встречалось с практически одинаковой частотой во всех клинических группах. Второй тип (концентрическое ремоделирование) несколько чаще наблюдался у больных с неосложненной ЭГ (14.18% и 5.85%, соответственно, Р=0.06). Третий и четвертый типы рёмоделирования - изолированная гипертрофия межжелудочковой перегородки и задней стенки левого желудочка -встречались с частотой, соответственно, 4.63% и 6.48% у больных неосложненной ЭГ, 8.33% и 1.19% у больных ЭГ, перенесших ИМ. Концентрическая гипертрофия (V тип) наблюдается в 24.07% случаев у больных неосложненной ЭГ, и в 16.67% случаев у больных, перенесших ИМ. Шестой и седьмой типы рёмоделирования (эксцентрическая гипертрофия без дилатации и с дилатацией полости ЛЖ) встречается с большей частотой у пациентов с ИМ в анамнезе (19.05% и 22.22%, Р=0.84, и 28.57% и 5.56%, РО.001, соответственно). Эксцентрические типы рёмоделирования встречаются у большинства (47.62%) больных, перенесших ИМ, тогда как у больных неосложненной ЭГ преобладают концентрические варианты рёмоделирования (27.78 и 49.99% соответственно).
Результаты сравнительного анализа структурно-геометрических параметров и показателей внутрисердечной гемодинамики с учетом типа ремоделирования представлены в таблицах 7 и 8. Наименьшие значения как линейных (КДР ЛЖ, КСР ЛЖ), так и объемных показателей (КДО ЛЖ, КСО ЛЖ) отмечались в группе больных ЭГ с нормальной геометрией ЛЖ, концентрическим ремоделированием, изолированной гипертрофией межжелудочковой перегородки и задней стенки левого желудочка. Максимальные значения показателей КДР ЛЖ, КСР ЛЖ, КДО ЛЖ, КСО ЛЖ наблюдались у больных с VII типом ремоделирования. Аналогично происходило изменение массы миокарда ЛЖ, наибольшие значения отмечены в группах пациентов с V, VI и VII типами ремоделирования. У больных с концентрической гипертрофией левого желудочка, по сравнению с больными с концентрическим ремоделированием, также была увеличена толщина стенок миокарда ЛЖ (ИОТ), снижаясь в группах с эксцентрическим ремоделированием. Следует отметить, что показатели ФВ изменялись не столь значительно (минимальное значение достигалось в группе больных с VII типом ремоделирования — 55.50±9.12). Показатели УО были минимальны в группах с концентрическим ремоделированием, концентрической гипертрофией, изолированной гипертрофией межжелудочковой перегородки и задней стенки левого желудочка. Максимальные значения УО отмечены в группах с VI и VII типами ремоделирования, что, возможно, является проявлением закона Франка-Старлинга, согласно которому УО ЛЖ зависит от его конечно-диастолического объема [1].
У больных ЭГ, перенесших ИМ, наблюдались в целом схожие тенденции, которые, однако, носили более выраженный характер. У больных с эксцентрическими типами ремоделирования, по сравнению с пациентами с нормальной геометрией ЛЖ, наблюдалось более значимое увеличение как линейных, так и объемных показателей. В этих же группах отмечалось существенное снижение толщины стенки левого желудочка. Функциональное состояние ЛЖ, оцениваемое по показателю фракции выброса, также изменялось более значительно (37.25±11.78 и 52.53±11.33, Р 0.001). Кроме того, следует отметить, что у больных, перенесших ИМ на фоне предсуществующей ЭГ, наблюдалось более выраженное увеличение массы миокарда ЛЖ в группе пациентов с концентрической гипертрофией ЛЖ(164.29±44.55 и 132.96±11.65, РО.001).
Таким образом, в результате проведенного анализа выявлено, что для больных ЭГ наиболее характерно развитие концентрических вариантов ремоделирования, в этой группе также менее выражены процессы дилатации левого желудочка. У пациентов с ЭГ, перенесших инфаркт миокарда, чаще встречаются эксцентрические типы ремоделирования, в том числе сопровождающиеся нарастанием объемных показателей, массы миокарда и дилатацией полости ЛЖ (снижение показателей индекса относительной толщины стенки левого желудочка, толщины межжелудочковой перегородки и задней стенки левого желудочка, уменьшение фракции выброса и ударного объема)
