Роль маркеров клеточного обновления (Bcl-2, Ki-67) и апоптоза эпителиоцитов в возникновении и прогрессировании заболеваний желудка, ассоциированных с Helicobacter pylori Коган Наталья Юрьевна

Содержание к диссертации

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. Современные вопросы патогенеза, диагностики и прогнозирования
течения заболеваний желудочно-кишечного тракта, ассоциированных с Н. py
lori (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 11

1. Хеликобактериоз как клиническая проблема 11

2. Актуальные вопросы патогенеза различных форм гастритов, ассоциированных с Н. pylori 12

3. Ульцерогенез и его связь с Н. pylori 21

4. Роль хеликобактериоза в «каскаде Корреа» 25

5. Апоптоз и клеточная пролиферации при заболеваниях, ассоциированных с Н. pylori 31

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования. (РЕЗУЛЬТАТЫ

СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ) 44

2.1 .Общая характеристика обследованных пациентов 44

2.2. Методы исследования 46

6. Внутрижелудочная рН-метрия 46

7. Гистиобактериоскопия 46

8. Морфологические исследования слизистой оболочки желудка 47

4. Специальные методы морфологического исследования слизистой оболочки желудка 47

5. Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений 49

6. Статистическая обработка полученных результатов

исследования 50

ГЛАВА 3. Клинико-эндоскопическая, рН-метрическая, морфологическая и им-
муноморфологическая характеристика группы сравнения 51

ГЛАВА 4. Клинико-эндоскопические, функциональные, морфологические и
иммуногистохимические критерии хеликобактерассоициированных заболева
ний желудка неопухолевого генеза до и спустя 2 месяца после эрадикационной
терапии 55

1. Клинико-эндоскопическая, рН-метрическая, морфологическая характеристика больных с хроническим атрофическим гастритом до - и после проведения эрадикационной терапии 55

2. Гистологическая характеристика эпителия слизистой оболочки желудка у пациентов с хроническим атрофическим гастритом 59

3. Патогенетические аспекты нарушения процессов клеточного обновления у пациентов с хроническим атрофическим гастритом 65

4. Клинико-эндоскопическая и рН-метрическая характеристика группы больных с язвенной болезнью желудка до - и после проведения эрадикационной терапии 68

5. Гистологическая характеристика эпителия слизистой оболочки желудка у пациентов с язвенной болезнью желудка 72

6. Патогенетические аспекты нарушения процессов клеточного обновления у пациентов с язвенной болезнью желудка 75

ГЛАВА 5. Клинико-эндоскопические, функциональные, морфологиче
ские и иммуногистохимические критерии заболеваний желудка опухолевого
генеза, ассоциированных с Н. pylori до - и спустя 2 месяца после проведения
эрадикационной терапии 80

7. Клинико-эндоскопическая и рН-метрическая характеристика группы больных с аденоматозными полипами 80

8. Гистологическая характеристика слизистой оболочки желудка у пациентов с аденоматозными полипами 85

9. Патогенетические аспекты нарушения процессов клеточного обнов-

ления у пациентов с аденоматозными полипами 87

4. Клинико-эндоскопическая и рН-метрическая характеристика пациентов с раком желудка 90

5. Гистологическая характеристика слизистой оболочки желудка у пациентов с раком желудка 93

6. Патогенетические аспекты нарушения процессов клеточного обновления у пациентов с дистальным раком желудка 96

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 102

ВЫВОДЫ 108

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 109

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ПО

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ТЕКСТЕ СОКРАЩЕНИЙ 133

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

К заболеваниям, ассоциированным с Helicobacter pylori (Н. pylori), традиционно относят хронический гастрит, язвенную болезнь желудка (ЯБЖ) и двенадцатиперстной кишки, рак желудка (РЖ). При этом воспаление слизистой оболочки желудка (СОЖ), вызванное Н. pylori, сопровождается нарушением клеточного обновления, на ранних этапах которого избыточная пролифератив-ная активность эпителиоцитов СОЖ компенсируется пропорциональным нарастанием апоптоза, а затем - пролиферативный потенциал эпителиоцитов значительно преобладает над апоптозом [Konturek PC . et al., 2003; Leite KR. et al., 2005; Penta R., et al., 2005]. От характера нарушений параметров клеточного обновления (соотношения апоптоза и пролиферативной активности эпителиоцитов СОЖ) зависит формирование различных заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), ассоциированных с Н. pylori. В настоящее время не остается сомнений в возможности прогрессирования хронического хеликобак-терного гастрита с развитием тотального гастрита с атрофией слизистой как ан-трального, так и фундального отделов, а также диспластических, метапластиче-ских изменений СОЖ и РЖ [Соггеа Р., 1992; Jung J.T. et al., 2005; Shiotani A. et al., 2005]. Формирование РЖ у больных с хеликобактериозом отмечается в 2-9 раз чаще, чем у неинфицированных [Пасечников В.Д. и соавт., 2002; Аруин Л.И., 2004; Маев И.В. и соавт., 2006]. Однако остается дискутабельным вопрос о том, являются различия в индексе апоптоза и пролиферации результатом воздействия определенных штаммов Н. pylori или следствием своеобразного иммунного ответа макроорганизма и возможно ли улучшение течения пролифера-тивных процессов после достижения эрадикации [Кононов А.В., 1999; 2002; Исаков В.А. и соавт., 2003; Маев И.В. и соавт., 2003; 2006; Блашенцева С.А. и соавт., 2003; Коломоец А.Н. и соавт., 2006]. На протяжении последних десятилетий неоднократно проводились попытки прогнозирования течения хрониче-

ского гастрита, риска развития язвенной болезни и РЖ [Успенский В.М., 1984; Аруин Л.И. и соавт., 1993; 1998; Голофеевский В.Ю., 2005]. Несмотря на большие успехи, достигнутые в этом направлении, прогноз возникновения язвенной болезни, РЖ, мальтомы желудка и других заболеваний, ассоциированных с Н. pylori не всегда адекватен [Hunt J.D. et al., 2001; Shiemann U. et al., 2002]. Bo многом это связано с полиэтиологичностью данных заболеваний.

В настоящее время важнейшее значение в прогрессировании нарушений клеточного гомеостаза эпителиоцитов СОЖ при хеликобактерной инфекции принадлежит Ki-67, р53, PCNA, антиапоптозной молекуле Вс1-2 и апоптозу [Аруин Л.И. и соавт., 1998; Бондаренко О.Ю. и соавт., 2003; Guarner J. et al., 2005]. Однако характер и степень изменений их показателей на пути прогрес-сирования хронического хеликобактерного гастрита недостаточно изучены. Ведутся исследования, посвященные роли Н. pylori в патогенезе гиперпластических полипов желудка [Murakami К. et al., 2001]. Неизвестны степень их изменений при аденоматозных полипах желудка, возникших на фоне атрофических и метапластических изменений СОЖ, связанных с хеликобактериозом [Ljubicic N. et al., 2002]. Наличие ЯБЖ и/или аденоматозных полипов значительно увеличивает риск возникновения РЖ. С другой стороны, эти заболевания не являются стадиями «каскада Корреа» - общепризнанной схемой реализации канцерогенеза у пациентов с Н. pylori [Correa P., 1992]. Таким образом, патогенетические аспекты возникновения и рецидивирования ЯБЖ и аденоматозных полипов нуждаются в дополнительном изучении.

Данные, характеризующие соотношение пролиферации и апоптоза при заболеваниях желудка, ассоциированных с Н. pylori, носят противоречивый характер. Недостаточно изучена возможность обратного развития предраковых состояний и изменений под влиянием успешно выполненной эрадикационной терапии Н. pylori. Весьма противоречивы данные по поводу проведения эрадикационной терапии Н. pylori у больных с дистальным РЖ, перенесших субтотальную резекцию желудка [Uemura N. et al, 1997; Sung J.J. et al., 2000]. Есть

данные ряда исследований, что Н. pylori способствует возникновению РЖ, минуя стадии атрофии, кишечной метаплазии и дисплазии, патогенез которого нуждается в дальнейшем изучении [Faraji E.I. et al., 2002; Минушкин O.H. и со-авт., 2005]. В свою очередь, решение данных вопросов позволило бы адекватно прогнозировать степень риска возникновения и прогрессии предраковых состояний и изменений, рецидивов РЖ после радикальной терапии, улучшить их раннюю диагностику и, следовательно, оптимизировать лечение заболеваний желудка, ассоциированных с Н. pylori.

Цель исследования. Разработать прогностические критерии возникновения и течения заболеваний желудка, ассоциированных с Н. pylori, на основе комплексного изучения патогенетической роли клеточного обновления эпите-лиоцитов СОЖ, расширить понимание патогенеза возникновения эрозивно-язвенных поражений, атрофических, диспластических и неопластических изменений слизистой оболочки.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Оценить состояние клеточного обновления эпителиоцитов слизи
стой оболочки желудка и механизмы его нарушения при язвенной болез
ни желудка, хроническом атрофическом гастрите, аденоматозных поли
пах и раке желудка.

2. Выявить взаимосвязь между клинико-эндоскопическими, рН-
метрическими показателями, морфологическими индикаторами, инфици-
рованностью Н. pylori и процессами клеточного обновления при заболе
ваниях желудка, ассоциированных с Н. pylori.

3. Определить влияние эрадикационной терапии Н. pylori на клини-
ко-эндоскопические, морфологические, рН-метрические показатели и
процессы клеточного обновления при заболеваниях желудка, ассоцииро
ванных с Н. pylori.

4. Определить прогностически значимую величину соотношения пролиферации к апоптозу эпителиоцитов слизистой оболочки желудка в плане возникновения и прогрессирования заболеваний желудка, ассоциированных с Н. pylori.

Научная новизна.

Впервые на основе изучения ядерного антигена пролиферирующих клеток (Ki-67), антиапоптозной молекулы Вс1-2 и апоптоза эпителиоцитов слизистой оболочки желудка определено место язвенной болезни желудка и аденоматозных полипов, возникших на фоне хронического атрофиче-ского гастрита как стадий прогрессии заболеваний желудка, ассоциированных с Н. pylori, являющихся составной частью «каскада Корреа».

В ходе проведенного исследования достигнуто расширение представления о патогенезе заболеваний желудка, ассоциированных с Н. pylori. Определено влияние Н. pylori на основные показатели клеточной пролиферации у больных с заболеваниями желудка, входящими в «каскад Корреа».

Практическая значимость.

Вычислены прогностически и диагностически значимые для возникновения отдельных заболеваний желудка, ассоциированных с Н. pylori, показатели отношения апоптозной к пролиферативной активности эпителиоцитов СОЖ. Последнее позволит улучшить диагностику и прогноз исследуемой группы болезней и, следовательно, оптимизировать проводимую терапию и систему диспансерного динамического наблюдения за больными с заболеваниями желудка, ассоциированными с Н. pylori.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Закономерности изменений клеточного обновления эпителиоцитов слизистой оболочки желудка, лежащие в основе возникновения и про-грессировании заболеваний, ассоциированных с Н. pylori, позволяют рас-

сматривать язвенную болезнь желудка как стадию хеликобактериоза, предшествующую хроническому атрофическому гастриту, а аденоматоз-ные полипы как стадию, следующую после хронического атрофического гастрита и предшествующую дистальному раку желудка.

2. Прогрессирование морфологических изменений слизистой оболочки желудка при хеликобактерной инфекции сопровождается нарастанием отношения пролиферации к апоптозу эпителиоцитов СОЖ. При этом происходит усиление как пролиферативного потенциала, выраженного через число клеток, иммунопозитивных к Кі-67 так и апоптоза эпителиоцитов слизистой желудка.

3. Эрадикация Н. pylori сопровождается улучшением показателей клеточного обновления, что допускает частичную обратимость таких морфологических изменений слизистой оболочки желудка, как атрофия, кишечная метаплазия и дисплазия.

4. В прогнозировании возникновения и течения Н. pylori ассоциированных заболеваний ведущее место принадлежит Кі-67, отражающего степень активности пролиферативных процессов, Вс1-2, характеризующего выраженность антиапоптозной активности, отношения показателя пролиферации к апоптозу эпителиоцитов слизистой оболочки желудка, степени атрофии фундального отдела желудка и рН желудочного сока.

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность гастроэнтерологического отделения клиник Самарского военно-медицинского института.

Материалы исследования используются в учебном процессе и лекционном курсе на кафедрах терапии и терапии (усовершенствования врачей) Самарского военно-медицинского института.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на 39-й, 40-й, 41-й итоговых научно-практических конференциях научно-педагогического состава

СамВМИ (Самара, 2006, 2007, 2008), XII, XIII Гастроэнтерологической неделе (Москва, 2006, 2007).

Всего по теме диссертационного исследования опубликовано 11 работ, в том числе 2 статьи - в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Оформлено и внедрено 1 рационализаторское предложение.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 229 источников, из них 52 отечественной и 177 зарубежной литературы. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 16 рисунками.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ВОПРОСЫ ПАТОГЕНЕЗА, ДИАГНОСТИКИ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА, АССОЦИИРОВАННЫХ С Н. PYLORI

1.1. Хеликобактериоз как клиническая проблема

Хеликобактериоз является «медленной» инфекцией [Blasser M.G., 1993]. Важнейшим из признаков «медленных» инфекций является то, что клинические формы болезни развиваются далеко не у всех инфицированных.

Развитие хеликобактерного гастрита является универсальным для всех форм хеликобактериоза. Хеликобактерный гастрит - специфическое заболевание, так как в данной экологической нише такой вид диффузного воспаления не способен вызвать никакой другой агент.

Воспалительный процесс в СОЖ, обусловленный Н. pylori, приводит к развитию повреждения желудочного эпителия. Нейтрофильные лейкоциты, инфильтрирующие СОЖ, синтезируют активные формы кислорода и соединения азота, являющиеся мощными окислителями, которые вызывают повреждение ДНК эпителиоцитов, перекисное окисление липидов и окисление белка [Fa-rihati F. et al., 1998]. «Окислительный взрыв» нейтрофилов наблюдается спустя очень короткое время после контакта их с Н. pylori, что обусловлено его способностью выделять водорастворимый белок, активирующий нейтрофилы [Evans D.J. et al., 1995; Zhang Q.B. et al., 1996].

Постоянное воспаление в СОЖ сопровождается нарушением клеточного обновления (увеличением пролиферативного потенциала и апоптоза) [Mirshahi F. et al., 1998; Beil W. et al., 1995]. Некрозы в СОЖ при Н. pylori ассоциированных заболеваниях, в том числе, и при ЯБЖ происходят исключительно редко. Таким образом, гибель клеток СОЖ при хеликобактерной инфекции происходит практически всегда через апоптоз. Значения индекса апоптоза варьируют, в широких пределах, в зависимости от индивидуальных особенностей макроор-

ганизма и формы хеликобактериоза. Дискутабельным остается вопрос о том, являются различия в индексе апоптоза (Ідпт) результатом воздействия различных штаммов Н. pylori или результатом своеобразного иммунного ответа макроорганизма [Исаков В.А. и соавт., 2003]. Большинство исследователей считает, что разница в апоптозе обусловлена особенностями местного иммунитета, складывающегося при хеликобактериозе. Установлено наличие способности Н. pylori активизировать «рецепторы смерти» клеток - Fas, расположенные на поверхности эпителиоцитов и Т-клеток. С другой стороны Fas-лиганд экспрессируют на своей поврехности эпителиоциты СОЖ, а также Т-лимфоциты, активированные хеликобактерной инфекцией. Кроме того, Т-клетки синтезируют ФНО-ос, ИФН-у - цитокины, обладающие синергизмом с Н. pylori в индукции апоптоза и увеличении экспрессии Fas на поверхности эпителиоцитов СОЖ [Wang J. et al., 2000; Houghton J. et al., 1999]. Степень апоптоза зависит также от гетерогенности главного комплекса гистосовместимости. Установлено, что эпителиоциты СОЖ при хеликобактериозе экспрессируют значительно больше антигенов главного комплекса гитосовместимости 2 типа, чем у неинфициро-ванных, что связано с действием ИФН-у [Engstrang L. et al., 1989]. Антигены главного комплекса гистосовместимости 2 типа, экспрессированные на поверхности эпителиоцитов СОЖ, связываются с антигенами Н. pylori (уреазой и др.) в результате чего индуцируется апоптоз [Fan X. et al., 2000].

От характера нарушений параметров клеточного обновления (соотношения апоптоза и пролиферативной активности эпителиоцитов СОЖ) зависит формирование различных заболеваний ЖКТ, ассоциированных с Н. pylori.

1.2. Актуальные вопросы патогенеза различных форм гастритов,

ассоциированных с Н. pylori

Под атрофическим гастритом понимают состояние, при котором в СОЖ наблюдается атрофия, проявляющаяся уменьшением количества специализированных желудочных желез. Развитие атрофии в СОЖ связано с аутоиммунным

гастритом или с прогрессированием хелибактерного гастрита [Аруин Л.И. и со-авт., 1998; Dixon M.F. et al., 1999]. Доказано, что не менее 2/3 случаев атрофи-ческого гастрита ассоциировано с Н. pylory [Annibale В. et al., 2001].

Согласно Rugge М. et al. (2002) выделяют два основных типа атрофии: метапластический и неметапластический. Неметапластический тип атрофии характеризуется потерей желез, сопровождается фиброзом или фибромускуляр-ной пролиферацией собственной пластинки СОЖ. При метапластическом типе происходит замещение желудочных желез метапластическими (кишечными), что может быть на фоне других морфологических признаков атрофии слизистой. Согласно Сиднейской классификации (1994) выделяют атрофию тяжелой степени - при потере более 60% желез, средней степени - при потере 30-60%) желез. При утрате менее 30% желез атрофические изменения расцениваются как легкие.

Jass J.R. et al. (1980) выделил полную и неполную метаплазию. Кишечная метаплазия полного типа (I типа) тонкокишечная характеризуется появление клеток Панета и бокаловидных клеток, продуцирующих сиаломуцины, которые характерны для тонкокишечной слизистой. Неполная метаплазия включает И, III типы, которые характеризуются наличием призматического эпителия и бокаловидных клеток. При II типе продуцируются нейтральные и кислые сиаломуцины. При III типе сульфомуцины. При III типе метаплазии отмечается расширение желез и отсутствие клеток Панета [Leung W.K. et al., 2002]. Считается, что разграничение типов метаплазии имеет важное прогностическое значение, так как вероятность развития рака желудка при Ш-типе метаплазии в 4 раза выше, чем при других типах [Filipe M.I. et al., 1994]. Наиболее часто при хронических гастритах встречается полная метаплазия. При доброкачественных заболеваниях желудка неполная метаплазия обнаруживается приблизительно у 11% больных, а при раке - у 94%>. Поэтому неполную метаплазию причисляют к предраковым заболеваниям [Lei D. et al., 1984]. Установлено, что объем мета-пластического поражения также прогностически важен в плане образования

РЖ. При эндоскопическом исследовании участки метаплазии окрашиваются метиленовым синим. Слабая метаплазия занимает до 5% поверхности желудка, умеренная до 20% и выраженная более 20%. Кишечная метаплазия является одной из самых частых находок при Н. pylori-ассоциированных заболеваниях. При ХАГ и РЖ ее обнаруживают практически у 100%) больных, при ЯБЖ у 81-100%), а при дуоденальных язвах у 47-54%) [Аруин Л.И. и соавт., 1998]. Установлено, что кишечная метаплазия в кардиальном отделе желудка встречается также часто, как и в антруме [Morales Т. et ah, 1997].

Основным фактором развития атрофического гастрита, ассоциированного с Н. pylori является его способность изменять процессы клеточного обновления эпителиоцитов СОЖ. Он способен влиять на клеточную пролиферацию и апоп-тоз. Установлено, что Н. pylori усиливает пролиферацию эпителиоцитов как в антральном отделе, так и в теле желудка. Данный факт был установлен по увеличению индексов метки пролиферирующего клеточного ядерного антигена (PCNA), Ki-67, увеличению пролиферативного компартмента [Jang T.G. et ah, 2000; de Freitas D. et ah, 2004; Jorge O. et ah, 2005]. Эрадикация H. pylori приводит к нормализации индекса метки, что говорит об оптимизации процессов пролиферации [Hoshi Т. et ah, 1999; Jorge О. et ah, 2005]. В теле желудка нормализация индекса метки Ki-67 происходит более длительно и наступает только через 6-13 мес. после эрадикации [El-Zimaity Н.М. et ah, 2000].

Механизмы ускорения пролиферативных процессов при инфекции Н. pylori широко обсуждаются. В настоящее время считается, что воспалительный процесс является фактором активации пролиферации. Причем чем он выражен-нее, тем скорость пролиферации выше. Данный механизм стимуляции пролиферации больше работает при антральном гастрите, когда после эрадикации Н. pylori происходит стихание воспалительного процесса и скорость пролиферации быстро восстанавливается. При гастрите тела желудка увеличение скорости пролиферации эпителиоцитов в основном связано с действием лимфоцитарной инфильтрации. Лимфоцитарная инфильтрация слизистой уменьшается медлен-

но, поэтому скорость пролиферации восстанавливается за длительный срок. У большинства пациентов с атрофическим гастритом и атрофическим гастритом с кишечной метаплазией инфильтрация собственной пластинки СОЖ Т-лимфоцитами сохраняется более года после проведенной эрадикации [Guarner J., 2005]. Считается, что лимфоциты выделяют интерлейкины, факторы роста, которые реализуют свои эффекты через рецепторы, экспрессированные на мембране эпителиоцитов, чье образование связано с действием аммония и токсинов, продуцируемых Н. pylori.

Установлено, что при хелибактерном гастрите в значительной мере увеличивается численность рецепторов к эпидермальному фактору роста. Данный механизм увеличения пролиферации является одним из самых мощных [Коп-turek Р.С. et al., 1997]. У больных с хроническим гастритом определяются уплощения эпителия, усиление митотической активности и синтеза ДНК, укорочение времени генерации, S-фазы и митоза [Райхлин Н.Т. и соавт., 1996]. Ускоренная пролиферация приводит к более быстрому перемещению не до конца дифференцированных эпителиоцитов из генеративной зоны в зоны расположения зрелых в функциональном плане клеток. Таким образом, формирование полноценных желудочных желез не происходит [Tahara Е., 1993].Доказано, что Н. pylori способна взаимодействовать с МНС II молекулами большого комплекса гистосовместимости на поверхности эпителиальных клеток, в результате чего в них происходит запуск апоптоза. Данный патогенетический механизм обусловливает прогрессирование атрофических изменений в СОЖ и развитие метаплазии. Чем выше обсемененность Н. pylori СОЖ, тем выраженнее воспалительный процесс и апоптоз [Jones N.L. et al., 1997; Suer-baum S. et al., 2002].

Индукция апоптоза при хеликобактероном гастрите может происходить также через активацию Fas-рецепторов, Fas-лигандов, расположенных на поверхности эпителиоцитов [Houghton J. et al., 1999]. При хеликобактерном гастрите индукторами апоптоза могут явиться аммиак, образующийся при действии

уреазы микроба на мочевину, окислы азота и активные формы кислорода, выделяющиеся из лейкоцитов [Шептулин А.А. и соавт., 1997].

Установлено, что Н. pylori обладает антигенной мимикрией, в результате чего происходит образование антиканаликулярных антител. Данный патогенетический феномен является универсальным. Образование антител приводит к апоптозу специализированных клеток [Negrini R. et al., 1997; Steininger H. et al., 1996]. Их наличие не зависит от расовой принадлежности [Ito М. et al., 2002]. Доказано, что при тяжелой атрофии СОЖ концентрация их в сыворотке крови значительно выше, чем у лиц с начальными проявлениями атрофии [Ito М. et al., 2002]. Данные о связи концентрации антиканаликулярных антител с эради-кацией Н. pylori носят весьма противоречивый характер [Muller Н. et al., 2001; Ito М. et al., 2002].

Важнейшим фактором усиления апоптоза является тот факт, что при ускорении пролиферации образуется большое число незрелых, генетически неполноценных клеток, которые значительно быстрее подвергаются элиминации. Эти клетки больше подвержены повреждающему действию окислов азота и пе-роксинитритов, продуцируемыми клетками воспалительного инфильтрата [Mannick Е.Е. et al., 1996].

Считается, что CagA⁺ штаммы Н. pylori и, особенно, CagA⁺VacA⁺ подтипа si а в значительно большей мере стимулируют пролиферативную активность эпителиоцитов СОЖ, чем CagA негативные. Ген cagA⁺ (цитотоксин-ассоциированный ген) является маркером островка патогенности PAI, который состоит из 37000 Ьр и кодирует образование протеина CagA с молекулярной массой 120кДа. Протеин CagA ассоциирован с язвенной болезнью, РЖ и лим-фомой [Ikenoue Т. et al., 2001]. Поступление в эпителиоциты СОЖ CagA вызывает мобилизацию и реорганизацию актина, индукцию ростковых факторов, продукцию различных цитокинов. Считается, что у таких пациентов риск развития кишечной метаплазии в 12 раз и атрофического гастрита в 3 раза выше по сравнению с инфицированными CagA" [Cittelly D.M. et al., 2002]. Генотип

CagA VacA достоверно чаще ассоциируется с гастродуоденальной язвой, чем с другой патологией [Van Doom LJ. et al., 1999]. Суммируя сведения литературных источников, можно сказать о противоречивости данных на степень выраженности апоптоза у лиц инфицированных CagA⁺ штаммами. Так, Peek R.M. et al. (1997) считают, что апоптозный индекс у лиц, инфицированных CagA⁺VacA⁺ si а штаммом ниже, чем у больных инфицированных CagA" штаммами и более, того не отличается от нормальных значений [Peek R.M. et al., 1997]. Некоторые авторы считают, что апоптоз увеличивается при инфицированности такими штаммами [Moss S.F. et al., 2001]. По исследованиям, проведенным Л.И. Аруи-ном (1999), под влиянием Н. pylori расширяется зона пролиферации («проли-феративный компартмент»), площадь которой увеличивается с 15,4 до 45,6%, особенно за счет клеток, находящихся в S-фазе (с 33,4 до 79,5%). Параллельно с нарастанием пролиферации увеличивается и апоптоз эпителиоцитов СОЖ с 2,9 до 16,8%о. У здоровых лиц ускоренная пролиферация компенсируется ускорением апоптоза. При хеликобактерной инфекции происходит его замедление и генетически измененные клетки не успевают элиминироваться, что ведет к появлению кишечной метаплазии и эпителиальной дисплазии. Этот процесс развивается в течение 3-25 лет [Brenner M.J. et al., 2000]. Скорость нарастания ат-рофических изменений в СОЖ оценивается в 0,6-3,3% в год [Сиппонен П. И соавт., 1999].

Существует и другой путь канцерогенеза, ассоциированного с Н. pylori. В результате канцерогенного действия микроорганизма происходит нарушение экспрессии и мутация генов, ответственных за синтез белков базальной мембраны, - ламинина и коллагена IV типа, а также интегринов и протеинов zonula adherens - кадхерина и катенина. Этот процесс быстро прогрессирует с развитием РЖ. Злокачественное новообразование возникает из неопластического эпителия желудочных желез [Исаков В.А., 2002].

CagA⁺ способствует более интенсивной колонизации слизистой и - развитию более выраженного воспаления [Wirth Н.Р. et al., 1998].

Наличие в геноме Н. pylori гена iceAl связывают с возникновением язвенной болезни и острой нейтрофильной инфильтрацией СОЖ [Peek R.MJ. et al., 1998]. IceAl ассоциируется со степенью лимфоцитарной инфильтрации и эпителиальным повреждением, но не с нейтрофильной активностью, атрофией и интестинальной метаплазией [Noguera С. et al., 2001].

BabA - белок наружной мембраны Н. pylori с молекулярной массой 75кДа и семейство Нор-протеинов являются факторами адгезии [Suerbaum S. et al., 2002]. BabA -ген кодирует образование соответствующего протеина BabA (the blood group antigen binding adhesin). Данный белок является посредником сцепления между Lewis b антигенами группы крови человека на клетках желудочного эпителия и Н. pylori. Его количество определяет плотность колонизации. Ген ЬаЬА2 ассоциирован с язвенной болезнью и РЖ [Prinz С. et al., 2001].

Тройные позитивные штаммы (vacAs+cagA+babA2+) имеют более высокую специфичность для выявления язвенной болезни, чем cagA+ штаммы. Штаммы Н. pylori, содержащие тройной набор патогенных генов, ассоциируются с атрофическим гастритом, кишечной метаплазией, усилением пролиферации желудочного эпителия в антральнои части желудка и предрасполагают к развитию РЖ [Zambon C.F. et al., 2003]. С другой стороны есть исследования, данные которых свидетельствуют о том, что приведенные генотипы с язвенной болезнью и РЖ не ассоциируются [Wang J. et al., 2003; Louw J.A. et al., 2001].

Таким образом, сведения о связи того или иного штамма Н. pylori с различной патологией ЖКТ носят весьма противоречивый характер. В развитии определенной нозологической формы имеет значение комплекс различных факторов, включающей в себя наследственную предрасположенность, экологические, состояние иммунной системы и др.

Ф. Рокас (2002) придает большое значение в формировании той или иной патологии ЖКТ, ассоциированной с Н. pylori, возрасту, в котором наступило инфицирование. Если инфицирование ассоциируется с детством, то в дальнейшем возможно формирование мультифокального атрофического гастрита, яв-

ляющегося предраковым состоянием. Если инфицирование произошло в зрелом возрасте, то наиболее часто развивается антральный неатрофический гастрит.

Наличие «жгутиковых» генов flaA и flaB (flagellar) определяет подвижность Н. pylori. Образование гастродуоденальных язв ассоциируется с наличием обоих генов. При функциональной диспепсии эти гены встречаются редко [Habeed М.А. et al., 2001; Thoreson А.С. et al., 2000].

В настоящее время существует несколько штаммов Н. pylori. Данные о их взаимосвязи с той или иной патологией ЖКТ во многом противоречивы. Считается, что штамм vac As 1 ассоциируется с пептической язвой чаще, чем vacAs2. Отмечается взаимосвязь между дуоденальной язвой и vacA si ml-субтипом H.pylori [Choe Y.H. et al., 2002].

Интересным фактом представляется то, что после эрадикации Н. pylori происходит нормализация показателей пролиферативной активности эпителия СОЖ. При этом апоптоз, как правило, остается сниженным, что и обусловливает редкость обратного развития атрофии. Отсутствие нормализации апоптоза связывается с тем, что при атрофическом гастрите повышена экспрессия bcl-2 в эпителиоцитах, который защищает их стволовые клетки от апоптоза [Komatsu К. et al., 1996].

Доказано, что в эпителиоцитах при атрофическом гастрите повышается уровень цитокератина - 1, который не встречается в норме. Это говорит о том, что при атрофическом гастрите происходит формирование клеток с измененным генотипом, что отражается на их фенотипе. В силу этих обстоятельств ме-тапластически и диспластически изменные клетки обладают другими биологическими часами, иным апоптозом и пролиферативной активностью [Attallach A.M. et al., 1996]. Изменения клеточного генотипа имеют необратимый или трудно обратимый характер. Тем не менее, атрофия может подвергаться обратному развитию, что является доказанным фактом [Kokkola A. et al., 2002; Ito М. et al., 2002]. Считается, что в некоторых случаях возможно обратное развитие и кишечной метаплазии [Walker М.М. et al., 2003]. Только у 13,8%

пациентов с неатрофическом гастритом происходит экспрессия bcl-2 и как следствие этого - подавление апоптоза. У 70% больных с атрофическом гастритом и кишечной метаплазией определяются признаки подавления апоптоза [Нургалиева Б.К. и соавт., 2005].

Считается, что Н. pylori может запускать аутоиммунный процесс при хроническом аутоиммунном гастрите. У 20% пациентов с Н. pylori имеются антитела к Н⁺ /К⁺-АТФазе и париетальным клеткам. Установлено, что развитие панкреатита, сидеропенической идиопатической анемии, поражение сосудов, витилиго, розацеа, аутоиммунного тиреоидита, гиперпаратиреоидизма, гипертрихоза, гирсутизма, гиперпигментации кожи, прогрессирующих заболеваний центральной нервной системы, диабета и многих других заболеваний может быть связано с возникновением аутоиммунного процесса, ассоцированного с Н. pylori [Altshuler EX., 1999; Goto H. et al., 2001; Dokmetas H.S. et al., 2001; Szlachnic A., 2002; Quatrini M. et al., 2001].

На фоне H. pylori инфекции происходит увеличение синтеза ФНО-альфа, что является важным патогенетическим фактором угнетения пролиферативной активности и повреждения эпителиоцитов СОЖ. ФНО-а является основным медиатором воспаления.

Способность Н. pylori вызывать воспалительный процесс в СОЖ обусловлена выделением продуктов его жизнедеятельности. Морфологически такой воспалительный процесс характеризуется инфильтрацией собственной пластинки нейтрофильными лейкоцитами, лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками, формированием несвойственных желудку лимфоидных фолликулов и повреждением эпителия различной степени выраженности.

Основное патогенетическое значение среди продуктов жизнедеятельности Н. pylori имеют ферменты, а среди них уреаза. Благодаря ее воздействия на мочевину, выделяющуюся в просвет желудка, образуется аммиак. Аммиак действует на эндокринные клетки СОЖ. При этом происходит усиление секреции гастрина и угнетение продукции самостостатина, что потенциирует выделение

соляной кислоты и способствует формированию гиперацидного состояния. Ги-пергастринемия обнаруживается только у тех пациентов, у которых определяются высокие показатели обсеменения и адгезии. Другие ферменты, выделяемые этой бактерией, разрушают слизь (муциназы, фосфолипазы), повреждают клетки СОЖ (протеазы), способствуют синтезу высокотоксичных соединений, вызывающих гибель клеток (фосфолипазы). Таким образом, Н. pylori повреждает СОЖ, снижает ее защитную функцию и усиливает факторы агрессии, что приводит к развитию хронического антрального гастрита.

В настоящее время выделены цитотоксичные штаммы Н. pylori, способные вызывать деструкцию слизистой и развитие язвенных дефектов. Н. pylori высвобождает хемотаксические белки, обеспечивающие миграцию нейтрофи-лов, лимфоцитов, моноцитов.

1.3. Ульцерогенез и его связь с Н. pylori

Большинство ученых считает, что гастрит всегда предшествует язвенной болезни [Аруин Л.И. и соавт., 1998; Исаков В.А. и соавт., 2003]. Без гастрита возникновение язвенной болезни невозможно. Характер гастрита во многом определяет риск ее возникновения. Хронический антральный гастрит или пан-гастрит с отсутствием атрофии в фундальном отделе увеличивает риск появление язвенной болезни. Если при хроническом пангастрите определяются атро-фические изменения в фундальном отделе, то формирование язвенной болезни двенадцатиперстной кишки невозможно (ЯБДК), но развитие ЯБЖ может происходить, хотя вероятность этого невелика. Наличие хронического пангастрита или фундального гастрита с выраженной атрофией в фундальном отделе говорит о невозможности формирования язвенной болезни, а если имеется язва, то она злокачественная. При развитии атрофии слизистой антрального отдела желудка на фоне гастрита риск развития ЯБДК увеличивается в 10-32 раза [Sippo-nenP., 1995].

Таким образом, язвы желудка и двенадцатиперстной кишки - не просто нарушение целостности эпителия, а эпизодическое и рецидивирующее осложнение, накладывающееся на более выраженные и диффузные поражения слизистой оболочки, в виде гастрита типа «В» или гастродуоденита [Borsh G. et al., 1987].

Известно, что Н. pylori является возбудителем хеликобактерного гастрита язвенного типа. Доказано, что с персистированием Н. pylori связано более 90% язв двенадцатиперстной кишки и более 80% язв желудка. Н. pylori способен вызвать деструктивный процесс в слизистой с последующим развитием хронического гастрита, ЯБЖ и ЯБДК, экстранодальной В-клеточной MALT-лимфомы или аденокарциномы желудка [Щербаков П.Л. и соавт., 1999]. Доказанным является факт прямого язвообразующего действия Н. pylori. В 91% развитие язвенной болезни связано с CagA⁺ и VacA⁺ si фенотипом и только у 9% с другими штаммами Н. pylori [Atherton J.S. et al., 1995; FiguraN. et al., 1996].

Данные проведенных исследований показали, что при язвенной болезни, ассоциированной с Н. pylori, происходит значительное снижение средств защиты СОЖ. Это проявляется снижением гидрофобных свойств и нарушением состава структуры геля слизистой оболочки, уменьшением толщины слизистых наложений на поверхности слизистой оболочки [Newton J.L. et al., 2000]. Считается, что это связано с уменьшением синтеза и секреции слизи [Byrd J.S. et al., 2000]. Данные эффекты полностью обратимы после эрадикации.

При ЯБЖ происходит значительное изменение процессов клеточного обновления эпителия СОЖ, что связано с действием Н. pylori. Известно, что регенерация язвенного дефекта зависит от интенсивности пролиферации и апоптоза [Jones N.L. et al., 1997]. Хронизации язвенного дефекта на фоне хеликобактерного гастрита способствует высокая апоптозная активность эпителия [Аруин Л.И., 2000]. Доказано, что преобладание апоптоза над пролиферацией может привести к длительно нерубцующимся язвам. Считается, что у Н. pylori-инфицированных пациентов выше количество пролиферативных реакций, что

связано с длительно существующим повышенным апоптозом при хроническом воспалении слизистой оболочки в случае наличия язвенного дефекта [Нурга-лиева Б.К. и соавт., 2005]. При преобладании процессов пролиферации над апоптозом происходит закрытие язвенного дефекта. В дальнейшем при отсутствии рецидивирования язвенной болезни возможно практически полная нормализация клеточного обновления [Tahara Е. et al., 1993].

Исход гастрита определяется соотношением пролиферации и апоптоза. Насколько бы не была выражена пролиферативная активность эпителиоцитов СОЖ, если она уравновешивается апоптозом, структурных изменений слизистой не возникает [Аруин Л.И., 2002].

Преобладание митозов над апоптозами приводит к гиперплазии, апоптозов над митозами - к атрофии [Solary Е. et al., 1996]. Апоптоз -физиологический процесс и его нарушение ведет к нелегитимному выживанию клеток, патологии развития или к заболеваниям опухолевого и неопухолевого характера [Shirin Н. et al., 1999]. Важнейшая роль принадлежит апоптозу в развитии опухолей пищеварительного тракта и, в том числе РЖ. Считается, что канцерогенез является следствием недостаточности апоптоза, а не усиления пролиферации, связанное со степенью дифференциации опухоли [Фильченков А.А. и соавт., 1999; Ikeda М. et al., 1998; Jiang S. etal., 1999].

H. pylori непосредственно повреждает слизистую оболочку. Липополиса-харид его наружной мембраны (LPS) может взаимодействовать с ламинином базальной мембраны эпителия желудка. При этом происходит разрыв связей с интегрином и нарушается целостность эпителиального покрова. Эпителиоциты СОЖ утрачивают связь с базальной мембраной и слущиваются. Образуются микродефекты на поверхности слизистой [Moran А.Р., 1996]. Кроме того, липо-полисахариды стимулируют апоптоз [Piotrowski J. et al., 1996]. Губительно на эпителиоциты СОЖ действует ион аммония, образующейся из мочевины желудочного сока под действием уреазы и синтезирующиеся из него монохлорами-

ны [Mobley H.L. et al., 1996]. H. pylori потенциирует синтез провосполительных цитокинов: IL-lp\ IL-6, IL-8 и фактора некроза опухоли. Цитокины являются важными факторами повреждения СОЖ [Ricci V. et al., 2002]. В свою очередь, IL-8 способствует увеличению экспрессии Reg-протеина, что ассоциируется с повышенной пролиферацией эпителиоцитов СОЖ, инфильтрацией слизистой полиморфноядерными лейкоцитами и хроническим воспалением [Yoshino N. et al, 2005].

Н. pylori и активированные им лейкоциты повреждают эндотелий, питающих СОЖ капилляров, что приводит к микротромбобразованию и значительному ухудшению трофики [Yoshida N., et al., 1993]. Считается, что микротромбы и гипоксия могут стать причиной очаговых инфарктов слизистой, эро-зирования и изъязвления [Kalia N. et al., 1997; Маев И.В. и соавт., 2003]. Мик-ротромбобразование приводит к снижению выработки бикарбонатов в СОЖ, что является важным фактором защиты [Olbe L. et al., 2000].

Н. pylori способна изменять желудочную секрецию. Так, у инфицированных пациентов базальная кислотная продукция увеличивается в 3 раза, в 6 раз повышается кислотная продукция, стимулированная гастрин-рилизинг пептидом (ГРП), увеличивается максимальная кислотная продукция, стимулированная гастрином. После эрадикации происходит нормализация указанных параметров за исключением максимальной кислотной продукции, стимулированной гастрином [El-Omar Е.М. et al., 1995].

Установлено, что для реализации патологического процесса в СОЖ при инфицированности Н. pylori требуется соответствующая генетическая предрасположенность макроорганизма, определямая полиморфизмом гена ИЛ-1(3. Так, у пациентов с одним вариантом гена достоверно чаще возникает атрофия и ги-похлоргидрия, но почти не формируется гиперсекреция и ЯБДК, у других - наоборот [El-Omar Е.М. et al., 2001; Furuta Т. et al., 2002]. Считается, что ИЛ-ір стимулирует различные интрацеллюлярные сигнальные последовательности, участвующие в регуляции апоптоза, такие как NK-кВ, МАРК, Fas, и таким об-

разом, различные уровни синтеза ИЛ-ір в СОЖ могут влиять на изменение индекса апоптоза при H.pylori-ассоциированных заболеваниях ЖКТ.

1.4. Роль хеликобактериоза в «каскаде Корреа»

Хронический неатрофический и атрофический гастрит служат фоном для развития кишечной метаплазии и дисплазии эпителия СОЖ. В свою очередь кишечная метаплазия и дисплазия относятся к предраковым изменениям.

Рак дистальных отделов желудка - Н. pylori ассоциированное заболевание, возникающее из предшествующих ему кишечной метаплазии и дисплазии эпителия СОЖ. В настоящее время происходит снижение заболеваемости РЖ. Тем не менее, он является одной из самых распространенных опухолей человека и занимает второе по частоте место среди всех форм злокачественных новообразований [Аксель Е.М., 2001]. Ежегодная летальность от этого заболевания достигает 1000000 [Blaser M.J. et al., 1994; Sipetic S. et al., 2005]. Необходимо отметить, что у лиц, инфицированных Н. pylori, РЖ развивается в 2-6 раз чаще, а прогноз его хуже, чем у неинфицированных [Пасечников В.Д. и соавт., 2002; Penta R. et al., 2005]. Снижение заболеваемости РЖ объясняется сокращением количества инфицированных Н. pylori, что обусловлено более высоким уровнем потребления эссенциальных жирных кислот и полиненасыщенных жиров, которые ингибируют рост данного микроба, улучшением санитарных условий, а также профилактикой рака (своевременное лечение дисплазии) [Thompson L. et al, 1994].

РЖ возникает в результате длительной персистенции нарушенного клеточного гомеостаза, связанного с воздействием Н. pylori. Выделяют только два предраковых изменений желудка - это кишечная метаплазия и дисплазия желудочного эпителия [Vaira D. et al, 2002]. Развитие обеих форм предрака связано с онкогенным действием Н. pylori.

Таким образом, Н. pylori вызывает ряд, предшествующих возникновению РЖ изменений слизистой оболочки. Наличие кишечной метаплазии увеличивает риск развития РЖ в 10 раз [Filipe M.I. et al, 1994]. Кишечная метаплазия на-

блюдается у 43,1% Н. pylory-позитивных пациентов и только у 6,2% людей без микроорганизма [Пиманов СИ. и соавт., 2005]. В начале происходит возникновение хронического хеликобактерного гастрита, который с течением времени переходит в атрофический гастрит. На фоне атрофического гастрита формируются предраковые изменения - кишечная метаплазия и дисплазия желудочного эпителия, далее - РЖ. Данный процесс и носит название «каскада Корреа» [Correa P. et al., 1992].

Риск развития РЖ значительно возрастает при сочетании предраковых состояний и предраковых изменений (при умеренной дисплазии эпителия в 26 раз, а при тяжелой - в 132 раза) [Пасечников В.Д. и соавт., 2002]. Развитие РЖ определяется формой гастрита. В настоящее время установлено, что не выраженностью гастрита, а его формой (топографией) определяется риск раковой трансформации [Аруин Л.И., 2004]. Изолированный антральный гастрит не предрасполагает к развитию кишечной метаплазии, дисплазии и РЖ. Поверхностный гастрит с фундальной или мультифокальной локализацией приводит к потере желудочных желез с замещением их фиброзной тканью, но чаще мета-плазированным эпителием [Маев И.В. и соавт., 2006].

В качестве ключевого фактора, определяющего риск неопластической трансформации представляется ген интерлейкина - 1(3 (ИЛ-1В), индуцируемый Н. pylori. Интерлейкин-ір известен как мощный провоспалительный цитокин, ингибирующий желудочную секрецию [El-Omar Е.М. et al., 2001]. Е.М. El-Omar et al. (2000) сообщили, что генотипы IL-1B-511Т⁺/-31С⁺ и IL-lRN*2/*2 связаны с повышенным риском развития РЖ. Наличие "провоспалительных" ИЛ-1 генотипов ассоциируется с развитием РЖ кишечного типа с очень незначительной вероятностью возникновения РЖ диффузного типа [Machado J.S. et al., 2001]. Считается, что генотип ИЛ-1В больных и генотип VacA si /ml Н. pylori независимо ассоциируются с гипохлоргидрией и атрофическим гастритом [Atherton J. et al., 2002]. С другой стороны развитие «каскада Корреа» на много чаще происходит при инфицированности штаммами Н. pylori Cag⁺VacA⁺ и Cag⁺VacA~ [Котелевец СМ. и соавт., 2005; Hatakeyama М. et al., 2005]. Установлено, что

для этих штаммов хеликобактера характерным является непосредственное влияние на клеточное обновление в сторону усиления пролиферации и угнетения апоптоза. У таких больных выражена экспрессия bcl-2 - антиапоптозной молекулы.

Вс1-2 обнаруживается у 91,3% больных с неполной кишечной метаплазией и 81% больных с дисплазией [Saegusa М. et al., 1995]. В результате этого время жизни эпителиоцитов увеличивается, что ведет к сохранению и накапливанию незрелых клеток. С другой стороны экспрессия такой проапоптозной молекулы как В ах при кишечной метаплазии и дисплазии в слизистой антраль-ного отдела и угла желудка значительно снижается [Xia Н.Н. et al., 2002]. Доказано, что после терапии фолиевой кислотой при предраковых изменениях индекс апоптоза и экспрессия р53 значительно возрастает, а экспрессия Вс1-2 -снижается [Cao D.Z., 2005].

Имеются исследования, подтверждающие, что VacA⁺ штаммы чаще ассоциируются с возникновением язвенной болезни, атрофическим гастритом и РЖ, чем с хроническим неатрофическим гастритом [Пасечников В.Д. и соавт., 2000]. При этом генотип VacAl si /ml связан с карциномой желудка [Вак-Romanisczyn L. et al., 2002]. VacA ингибирует продукцию кислоты в желудке, увеличивает секрецию пепсиногена, индуцирует секрецию кислых гидролаз, повреждает расщепляющую способность эндосом и лизосом, ингибирует клеточную пролиферацию, нарушает презентацию антигена, повреждает митохондрии, дезорганизует цитоскелет клеток желудочного эпителия [Ricci V. et al., 2002]. VacA вызывает освобождение цитохрома С из мембраны митохондрий и индуцирует апоптоз [Suerbaum S. et al., 2002]. Экспрессия циклина Е при хели-кобактерной инфекции значительно увеличена, что стимулирует клеточную пролиферацию [Yao Y.L. et al., 2002].

Доказано, что Н. pylori изменяет экспрессию большинства сигнальных молекул, участвующих в процессах клеточного обновления (PCNA, р53, c-erbB-2, Вс1-2 и др.) [Jorge О. et al., 2003]. Все это неминуемо приводит к развитию дисплазии и кишечной метаплазии эпителия СОЖ. Тем не менее, этого недос-

таточно для возникновения РЖ. У пациентов с дисплазией эпителия инфицированных Н. pylori значительно чаще по сравнению с неинфицированными, происходит мутация в гене c-met. Вероятность возникновения такой мутации увеличивается по мере нарастания скорости пролиферации. Если у пациентов с хе-ликобактерной инфекцией возникает РЖ, то он также экспрессирует c-met и обладает худшим прогнозом по сравнению с опухолями не экспрессирующих данный протоонкоген [Zhuang X. et al., 2001]. Гипергастринемия, сопутствующая хеликобактерному гастриту, потенциирует пролиферацию эпителия СОЖ. При атрофическом гастрите гипергастринемия достигает еще более выраженных значений [Li Н. et al., 1996].

При гастрите, ассоциированным с Н. pylori, в генеративной зоне заметно увеличивается численность клеток, содержащих р53, что связано с процессом адаптации к длительному повреждению и ослаблению противоопухолевой защиты. При хеликобактерном гастрите, а также в участках метаплазии и диспла-зии увеличивается количество клеток, с мутациями в гене р53, что связано с длительным периодом существования гиперпролиферации. Ген р53 стимулирует апоптоз и ингибирует ген bcl-2. Доказано, что мутация в гене р53 у инфицированных Н. pylori больных возникает только в случае характерного полиморфизма гена ИЛ-1(3 [Guerra J. et al., 2002]. При мутации гена р53, он может приобретать противоположные свойства и, следовательно, ингибировать апоптоз. Белок р53, синтезирующейся данным геном ответственен за апоптоз клеток с поврежденным геномом [Wang J. et al., 2002].

Снижение экспрессии р53 в эпителии СОЖ после эрадикации Н. pylori говорит о его важной роли в канцерогенезе [Satoh К. et al., 2001]. При хеликобактерном гастрите содержание аскорбиновой кислоты в желудочном соке снижается в 3 раза по сравнению с практически здоровыми, что является важным фактором канцерогенеза [Dabrowska-Ufhiarz Е. et al., 2002]. У пациентов с хеликобактерным гастритом нарушено всасывание и транспорт аскорбиновой кислоты из сыворотки крови в желудочный сок [Woodward М. et al., 2001; Cor-rea P. et al., 1995]. У пациентов, инфицированных Cag⁺ штаммами, содержание

аскорбиновой кислоты в желудочном соке было в два раза меньше, чем у инфицированных Cag" штаммами [Rokkas Т. et al., 1999]. Н. pylori снижает концентрацию и других важнейших антиоксидантов (Р-каротина и а-токоферола) [Zhang Z.W. et al., 2000]. Доказано, что после эрадикации содержание аскорбиновой кислоты в желудочном соке нормализуется [Rokkas Т. et al., 1995].

Таким образом, «каскад Корреа» формируется за счет способности H.pylori непосредственно изменять процессы клеточного обновления эпителио-цитов СОЖ, в результате чего происходит накопление генетически измененных клеток, что ведет к появлению метаплазии, дисплазии и неоплазии. Кроме того, Н. pylori нарушает важнейшие механизмы защиты, что и позволяет прогрессировать указанным изменениям вплоть до развития РЖ.

Заслуживают внимание данные о том, что с одной стороны Н. pylori может вести себя как симбионт или комменсал [Blasser M.J. et al., 1999; Мансуров X.X., 2005]; с другой - выступать ко-канцерогеном и способствовать реализации «каскада Корреа» с развитием РЖ. По мнению D. Forman (1996), адекватная эрадикация, в большинстве своем, способна предотвратить возникновение РЖ у большей части населения планеты. Однако существует мнение, что эрадикация Н. pylori в качестве профилактики РЖ совершенно не оправдана или должна быть исключительно выборочной [Циммерман Я.С., 2004]. Она может быть рекомендовано только при предраковых состояниях и изменениях, а также при наличии удаленного злокачественного новообразования желудка [Пахарес-Гарсия X., 2002; Баранская Е.К. и соавт., 2002]. Это подтверждается тем, что РЖ возникает только у 1-2% инфицированных Н. pylori, а при распространенном атрофическом процессе в СОЖ, появлении очагов кишечной метаплазии и развитии РЖ, Н. pylori, как правило, исчезает из желудка, что говорит о том, что данный микроорганизм играет роль пускового механизма в развитии рака, но не является истинным канцерогеном [Webb P.M. et al., 2001].

He вызывает сомнения тот факт, что имеется тесная взаимосвязь между раком дистальных отделов желудка и Н. pylori. Многие исследователи придерживаются мнения, что при эрадикации Н. pylori риск возникновения ГЭРБ, кар-

диального РЖ, рака пищевода, пищевода Баррета возрастает в 2 раза и более [Fallone С.А. et al, 2000; Vaezi M.F. et al, 2000; Loffeld R.J.L.F. et al., 2002]. Предполагается, что существует баланс между позитивным и негативным влиянием H.pylori [Blaser M.J., 1998]. Авторы считают, что примером защитного действия микроорганизма может служить то, что у инфицированных H.pylori может развиваться ЯБДК, но при этом не возникает РЖ и изолированный фун-дальный атрофический гастрит (тип А), не связанный с хеликобактерной инфекцией, а мультифокальный атрофический гастрит предохраняет от развития ЯБДК.

В настоящее время доказана взаимосвязь между Н. pylori и возникновением различных типов полипов в желудке, толстой кишке, носовых пазухах. Считается, что эрадикация Н. pylori приводит к самопроизвольному исчезновению гиперпластических полипов СОЖ. В некоторых случаях обратного развития гиперпластических полипов не происходит, что, связано с персистенциеи высокого уровня гастрина на фоне атрофии желез антрального отдела желудка [Ohkusa Т., 2003]. В патогенезе образования гиперпластических полипов и канцерогенезе особое значение придается избыточной продукции мезенхимальны-ми клетками циклооксигеназы -2 [Bamba Н. et al., 2003]. Считается, что возникновение гиперпластических полипов желудка и колоректального рака может явиться отдельным синдромом, связанным с гипергастринемией, соответствующими изменениями СОЖ, ассоциированными с Н. pylori [Niv Y. et al., 2003].

Установлено, что возникновение гиперпластических полипов связано с активацией рецепторов эпидермального фактора роста. Их активация достигается стимуляцией выработки металлопротеаз и ИЛ-8 [Joh Т. et al., 2005]. Гиперпластические полипы чаще всего ассоциируются с воспалительными изменениями и инфильтрацией СОЖ полиморфноядерными лейкоцитами. Появление аденоматозных полипов связывают с воспалительными изменениями инфильтрацией и инфильтрацией полиморфноядерными лейкоцитами в сочетании

с атрофией и метаплазией СОЖ [Ljubicic N. et al., 2002; Palacios Salas F. et al., 2003].

У 5% пациентов с атрофией слизистой оболочки тела желудка отмечается развитие доброкачественных эпителиальных полипов. Гиперпластические полипы желудка являются предраковым состоянием. У 91,7% больных наличие гиперпластических полипов ассоциируется с Н. pylori. При этом у 79,2% пациентов с гипертрофическими полипами определяется атрофия тела желудка [Di Giulio Е., 2005; Dirschmid К., 2006]. На начальном этапе существования гиперпластических полипов происходит увеличение экспрессии молекул р21 WAF1/CIP1 и циклина D_b что сочетается с высокой степенью обсемененно-сти Н. pylori СОЖ и выраженным воспалительным процессом. Затем, по мере развития дисплазии эпителия слизистой полипа констатируется увеличение апоптозной активности, экспрессии Ki-67 и р53. При этом в 41% случаев увеличение экспрессии р53 ассоциируется с мутациями в соответствующем гене. В то же время обсемененность СОЖ Н. pylori снижается и степень воспалительных изменений уменьшается [Murakami К. et al., 2001]. N. Ljubicic et al. (2002) и J.T. Jung et al (2005) установили, что гиперпластические полипы наиболее часто ассоциируются с Н. pylori и поверхностным, но не атрофическим гастритом, а развитие аденоматозных полипов, как правило, констатируется на фоне атро-фического гастрита и кишечной метаплазии. Однако характер нарушений клеточного обновления при аденоматозных полипах, ассоциированных с Н. pylori, остался недостаточно изученным.

1.5. Апоптоз и клеточная пролиферации при заболеваниях, ассоциированных с Н. pylori

Ведущая роль в регуляции процессов клеточного обновления в СОЖ при Н. pylori ассоциированных заболеваниях принадлежит циклинам, Кі-67, апоп-тозу, bcl-2 и р53 [Jang Т.С. et al., 2000; Satoh К. et al., 2001; Нургалиева Б.К. и соавт., 2005]. Эти факторы являются основополагающими в определении течения и прогноза опухолевого процесса на относительно большой срок

[Kawaura Y. et al., 2001; Kirgidis A. et al., 2005]. Развитие той или иной патологии ЖКТ, ассоциированной с Н. pylori, зависит от соотношения процессов пролиферации и апоптоза.

Известно, что процесс прохождения клетки по всем периодам клеточного цикла строго регламентирован. Клеточный цикл находится под контролем специальных регуляторных молекул, обеспечивающих во-первых: прохождение клетки по определенному периоду клеточного цикла и во-вторых - переход из одного периода в другой. В каждой клетке конституционно присутствуют специальные белки-ферменты, контролирующие активность генов, осуществляющих прохождение клетки по тому или иному периоду клеточного цикла. Данные белки-ферменты относятся к циклин-зивисимым протеинкиназам (cdc), которые активируются соответствующими циклинами, синтезирующимися на определенных фазах митотического цикла [Shamma A et al.,1998].

Поворотным пунктом в исследовании канцерогенеза являются открытия, сделанные Леландом Хартвеллом, Тимом Хантом (Лондон, Великобритания) и П. Нерсом, получившим в 2001 году Нобелевскую премию по медицине. В результате проведенных ими исследований был открыт новый класс белков, регулирующих функцию генов, ответственных за размножение клеток. Эти белки получили название циклинов. Данное открытие по заявлению представителей Нобелевского Комитета имеет ключевое значение для понимания механизмов развития рака и разработки новых средств лечения опухолей.

В настоящее время установлено, что в течение клеточного цикла экспрессия циклинов в значительной мере изменяется. Известны несколько классов циклинов (от А до Е). Каждый класс циклинов ответственен за регуляцию различных фаз клеточного цикла [Завалишина Л.Э. и соавт., 2000].

Количество циклинзависимых протеинкиназ непостоянно и зависит от периода клеточного цикла. При любой патологии, связанной с нарушениями клеточного обновления, в том числе, и при Н. pylori ассоциированных заболеваниях их синтез нарушается, появляются мутантные - неполноценные в функциональном плане формы с измененными свойствами. При этом происходит нарушение клеточного цикла. Следует подчеркнуть, что циклин-зависимые протеиназы находятся в клетках в неактивном состоянии, а для их активации и полноценной работы необходимы различные типы циклинов. Циклины в клетке присутствуют непостоянно, что связано с быстрым их синтезом и стремительным распадом. Благодаря этому обстоятельству происходит регуляция работы циклин-зависимых протеинкиназ.

Синтез различных циклинов отмечается в строго определенный период клеточного цикла. Например, прохождение клетки по Gj- периоду клеточного цикла обеспечивается комплексом циклин-зависимой проте-инкиназы-2 (cdk2) и циклина Di, циклин-зависимой протеинкиназы-5 (cdk5) и циклина D₃. Гены, кодирующие циклины являются протоонкоге-нами и, следовательно, с их экспрессией во многом связан процесс канцерогенеза. Например, ген, экспрессирующий циклин D_b имеет название PRAD/CCND/bcl-І, и локализуется в 11-й хромосоме [Frierson H.F. et al.,1996]. Комплекс cdk2 и циклина Е осуществляет переход клетки из G_r периода клеточного цикла в S-период (табл. 1).

Если циклины активизируют циклинзависимые протеинкиназы и стимулируют процесс пролиферации, то белки семейства pl61nk4A, главными представителями которых являются р21, р27 их ингибируют. Экспрессия данных белков осуществляется соответствующими генами, являющимися супрессорами опухолей. Белки данного семейства связывают цилинзависимые протеинкиназы стехиометрически, в результате чего

происходит остановка деление клетки в фазе Gi [Milde-Langosch et al.,1999].

Обнаружены также корреляции между экспрессией циклинов и других показателей пролиферации с онкогенами р53, Ьс12 и Ki-67, р21 [WongN.A. etal., 2003].

Таблица 1 Регуляция клеточного цикла

Определение иммунопозитивных к соответствующим циклинам ядер клеток является чрезвычайно значимым, так как по их количеству можно определить число клеток находящихся в той или иной фазе клеточного цикла, что является диагностически и прогностически значимым в плане определения степени воспалительных, атрофических изменений, а также канцерогенеза.

Важнейшими представителями циклинов является PCNA (пролифе-рирующий клеточный ядерный антиген) и Ki-67.

PCNA (пролиферирующий клеточный ядерный антиген) является одним из представителей циклинов. PCNA находится во всех клетках. По-другому PCNA называется скользящим скрепляющим протеином. Он относится к кольцевым полимеразам и играет существенную роль в репли-

кации генома. PCNA закручен вокруг ДНК. Данный белок скользит вдоль молекулы ДНК, участвуя в активации дельты - полимеразы ДНК, что дает возможность ускорить процессы репликации. Внутри молекулы PCNA находится приблизительно 35 аминокислот, позволяющих создать достаточное пространство для окружения ДНК. Ген PCNA имеет 6 эксонов и локализуется в 20 хромосоме. Транскрипцией PCNA стимулируется большое число ростковых факторов и, следовательно, синтез PCNA достигает максимума в S - фазе клеточного цикла, а минимума - у покоящихся клеток. О числе клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла, судят по количеству клеточных ядер, иммунопозитивных к PCNA. Поскольку S-фаза является необратимой, то по количеству находящихся в ней клеток, можно прогнозировать их число, которое перейдет в фазу G2, а затем в митоз. Доказанным фактом является то, что содержание PCNA в пролиферирующих клетках во многом определяет прогноз возникновения и развития опухолей [Martins А.С. et al., 2005; Aziz S.A. et al., 2005].

Ki-67 - ядерный белок, пролиферирующих клеток является димерной молекулой, имеющей тесную связь с 10-й хромосомой, с молекулярной массой 345 - 395 кДа [Коршунов А.Г., 1996]. Кі-67 не связан с гистоном и не участвует в репарации ДНК. Экспрессия КІ-67 наступает в момент пролиферации эпи-телиоцитов СОЖ. Минимум его определяется в фазе G] клеточного цикла и после митоза; максимум в середине клеточного цикла [Bruno S. et al., 1992]. Как правило, Ki-67 определяют на парафиновых срезах, обработанных в микроволновой печи [McCormick D. et al., 1993]. Экспрессия Ki-67 дает возможность идентифицировать клетки, находящиеся во всех фазах (G_l5S,G2 и М) клеточного цикла, кроме Go. [Taylor Т., Cote R.J.,1994; Ross J.S., 1996].

При заболеваниях ассоциированных с Н. pylori численность ядер клеток, иммунопозитивных к Ki-67, р53 и PCNA нарастает. Доказано, что у лиц с атрофическим - и атрофическим гастритом с кишечной метаплазией уровень р53 и Кі-67 в эпителиоцитах СОЖ достоверно выше по сравнению с

пациентами с хроническим хеликобактерном гастритом без атрофии [Jang T.G. et al., 2000; Guarner J. et al, 2005].

Апоптоз термин, предложенный в 1972 году J. Kerr, для обозначения запрограммированной гибели клеток, механизм которой принципиально отличается от некроза. Апоптоз индуцируется патологическими стимулами очень малой интенсивности [Аруин Л.И.,2000; Белушкина Н.Н., Северин С.Е.,2001; Хомерики С.Г.,2001]. Фазы апоптоза можно разделить на несколько различных фаз: фаза инициации апоптоза, проведение сигнала, активация каспаз, активация эндонуклеаз и специфическая деградация ДНК, в результате чего наступает гибель клетки [Белушкина Н.Н. с соавт., 1998].

Апоптоз уравновешивает новообразование клеток. В настоящее время установлено, что значительная часть клеток слизистых оболочек, в том числе и СОЖ, завершив свой жизненный цикл, погибает на месте путем апоптоза [Andersson R., Wang X., 1997]. Допускается, что именно апоптоз, а не отторжение - главный механизм удаления состарившихся клеток [Hall P. et al., 1994]. Путем программированной клеточной гибели происходит удаление клеток, выживание которых нежелательно для организма, например мутантных клеток или клеток, зараженных вирусом. В последнем случае этот процесс имеет важное биологическое значение, поскольку фрагментация ДНК предупреждает перенос генетического материала в другие клетки [Jacquelyn J. et al., 1998].

Таким образом, апоптоз является широко распространенным общебиологическим механизмом, ответственным за поддержание постоянства численности клеток, формообразование, выбраковку дефектных клеток [Evan G., Littlewood Т., 1998].

Апоптоз регулируется как внешними, так и внутренними факторами и выполняет функцию биологических часов клетки, отсчитывающих время ее жизни. Универсальными индукторами апоптоза, не зависящими от

типа клеток, служат различные химиотерапевтические агенты, ультрафиолетовое гамма-излучение [Kaneto Н. et al., 1995], нагревание [Varedi М. et al., 2001], гипоксия [Siren A.L. et al., 2001], нарушение осмотического равновесия, высокое содержание кальция и оксида азота [Yang Е., Korsmeyer S.J., 1996]. Апоптоз-индуцирующее свойство токсических и физических воздействий является дозозависимым, и при увеличении дозы, и экспозиции те же агенты могут индуцировать некроз [Magno G., Jo-ris I., 1995; Kaistura J. et al., 1996].

Регуляция апоптоза организмом представляет собой сложный процесс, зависящий от различных факторов. В зависимости от пусковых факторов и типа клеток существует множество сигнальных путей, индуцирующих апоптоз. Гибель клеток инициируется при взаимодействии ли-ганд с Fas (СБ95)-рецепторами, локализующимися на поверхности клеток [Аббасова С.Г с соавт., 1999; Long X. et al., 2002].

Продолжительность апоптоза зависит от факторов его индуцирующих и вида клеток. Продолжительность апоптоза, как правило, составляет от 12 до 24 часов. Морфологические изменения клеток наступают только на заключительном этапе (в последние 2-3 часа) апоптоза в фазу деградации ДНК [Colucci W.S.,1996]. В эту же фазу возникает и олигонуклеосо-мальная фрагментация ДНК, характерная для апоптоза [Leist М., Nicoters P. etal., 1997].

С общебиологической и эволюционной позиции апоптоз является достаточно консервативным процессом. Доказано, что в регуляции апоптоза активное участие принимают гормоны, причем один и тот же гормон может являться ингибитором апоптоза для клеток одной ткани и индуктором для других [Новиков B.C., 1996]. Так, стероидные гормоны, мелато-нин относятся к ингибиторам апоптоза, а глюкокортикоиды - к индукторам [Хавинсон В.Х. и соавт., 2000; Кветная Т.В. и соавт., 2005].

В настоящее время известно, что главная роль в запуске и развитии процесса апоптоза принадлежит протеазам [Patel Т. et al., 1996]. При апоптозе, в отличие от физиологического ответа клетки, действуют характерные только для апоптоза, специализированные необратимые реакции протеолиза, катализируемые специфическими протеазами - каспаза-ми, относящимися к классу цистеиновых протеаз [Dales J.P. et al., 2001]. В настоящее время известно 10 каспаз, образующих ферментативный каскад, подобно таковому свертывающей системы крови или системы комплемента и целиком обеспечивающий механизм апоптоза [Thornberry N.A, Lazebnik Y., 1998].

Каспазы находятся в клетке постоянно, в силу чего индукция апоптоза может происходить очень быстро. Каспазам 8 и 9 принадлежит важнейшая роль в запуске апоптоза, что происходит в результате их взаимодействия с рецепторами «смерти» (Fas-рецепторами) на поверхности клетки [Bratton S.B. et al., 2000; Schneider P. et al., 2000]. Известно, что часть каспаз выполняют активаторную функцию, а другая - эффектор-ную.

Существуют несколько путей активации каспаз. Один из них связан с взаимодействием индуктора апоптоза со специфическими рецепторами (например, активация каспазы-8 при взаимодействии Fas - лиганда с Fas-рецептором) [Tao Y. et al., 2005]. Рецепторы семейства TNF подразделяются на рецепторы с доменом смерти и без него. Из данного семейства рецепторов лучше всего изучены рецепторы Fas (которые еще называются Аро-1 или CD 95). При взаимодействии рецепторов Fas с соответствующими лигандами (FasL/CD95) происходит индуцирование лигандзависи-мого пути апоптоза [Ashkenazi A. et al., 1998]. Данные рецепторы могут индуцировать апоптоз при взаимодействии с различными ферментами (JNK-киназа, сфингомиелиназа) или оксидантном стрессе.

Другой путь индукции апоптоза связан с образованием белками семейства Всі-2 гетеродимеров, что приводит к активации каспазы-9. Третий путь активации каспаз связан с действием гранзимов В - сериновой протеазы. Такой путь активации каспаз актуален в случае индукции апоптоза цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые и секретируют эти ферменты, а также порообразующие белки перфорины, необходимые для запуска апоптоза [Faubion W.A., Gores G.J., 1999].

Начальные фазы апоптоза различаются в зависимости от типа клеток и от апоптоз-индуцирующего сигнала, а этап деградации ДНК - универсален для большинства клеток. Фаза деградации ДНК является переходом к необратимой стадии апоптоза - терминальной, находящейся под контролем белков семейства Всі-2 [Adams J.M. et al., 1999].

Белки семейства Bcl-2 достаточно многочисленны и экспрессируют-ся соответствующими генами. Они являются важнейшими регуляторами и могут выступать как индукторами апоптоза (Bcl-Xs, Вік, Bid, Вак, Bad, Вах), так и ингибиторами (Bcl-2, Bcl-XL, BOO, Al/Bfl-1, Bcl-w, Mcl-l) [Reed J.C., 1994; Gajewski T.F., Thompson C.B., 1996; Bella-my Ch., 1997]. Механизм регуляции апоптоза белками семейства Bcl-2 изучен недостаточно. Считается, что они способны к образованию многофункционального белкового комплекса. N. Zamzami et al. (1998) полагает, что такие ингибиторы апоптоза как Bcl-2 и Bcl-XL воздействуют на мембранный потенциал митохондриальной мембраны или активируют каспазу-9 посредством воздействия на Apaf-1. Считается, что молекулы Bcl-2 защищают «митохондриальные ворота» от проапоптозных молекул типа Вах [Gross A. et al., 1999]. Проапоптические белки семейства Bcl-2 вызывают апоптоз через высвобождение цитохрома С из митохондрий. Считается, что Вах вызывает проапоптозный эффект опосредовано, перемещаясь внутрь митохондрий и инициируя освобождение других проапоптических пептидов [Qin Z.N. et al., 2001].

Наиболее известным фактором ингибиции апоптоза является ген bcl-2 (B-cell lymphoma/leukemia 2), расположенный на внутриклеточных мембранах [Reed J.С, 1994; Muchmore S. W. et al., 1996]. Этот ген относят к онкогенам из-за его способности предотвращать апоптоз и, тем самым, сохранять клетки с мутациями. В нормальной слизистой экспрессии гена bcl-2 не происходит [Oltwai Z. et al., 2002]. Отмечается, что у 70% больных хроническим атрофическим гастритом и при кишечной метаплазии наблюдается экспрессия гена bcl-2 [Carbott et al., 2002]. Этот ген предохраняет стволовые клетки от апоптоза, вызванного дефицитом факторов роста в любую фазу клеточного цикла [Oltvai Z. et al., 1999] и приводит к извращению процесса физиологической регенерации, в результате чего стволовые клетки дифференцируются не в нормальный желудочный эпителий, а эпителий кишечного типа [Muller W. et al., 1998; Ikeda M. et al., 1998].

Bcl-2 - белок, содержащий 239 аминокислот экспрессирующейся соответствующим геном, локализующимся в хромосоме 18g21 и содержащим три экзона. При хроническом атрофическом гастрите и кишечной метаплазии его экспрессия наступает у 70% пациентов [Oltvai Z. et al., 1999]. Белок bcl-2 предотвращает гибель стволовых клеток путем апоптоза, вызванного дефицитом факторов роста [Jacobson M.D. et al., 1993] в любую фазу клеточного цикла [Oltvai Z. et al., 1999]. Подавление апоптоза bcl-2 достигается подавлением окислительного фофорилирования клеточных компонентов. Bcl-2 предотвращает перенос Са~⁺ через мембрану эндоплазматического ретикулума и отменяет сигнал для входа экстрацеллюлярного кальция. Концентрация цитозольного кальция сохраняется низкой, и запуск апоптоза не происходит.

Процесс апоптоза регулируется генами по антагонистическому принципу. Важнейшая роль в регуляции клеточного обновления и противоопухолевой защите организма принадлежит проапоптозному гену р53, что связано с его способностью предотвращать фиксацию генетических

повреждений [Long X. et al., 2002]. В условиях H. pylori-ассоциированной патологии ген р53 может подвергаться мутации, приобретая при этом противоположные свойства, и способен ингибировать апоптоз. В норме р53 задерживает клеточный цикл, что позволяет осуществить репарацию ДНК перед делением клетки или запустить апоптоз. В результате апопто-за происходит элиминация клеток с нерепарируемыми участками ДНК. Апоптоз во многом зависит от активности р53, однако часть клеток не отвечают апоптозом на активацию р53, так как наряду с р53 в этом процессе должны участвовать и другие проапоптозные молекулы (CD95 или Вах). Каким образом происходит их взаимодействие с р53 остается неизвестным. Очевидно, что для индукции апоптоза необходим bFGF в сочетании с повышенной экспрессией гена р53. Установлено, что р53 вызывает bFGF зависимый апоптоз. Однако его экспрессия не всегда сопровождается гибелью клетки. bFGF, индуцирует блокирование G і-фазы посредством увеличения р21 и уменьшая уровень циклина А. Белок bFGF воздействует и на другие протеины (pRbl). В пролиферирующих клетках эти протеины предотвращают перенос нерепарируемых поломок ДНК новым генерациям клеток и, тем самым, тормозят канцерогенез.

В настоящее время при Н. pylori-асссоциированных заболеваниях известны различные механизмы нарушения апоптоза, проявляющиеся либо его снижением или, наоборот - увеличением. При ингибиции процесса апоптоза возникают дисплазии, метаплазии и РЖ, а при стимуляции -возможно формирование длительно нерубцующихся язв. Следовательно, изучение механизмов регуляции апоптоза позволит прогнозировать течение Н. pylori-ассоциированных заболеваний и, в том числе, такого серьезного страдания как РЖ.

Во взрослом организме апоптоз распространен в различных типах тканей. Он встречается как в медленно пролиферирующей популяции клеток (гепатоциты, клетки эпителия коры надпочечников), так и в быст-

ро пролиферирующих клеточных популяциях. В первом случае он выполняет функцию гомеостатической регуляции оптимального объема ткани. Во втором случае роль апоптоза, в основном, связана с дифференциров-кой клеток [Ярилин А.А., 1996].

Наибольшее количество апоптозных тел обнаруживают при гастрите, ассоциированном с Helicobacter pylori с циркулирующими антителами. Считается, что они принимают участие в развитии атрофии СОЖ [Stein-inger Н. et al., 1998]. О том, что причина апоптоза - сами бактерии, а не вызванное ими воспаление, свидетельствует отсутствие корреляции апоптоза с выраженностью гастрита. Заслуживает внимание тот факт, что после эрадикации Helicobacter pylori апоптозный индекс снижается до нормальных показателей, несмотря на отсутствие различий в выраженности воспаления по сравнению с обнаруженным при исходной биопсии. Индуцировать апоптоз эпителия желудка могут непосредственно сами Helicobacter pylori, а также аммиак, который образуется при расщеплении мочевины уреазой [Igarashi, М. et al., 2001].

В настоящее время особую роль в регуляции клеточного гомеостаза отводят Ki-67, апоптозу, bcl-2 [Adams J.M.et al, 1999; Igarashi M. et al., 2001; Jang T.C. et al., 2000; Satoh K. et al., 2001; Нургалиева Б.К. и соавт., 2005]. Тем не менее, каким образом, изменяются их показатели при аденоматозных полипах, развившихся на фоне хеликобактерной инфекции остается не достаточно изученным. Так, в исследованиях J.T. Jung et al. (2005), показано, что развитие аденоматозных полипов в СОЖ происходит в несколько раз чаще у пациентов, страдающих хроническим гастритом с атрофией желез. В то же время, показатели пролиферативной активности (р53, Ki-67) и апоптоза достоверно не различаются у лиц, страдающих аденоматозными полипами, РЖ и кишечной метаплазией СОЖ. С другой стороны есть исследования, доказывающие, что соотношение индекса пролиферации к индексу апоптоза прогрессивно уменьшается по мере реализации «каскада Корреа». При этом наиболь-

шее значение индекса наблюдается при хроническом неатрофическом хелико-бактерном гастрите; наименьшее - при РЖ [Lee К.М. et al., 2003]. Есть исследования, доказывающие что экспрессия проапоптозных молекул (Вах) при дис-плазии СОЖ и кишечной метаплазии увеличивается, и, особенно, при их ассоциации с хеликобактерной инфекции [Liu H.F. et al., 2005]. Последнее положение противоречит устоявшимся известным канонам в сфере патогенеза заболеваний ЖКТ, ассоциированных с хеликобактерной инфекцией. Не известны прогностически значимые величины экспрессии Ki-67, Вс1-2, индекса апоптоза в развитии различной патологии ЖКТ, ассоциированной с Н. pylori. Между тем эти данные позволят оценить риск возникновения ат-рофических, диспластических, метапластических поражений в СОЖ, язвенных поражений, доброкачественных опухолей и РЖ. Полученные данные позволят разработать ранние диагностические и прогностические критерии указанных заболеваний, что станет основой их своевременной диагностики и лечения.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2Л.Общая характеристика обследованных пациентов

Набор материала производился на базе клиник Самарского военно-медицинского института в период с 2004 по 2007 год. За данный период времени обследовано 104 больных с заболеваниями желудка, ассоциированными с Н. pylori. Больные были разделены на 4 группы: 1-я - (30 - человек) с ЯБЖ, 2-я - (30 - человек) с ХАГ, 3-я - (20 - человек) с ХАГ в сочетании с аденоматоз-ными полипами, 4-я - (24 - человека) с РЖ.

Классификационные критерии хронического гастрита и язвенной болезни базировались на рекомендациях В.Х. Василенко и соавт. (1987), Сиднейской систематизации 1990 года с дополнениями 1994 года в Лос-Анджелесе. Для определения степени активности гастритических изменений слизистой оболочки желудка (СОЖ) использовались классификационные критерии, предложенные М. Stolte et al. (1989). Для определения характера инфильтративных изменений в СОЖ пользовались рекомендациями Л.И. Аруина и соавт. (1998). Для оценки атрофических изменений использовалась Сиднейская система (1994) с дополнениями М. Dixon et al. (1996). Для оценки стадии РЖ применялась Международная классификация рака по стадиям (ВОЗ, 1965). Для эндоскопической характеристики РЖ применялась классификация R. Borman и R. Shindler (1946). Для исследования были подобраны пациенты с П-Ш стадиями РЖ дистального типа кишечного строения, инфицированные Н. pylori, так как только данная локализация рака связывается с Н. pylori.

Группу сравнения составили 12 практически здоровых человека. Больные и здоровые обследованы по единой программе, включающей клинические, эндоскопические, морфологические и иммуногистохимические методы исследо-

вания. Все больные наблюдались в динамике: до лечения и спустя 2 месяца после проведения эрадикационной терапии.

Всем обследованным выполнялась внутрижелудочная рН-метрия, эзофа-гогастродуоденоскопия аппаратом фирмы «Olympus» с прицельной биопсией слизистой оболочки из антрального и фундального отделов желудка. Выявленные аденоматозные полипы были полностью удалены с помощью петельной биопсии и гистологически изучены. Диагноз РЖ подтверждался при помощи пункционной или интраоперационной биопсии и последующего гистологического исследования биопсийного материала. С целью установления стадии онкологического процесса больным с РЖ проводилось УЗИ органов брюшной полости, при необходимости выполнялась компьютерная томография.

Подборка обследованных больных и практически здоровых была осуществлена на основе репрезентативности выборки. Всего обследовано 98 (84,5%) мужчин и 18 (15,5%) женщин. Возраст обследованных колебался от 18 до 86 лет. Средний возраст пациентов составил 40,83±7,47 года (табл. 2). Достоверной разницы в возрасте между больными различных групп не наблюдалось.

Таблица 2

Распределение пациентов по возрасту, полу и патологии

Продолжение таблицы 2

Тип проведенного нами исследования можно классифицировать по следующим параметрам: по цели исследования - проверяющий гипотезу (относительно более высокая научная ценность исследования); по временным параметрам - динамический (продольное) - многократное обследование участников, или объектов исследования; по отсутствию или наличию вмешательства - пассивный (наблюдение за естественным течением заболевания); по соотношению времени сбора данных и формирования выборок - проспективный (изучаемые группы формируют до сбора данных).

2.2. Методы исследования 2.2.1. Внутрижелудочная рН-метрия

Определение внутрижелудочной рН осуществлялось с использованием ацидогастрометра и двух электродных зондов по унифицированной методике, описанной Е.Ю. Динаром в 1968 году в методических рекомендациях (Рига, 1968) и Ю.А. Лея (1987).

У обследованного нами контингента пациентов определялась базальная рН в антральном отделе желудка до проведения лечения и спустя два месяца после проведения. У больных, прооперированных по поводу РЖ и у практически здоровых лиц динамическое исследование рН не проводилось.

2.2.2. Гистиобактериоскопия

Гистиобактериоскопия проводилась с помощью изучения мазков отпечатков со слизистой оболочки фундального и антрального отделов желудка, ок-

рашенных по Романовскому-Гимзе, а у больных прооперированных по поводу РЖ исследовались мазки отпечатки культи желудка. Оценка степени обсеме-ненности слизистой Н. pylori осуществлялась по классификационным критериям, предложенным Л.И. Аруином (1993). Для этого число микробных тел Н. pylori подсчитывали в 10 полях зрения. Выделяли 3 степени обсемененности: I (легкая) - до 20 микробных тел в поле зрения, II (средняя степень) - от 20 до 50 микробных тел, III (тяжелая степень) - более 50 микробных тел.

В своем исследовании во всех группах обследованных больных на основании данных внутрижелудочной рН-метрии и гистиобактериоскопии использовалась трехкомпонентная схема эрадикационной терапии с обязательным включением в нее блокаторов протонной помпы. Антихеликобактерная терапия проводилась у пациентов всех групп по традиционной схеме, включающей бло-катор протонной помпы (омепразол по 20 мг 2 раза в день) и 2 антибактериальных препарата (кларитромицин по 500 мг 2 р/сут и амоксициллин по 1000мг 2 р/сут), в течение 10 дней.

2.2.3. Морфологические исследования слизистой оболочки желудка

Материал для цитологического и гистологического исследования забирался из антрального и фундального отделов желудка. Биопсийный материал фиксировался в 10% забуференном нейтральном формалине по Лилли в течение 24 часов с последующей промывкой в проточной воде в течение суток. После фиксации материал обезвоживался и заливался в парафин. Для обзорного гистологического изучения депарафинированные серийные срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином-эозином.

2.2.4. Специальные методы морфологического исследования слизистой оболочки желудка

Общее гистоморфологическое исследование биоптатов и иммуногисто-химическое исследование эпителиоцитов СОЖ проводилось на базе Санкт-

Петербургского института биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения РАМН при научном консультировании д.м.н. профессора И.М. Кветно-го.

Парафиновые срезы толщиной 4-6 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина (Sigma).

Для выявления апоптозных ядер исследуемый материал импрегнировали поМозеру (1995).

Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием мо-ноклональных мышиных антител к маркеру пролиферирующих клеток - Ki-67 (1:100, Novocastra, USA) и к антиапоптозному белку Bcl-2 (1:100, Novocastra, USA). В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диа-минобензидином (все реагенты от Novocastra). Для проведения иммуногисто-химической реакции использовали стандартный одноэтапный протокол.

1. Стекла со срезами помещали в термостат (+56С) на 30 мин.

2. Для депарафинизации и дегидратации стекла проводили через батарею со следующей сменной последовательностью: ксилол, ксилол, спирт 100%, спирт 96%, спирт 96%, спирт 75% (по 3 мин в каждом растворе).

3. Промывка в дистиллированной воде 3 мин.

4. Блокада эндогенной пероксидазы: контейнер со стеклами помещали в 3% водный раствор перекиси на 10 мин.

5. Промывка в 2 сменах дистиллированной воды по 5 мин.

6. Промывка в 2 сменах трис-ЫаС1-буфера рН 7,6 по 5 мин.

7. Инкубация с нормальной неиммунной сывороткой в течение 30 мин при комнатной температуре. Наносили 50-100 мкл нормальной блокирующей сыворотки и помещали во влажную камеру.

8. Инкубация с первыми (специфичными) антителами в течение 1 ч. в
термостате при +37С. Со стекол стряхивали нормальную сыворотку и
наносили 50-100 мкл. первых (специфичных) антител. Стекла помеща
ли во влажную камеру и инкубировали 1 ч в термостате.

9. Промывка в 2 сменах TpHC-NaCl-буфера рН 7,6 по 5 мин.

10. Инкубация со вторыми биотинилированными антителами в течение 30 мин при комнатной температуре.

11. Промывка в 2 сменах TpHC-NaCl-буфера рН 7,6 по 5 мин.

12. Инкубация с ABC-kit 30 мин при комнатной температуре.

13. Промывка в 2 сменах TpHC-NaCl-буфера рН 7,6 по 5 мин.

14. Выявление пероксидазы хрена диаминобензидином (раствор готовили по инструкции прилагающейся к набору). Проявление реакции контролировали под микроскопом.

15. Промывка в 2 сменах дистиллированной воды по 5 мин.

16. Промывка водой.

17. Дегидратация - 15 мин в батарее со следующей последовательностью: . спирт 96%, спирт 96%, карбоксилол, ксилол, ксилол. В каждом растворе по 3 мин.

18. Заключение в синтетическую среду (Novomount Permanent Slide, No-
vocastra).

2.2.5. Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений

Морфометрические исследования проводились с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений (Nikon).

Морфологические изображения, поступающие через оптическую систему микроскопа Nikon Eclipse 400 (увеличение х 320: объектив 40, окуляр 10, фильтр 0,8) регистрировались цифровой цветной видеокамерой Nikon

DXM1200, вмонтированной в тубус микроскопа и передавались в компьютер Pentium-4.

Количество Ki-67 и Вс1-2 - иммунопозитивных ядер клеток автоматически подсчитывалось в 10 рандомизированных полях зрения. При указанном увели-чении и цифровые данные пересчитывались на 1 мм с помощью пакета прикладных морфометрических программ «Видеотест-Морфология 4.0».

Гибель клеток в форме апоптоза определяли по индексу апоптоза (1_Апт) по формуле: Ідпт (%)⁼ N (число апоптозных ядер, окрашенных по методу Мозера)ЛЧ (общее число ядер) х 100.

Введен показатель Ик^/Ілль характеризующий состояние клеточного гомеостаза эпителиоцитов СОЖ.

2.2.6. Статистическая обработка полученных результатов исследования

Математическая обработка результатов исследования проводилась с помощью статистического пакета программ "EXCEL" на персональном компьютере IBM "Pentium" - 4.

При обработке материала определялись средние значения, ошибка, доверительный интервал. При сравнении средних показателей между различными группами использовали t - критерий Стьюдента, Между параметрами оценивались корреляционные связи.

Обработка полученных данных производилась в программе Excel Microsoft Office операционной системы Windows ХР.

В работе учитывались коэффициенты регрессии диагностической модели и значимости факторов по критерию Стьюдента.

Похожие диссертации на Роль маркеров клеточного обновления (Bcl-2, Ki-67) и апоптоза эпителиоцитов в возникновении и прогрессировании заболеваний желудка, ассоциированных с Helicobacter pylori

Взаимосвязь между пролиферативной активностью клеток слизистой оболочки желудка и степенью обсеменнности Helicobacter Pylori у больных с хроническими заболеваниями желудкаГалеева Зарина Муанировна

Взаимосвязь между пролиферативной активностью клеток слизистой оболочки желудка и степенью обсемененности Helicobacter Pylori у больных с хроническими заболеваниями желудкаГалеева Зарина Мунировна

Клинико-диагностическое значение фактора патогенности CAGA гена Helicobacter Pylori при заболеваниях гастродуоденальной зоны, включая болезнь резецированного желудкаКамнева Наталия Вячеславовна

Состояние слизеобразующей функции желудка, как фактора защиты у больных язвенной болезнью желудка, ассоциированной с Helicobacter pyloriСамойлова Анна Владимировна

Язвенная болезнь желудка, ассоциированная с Helicobacter pylori при наличии кишечной метаплазии: клинико-иммунологические особенности теченияИарасова Екатерина Сергеевна

Клинико-иммунологические особенности течения Helicobacter pylori - ассоциированной язвенной болезни желудка с кишечной метаплазиейКоломоец Ариадна Николаевна

Оптимизация методов диагностики и лечения больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori (региональные особенности)Абдулхаков Рустам Аббасович

Применение озонотерапии для лечения эрозивно-язвенных поражений желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированных с Helicobacter pyloriПершина Наталья Николаевна

Клинико-иммунологические особенности язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori, у мужчинСмагина, Наталья Викторовна

Применение ингибиторов протонной помпы в лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pyloriЩекина Марина Игоревна